邱冬豪

[摘要]?目的?探究微小RNA-138（microRNA-138，miR-138）調(diào)控中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白（neutrophil?gelatinase-associated?lipocalin，NGAL）對缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）誘導(dǎo)人腎小管上皮（HK-2）細胞損傷的影響。方法?HK-2細胞構(gòu)建I/R模型，分別轉(zhuǎn)染miR-138?模擬物、miR-138?抑制劑、NGAL、NGAL?+?miR-138?模擬質(zhì)粒，qRT-PCR測定不同細胞miR-138或NGAL?mRNA表達鑒定轉(zhuǎn)染結(jié)果，細胞活力檢測（cell?counting?kit-8，CCK-8）法和流式細胞術(shù)測定細胞活性和凋亡。ELISA、Western?blot法分別測定miR-138模擬物、miR-138抑制劑對I/R細胞白細胞介素（interleukin，IL）-6、IL-1β、腫瘤壞死因子-α（tumor?necrosis?factor-α，TNF-α）水平，以及Toll樣受體4（toll?like?receptor?4，TLR4）、核因子κB（nuclear?factor?kappa-B，NF-κB）、NF-κB抑制蛋白（inhibitor-NF-κB，IκBα）、磷酸IκBα（p-IκBα）、NGAL蛋白表達的影響。結(jié)果?I/R細胞miR-138?mRNA表達、細胞活力降低，凋亡增加（P<0.01）。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功，miR-138模擬物促進IR細胞活力，降低凋亡和NGAL?mRNA表達（P<0.01）；miR-138?抑制劑、NGAL?模擬降低IR細胞活力，增加凋亡和NGAL?mRNA表達（P<0.01）；NGAL?模擬對IR細胞的損傷作用可被miR-138?模擬逆轉(zhuǎn)。miR-138?抑制劑可增加I/R細胞IL-6、IL-1β、TNF-α水平和凋亡，上調(diào)TLR4、NF-κB、p-IκBα、NGAL蛋白表達，下調(diào)IκBα蛋白表達（P<0.05）；miR-138模擬物可降低I/R細胞IL-6、IL-1β、TNF-α水平和凋亡，下調(diào)TLR4、NF-κB、p-IκBα、NGAL蛋白表達，上調(diào)IκBα蛋白表達（P<0.05）。結(jié)論?miR-138通過調(diào)節(jié)NGAL和TLR4/NF-κB途徑降低細胞凋亡和炎癥因子水平，對I/R誘導(dǎo)的HK-2細胞發(fā)揮保護作用。

[關(guān)鍵詞]?人腎小管上皮細胞；缺血/再灌注；中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白；TLR4/NF-κB通路

[中圖分類號]?R692.6??????[文獻標識碼]?A????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2024.11.012

Effect?of?microRNA-138?on?the?ischemia/reperfusion?of?human?renal?tubular?epithelial?cells

QIU?Donghao

Department?of?Nephrology，?Affiliated?Hangzhou?First?Peoples?Hospital，?Zhejiang?University?School?of?Medicine，?Hangzhou?310008，?Zhejiang，?China

[Abstract]?Objective?To?explore?the?effect?of?microRNA-138?（miR-138）?on?injury?of?ischemia/reperfusion?（I/R）?induced?human?renal?tubular?epithelium?（HK-2）?cells?through?neutrophil?gelatinase-associated?lipocalin?（NGAL）.?Methods?HK-2?cells?were?used?to?construct?I/R?model?cells，?and?transfected?with?miR-138?mimic，?miR-138?inhibitor，?NGAL，?NGAL?+?miR-138?mimic?plasmids，?respectively.?qRT-PCR?determined?the?expression?of?miR-138?or?NGAL?mRNA?in?different?cells?to?identify?the?transfection?results.?Cell?counting?kit-8?（CCK-8）?method?and?flow?cytometry?were?used?to?detected?the?activities?and?apoptosis?of?cells.?ELISA?and?western?blot?were?used?to?determine?the?effects?of?miR-138?mimic?or?miR-138?inhibitor?on?levels?of?interleukin?（IL）-6，?IL-1β，?tumor?necrosis?factor?（TNF-α）?and?protein?expression?of?toll?like?receptor?4?（TLR4），?nuclear?factor?kappa-B?（NF-κB），?inhibitor?of?NF-?κB?（IκBα），?pho-IκBα?（p-IκBα），?NGAL?of?cells.?Results?miR-138?mRNA?expression?and?cell?activity?were?decreased，?while?apoptosis?increased?in?I/R?cells?（P<0.01）.?Plasmid?transfected?well，?miR-138?mimic?increased?activity?while?decreased?apoptosis?and?NGAL?mRNA?expression?of?I/R?cell.?miR-138?inhibitor?or?NGAL?mimic?inhibited?activity?and?increased?apoptosis?and?NGAL?mRNA?expression?of?I/R?cell.?The?negative?effects?of?NGAL?mimic?on?I/R?cell?were?reversed?by?miR-138?mimic.?miR-138?inhibitor?increased?levels?of?IL-6，?IL-1β，?TNF-α?of?I/R?cell，?and?increased?TLR4，?NF-κB，?p-IκBα，?NGAL?protein?expression?and?decreased?IκBα?protein?expression?（P<0.05）.?While?miR-138?mimic?decreased?levels?of?IL-6，?IL-1β，?TNF-α?of?I/R?cell，?and?decreased?TLR4，?NF-κB，?p-IκBα，?NGAL?protein?expression?and?increased?IκBα?protein?expression?（P<0.05）.?Conclusion?miR-138?reduced?apoptosis?and?inflammation?factor?levels?to?play?a?protective?role?on?I/R?induced?HK-2?cells?may?through?regulating?NGAL?and?TLR4/NF-?κB?pathway.

