孫惠霖 劉建兵 李敏 鄭建麗 吳靜

[摘要]?目的?分析不同精液質(zhì)量不育癥患者外周血染色體核型異常的類(lèi)型和發(fā)生率。方法?選取2018年1月至2021年12月來(lái)筆者醫(yī)院行外周血染色體G顯帶核型分析及精液分析的292例男性不育癥患者，根據(jù)精液分析結(jié)果分為精液質(zhì)量異常組和正常對(duì)照組，對(duì)檢出的異常核型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。結(jié)果?精液質(zhì)量異常組檢出異常染色體核型20例（18.87%），正常對(duì)照組檢出異常染色體核型9例（4.84%），比較兩組外周血染色體核型異常率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。無(wú)精子癥組患者染色體異常檢出率為50%，性染色體異常為該組主要異常類(lèi)型。結(jié)論?對(duì)不育癥患者行外周血染色體核型分析可有效分析病因，對(duì)輔助生殖、出生缺陷一級(jí)預(yù)防具有重要的臨床意義。

[關(guān)鍵詞]?不育癥；精液質(zhì)量；染色體核型分析；性染色體

[中圖分類(lèi)號(hào)]?Q343.2??????[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]?A??????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2024.11.009

Chromosomal?karyotype?analysis?of?peripheral?blood?in?infertility?patients?with?different?semen?quality

SUN?Huilin，?LIU?Jianbing，?LI?Min，?ZHENG?Jianli，?WU?Jing

Medical?Genetic?Center，?the?Affiliated?Yancheng?Maternity?&?Child?Health?Hospital?of?Yangzhou?University，?Yancheng?224001，?Jiangsu，?China

[Abstract]?Objective?To?analyze?the?type?and?incidence?of?abnormal?chromosome?karyotype?in?peripheral?blood?of?infertile?patients?with?different?semen?quality.?Methods?Selectet?292?infertility?patients?who?came?to?our?hospital?from?January?2018?to?December?2021?for?G-banding?karyotyping?and?semen?analysis.?According?to?the?semen?analysis?results，?the?patients?were?divided?into?abnormal?semen?quality?group?and?normal?control?group.?We?made?statistics?and?analysis?on?the?abnormal?karyotypes.?Results?In?the?group?with?abnormal?semen?quality，20?cases?（18.87%）?of?abnormal?karyotypes?were?found.?In?the?normal?control?group，?9?cases?（4.84%）?had?abnormal?karyotypes?were?found.?The?comparison?of?the?abnormal?rates?of?peripheral?blood?chromosome?karyotypes?between?the?two?groups?showed?statistical?significance?（P<0.05）.?The?detection?rate?of?chromosomal?abnormalities?in?patients?with?Azoospermia?was?50%，?and?sex?chromosome?abnormalities?were?the?main?types?of?abnormalities?in?this?group.?Conclusion?Karyotype?analysis?of?infertile?patients?can?effectively?analyze?the?causes?of?infertility，?and?has?important?clinical?significance?for?assisted?reproduction?and?primary?prevention?of?birth?defects.

[Key?words]?Male?infertile;Semen?analysis;Karyotype?analysis;Sex?chromosomes

男性不育癥是一種復(fù)雜的、受多因素影響的病癥，精液質(zhì)量對(duì)男性不育癥的診斷及嚴(yán)重程度的確定具有重要意義。遺傳學(xué)因素是目前已知的影響精液質(zhì)量的重要因素之一，約15%的男性不育癥患者是因遺傳學(xué)因素異常導(dǎo)致，主要包括染色體核型異常、Y染色體微缺失和囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子基因突變等[1]。

染色體是細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)的主要載體，染色體數(shù)目異常及結(jié)構(gòu)異常是導(dǎo)致男性不育的重要遺傳因素。不育癥患者染色體核型異常發(fā)生率明顯高于正常生育人群，精液質(zhì)量不同的不育癥患者染色體核型異常類(lèi)型和發(fā)生率各不相同[2-3]。輔助生殖技術(shù)的發(fā)展，使得精液質(zhì)量異常的男性不育癥患者僅需少量活精就可完成受精，但遺傳學(xué)因素在胚胎發(fā)育、后代的生長(zhǎng)發(fā)育及生育過(guò)程中仍然具有影響。

本研究主要對(duì)不同精液質(zhì)量的不育癥患者的外周血染色體核型異常發(fā)生率及類(lèi)型進(jìn)行分析探討，為男性不育癥患者病因分析及輔助生殖的遺傳咨詢(xún)、治療提供理論依據(jù)。

1??對(duì)象與方法

1.1??研究對(duì)象

選取2017年1月至2021年12月來(lái)筆者醫(yī)院行外周血染色體常規(guī)G顯帶核型分析及精液分析的292例男性不育癥患者。根據(jù)患者精液分析結(jié)果將其分為精液質(zhì)量異常組（少精子癥、弱精子癥、少弱精子癥、無(wú)精子癥）106例和正常對(duì)照組186例。本研究經(jīng)鹽城市婦幼保健院倫理委員會(huì)審核通過(guò)（倫理審批號(hào)：2023-LW）。

1.2??方法

1.2.1??染色體核型分析??采集患者外周血1.5ml，及時(shí)在無(wú)菌條件下用注射器將0.5ml外周血接種至外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基中，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)72h。加入2滴20μg/ml的秋水仙素混勻后放回培養(yǎng)箱中4h后去除上清液收獲細(xì)胞。加入8ml濃度為0.075moL/L?的氯化鉀低滲液充分吹打混勻后放置于37℃水浴箱中溫浴30min。加入1ml固定液（甲醇∶冰醋酸＝3∶1）進(jìn)行預(yù)固定，吹打混勻后離心去除上清液，加入8ml固定液進(jìn)行固定，吹打混勻后放置于37℃溫浴20min。2次固定后，離心后留1ml固定液吹打沉淀物制成懸液滴于冰玻片上，于80℃烤箱老化2h。

將玻片置入100ml?胰蛋白酶溶液（0.05%）中靜置30s后用吉姆薩染液浸染2min，清水沖去染液，室溫晾干玻片。每份樣本在油鏡下計(jì)數(shù)30個(gè)分散好的中期分裂相，分析5個(gè)顯帶良好的核型，如遇異常核型則加倍計(jì)數(shù)及分析，嵌合核型計(jì)數(shù)至少100個(gè)核型。

1.2.2