[Key?words]?Human?renal?tubular?epithelial?cells;?Ischemia/reperfusion;?Neutrophil?gelatinase?related?lipid?transporter;?TLR4/NF-κ?B?pathway

腎臟缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）在臨床中常見，多出現(xiàn)于腎臟移植、心臟外科手術(shù)等過程中，是造成急性腎損傷（acute?kidney?injury，AKI）最常見的原因之一[1-2]。腎I/R損傷發(fā)生的病理機制復(fù)雜，涉及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、活性氧聚集、凋亡、炎癥等一系列病理生理過程，導(dǎo)致腎小管上皮細胞凋亡引起腎功能損傷[3]。

微小RNA（microRNA，miR）是生物體內(nèi)高度保守的非編碼小分子RNA，可作為腎臟I/R損傷診斷與鑒別診斷的生物標志物[2]。中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白（neutrophil?gelatinase-associated?lipocalin，NGAL）廣泛存在于各種細胞類型中，可用于臨床早期腎損害風(fēng)險預(yù)測[4-6]。NGAL在糖尿病腎病組織中顯著高表達，與Toll樣受體4（toll?like?receptor?4，TLR4）/核因子κB（nuclear?factor?kappa-B，NF-κB）通路共同參與促進腎組織炎癥和纖維化[7-9]。miR138可抑制NGAL發(fā)揮抗腫瘤作用，但其兩者在腎I/R損傷中作用還未明確。因此，本研究初步探究miR-138/NGAL在腎臟I/R損傷中的表達及可能作用。

1??材料與方法

1.1??材料

1.1.1??細胞和試劑??HK-2細胞（賽百慷生物技術(shù)公司，iCell-h096）；HK-2專用培養(yǎng)基（賽百慷生物技術(shù)公司，iCell-h096-001b）；CCK8檢測試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）；小鼠腫瘤壞死因子α（tumor?necrosis?factor-α，TNF-α）、白細胞介素（interleukin，IL）-6、IL-1β試劑盒（睿信生物科技公司）；TLR4、NF-κB、NF-κB抑制蛋白（IκBα）、磷酸IκBα（p-IκBα）、NGAL抗體（美國Affinity抗體公司）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-?phosphate?dehydrogenase，GAPDH）抗體（美國Proteintech公司）；流式凋亡試劑盒（美國BD公司）。

1.1.2??儀器??BB150細胞培養(yǎng)箱、Micro17R低溫高速離心機、Nanodrop?one?mRNA定量儀（美國賽默飛公司）；AE2000光學(xué)顯微鏡（德國Motic公司）；CMaxPlus酶標儀（美國MD公司）；Ts2-FC倒置顯微鏡（日本尼康公司）；Mastercycler普通PCR儀（德國Eppendorf公司），實時熒光定量PCR儀（美國羅氏公司），NovoCyte流式細胞儀（美國安捷倫公司），610020-9Q化學(xué)發(fā)光儀（中國勤翔公司）。

1.2??方法

1.2.1??體外I/R模型制備方法??HK-2細胞于5%?CO2、37℃的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞繼續(xù)培養(yǎng)，至細胞融合生長至80%，平衡鹽溶液替換培養(yǎng)基。80?mol/L抗霉素A和10mmol/L?2-脫氧-d-葡萄糖共孵育1h，以誘導(dǎo)HK-2細胞缺血性損傷。完全生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)誘導(dǎo)后細胞實現(xiàn)I/R模型細胞。

1.2.2??細胞轉(zhuǎn)染??采用脂質(zhì)體3000試劑轉(zhuǎn)染miR-138?模擬/抑制劑質(zhì)粒、NGAL過表達質(zhì)粒（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司構(gòu)建合成）。取I/R模型細胞，按照說明書將miR-138?模擬物及對照（NC）、miR-138?抑制劑質(zhì)粒及對照、NGAL、NGAL?+?miR-138?模擬質(zhì)粒轉(zhuǎn)染I/R細胞。根據(jù)轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒，將細胞分為組1：對照組、I/R組、I/R?+?miR-138?模擬組、I/R?+?miR-138?抑制劑組；組2：I/R組、I/R?+?miR-138?模擬物組、NGAL?+?I/R組、NGAL?+?I/R?+?miR-138?模擬物組。

1.2.3??qPCR測定miR-138、NGAL?mRNA表達??Trizol試劑提取2組細胞的RNA。反轉(zhuǎn)錄為互補DNA（complementary?DNA，cDNA），PCR進行DNA擴增。

引物序列：人NGAL上游：5-CCACCTCAGACCT?GATCCCA-3，下游：5-CCCCTGGAATTGGTTGT?CCTG-3；人miR-138上游：5-TCCGAGCCTGACTA?AGTGTTGTGGTCGA-3，下游：5-GTGCAGGGTCC?GAGGT-3；人U6上游：5-CTCGCTTCGGCAGCAC?ATA-3，下游：5-GTCGAGGGTCCGAGCT-3；人GAPDH上游：5-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-?3，下游：5-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3。U6、GAPDH分別作為miR-138、NGAL內(nèi)參，2-△△CT法對結(jié)果進行相對定量分析。

1.3??檢測方法

制備兩組細胞的細胞懸液，接種至96孔板培養(yǎng)。加入10μl?CCK-8試劑，孵育2h。酶標儀測定450nm處的吸光度，計算細胞細胞活性。

將兩組細胞接種于6孔板。預(yù)冷PBS清洗，調(diào)整細胞濃度至1×106個/ml。加入500μl結(jié)合緩沖液，離心棄上清，再加入100μl結(jié)合緩沖液混勻后，分別加入5μl?Annexin?V-FITC與10μl?碘化丙啶（propidium?iodide，PI），充分混勻；室溫避光反應(yīng)15min。最后加入結(jié)合緩沖液400μl，1h內(nèi)流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

收集組1細胞，離心，收集上清液，按照ELISA試劑盒說明書，測定IL-6、IL-1β、TNF-α含量。收集組1細胞，清洗，離心，裂解液處理細胞，制備蛋白樣本。BCA法測定總蛋白含量。電泳，轉(zhuǎn)膜。5?%脫脂奶粉孵育，清洗3遍。稀釋后的TLR4、NF-κB、IκBα、p-IκBα、NGAL、GAPDH抗體孵育過夜。TBST清洗，孵育對應(yīng)二抗。顯影蛋白條帶，GAPDH做內(nèi)參，計算各蛋白的相對表達量。

1.4??統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS?16.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行處理分析。計量資料以均值±標準差（）表示，采用One-way-ANOVA單因素方差分析，進一步組間兩兩比較采用Tukey檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2??結(jié)果

2.1??miR-138轉(zhuǎn)染對I/R細胞活力的影響

與對照組比較，I/R組細胞miR-138?mRNA表達量以及細胞活力顯著降低（P<0.01）。與I/R組相比，I/R+miR-138?模擬物細胞mRNA表達量、細胞活力顯著升高（P<0.01），I/R+miR-138?抑制劑細胞miR-138?mRNA表達量、細胞活力則顯著降低（P<0.01），而I/R+miR-138?模擬物-NC與I/R+miR-138抑制劑-NC細胞miR-138?mRNA表達量、活力差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見圖1。

2.2??miR-138、NGAL轉(zhuǎn)染對I/R細胞活力的影響

與I/R組相比，I/R?+?miR-138?模擬物細胞NGAL?mRNA表達量降低、細胞活力升高（P<0.01），?NGAL?+?I/R細胞NGAL?mRNA表達量升高、細胞活力降低（P<0.01）。與NGAL+I/R細胞相比，NGAL?+?I/R?+?miR-138模擬細胞NGAL?mRNA表達下降、活力升高（P<0.01），見圖2。

2.3??miR-138、NGAL轉(zhuǎn)染對I/R細胞凋亡的影響

與對照組比較，I/R組細胞凋亡增加（P<0.01）。與I/R組比較，I/R?+?miR-138?模擬組細胞凋亡降低（P<0.01），I/R?+?miR-138?抑制劑組細胞凋亡增加（P<0.01）。與I/R組比較，NGAL?+?I/R細胞凋亡增加（P<0.01）；與NGAL?+?I/R細胞相比，NGAL?+?I/R?+?miR-138?模擬細胞凋亡下降（P<0.01），見圖3。

2.4??miR-138對I/R細胞IL-6、IL-1β、TNF-α水平的影響

與對照組比較，I/R組細胞IL-6、IL-1β、TNF-α水平升高（P<0.01）；與I/R組比較，I/R+miR-138模擬組細胞IL-6、IL-1β、TNF-α水平降低（P<0.01），而I/R?+?miR-138?抑制劑組細胞IL-6、IL-1β、TNF-α水平升高（P<0.01），見圖4。

2.5??miR-138對I/R細胞蛋白表達的影響

與對照組比較，I/R組細胞TLR4、NF-κB、p-IκBα、NGAL蛋白表達增加，IκBα蛋白表達降低（P<0.01）。與I/R細胞比較，I/R?+?miR-138?模擬物細胞TLR4、NF-κB、p-IκBα、NGAL蛋白表達降低（P<0.05），IκBα蛋白表達增加（P<0.01）；I/R?+?miR-138?抑制劑細胞TLR4、NF-κB、p-IκBα、NGAL蛋白表達增加（P<0.05），IκBα蛋白表達降低（P<0.01），見圖5。

3??討論

腎組織近曲小管對缺血最為敏感[10]。腎缺血后，內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞迅速受損；而當(dāng)血流恢復(fù)/再灌注時，血流增加，白細胞激活、聚積后通過炎癥反應(yīng)和細胞毒性反應(yīng)可增加腎組織細胞損傷[11-13]。而miRs可通過抑制細胞自噬、凋亡，減輕腎組織損傷，發(fā)揮I/R后腎保護作用[14-15]。本研究中，所構(gòu)建的I/R細胞活力下降、凋亡增加、miR-138表達降低；miR-138抑制劑轉(zhuǎn)染加重了上述細胞的I/R表現(xiàn)；而miR-138模擬轉(zhuǎn)染可促進I/R細胞活力、減少凋亡，提示miR-138表達對I/R細胞具有保護作用。NGAL是脂質(zhì)運載蛋白超家族的成員之一，腎小管上皮細胞缺血后出現(xiàn)細胞內(nèi)水腫及細胞核凋亡，釋放NGAL成為其主要來源[16]。在I/R誘導(dǎo)的急性腎損傷小鼠腎組織內(nèi)，NGAL蛋白表達增加[17]。本研究中I/R細胞NGAL?mRNA及蛋白表達顯著升高，NGAL?模擬轉(zhuǎn)染增加了I/R細胞的凋亡，而miR-138?模擬可逆轉(zhuǎn)NGAL?模擬對I/R細胞的促凋亡作用，推測miR-138可能靶向負調(diào)控NGAL，抑制腎I/R細胞的凋亡。

TLR4/NF-κB參與腎臟I/R炎癥反應(yīng)過程，NF-κB作為關(guān)鍵分子可誘導(dǎo)炎性TNF-α、IL-6、IL-1表達，改變腎小球基底膜通透性，加重組織纖維化和炎癥反應(yīng)[18-19]。κB激酶抑制劑IκBα可通過與NF-κB結(jié)合，阻止NF-κB發(fā)揮轉(zhuǎn)錄功能，緩解組織炎癥損傷[20-21]。本研究中I/R細胞TLR4/NF-κB通路、p-IκBα表達增加，IL-6、IL-1β、TNF-α水平升高；miR-138抑制劑加重了I/R細胞上述表現(xiàn)；而miR-138模擬物能夠促進I/R細胞IκBα表達，抑制TLR4/NF-κB通路表達，降低IL-6、IL-1β、TNF-α水平，因此推測miR-138可能抑制TLR4/NF-κB信號減輕I/R細胞的炎癥損傷。

綜上所述，miR-138可減少I/R誘導(dǎo)的人腎小管上皮細胞炎癥、凋亡，其作用可能通過調(diào)控NGAL、TLR4/NF-κB通路實現(xiàn)。miR-138與NGAL兩者聯(lián)合對腎I/R的診斷預(yù)后及治療作用還需臨床進一步明確。

利益沖突：作者聲明不存在利益沖突。

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（收稿日期：2023–08–02）

（修回日期：2024–02–19）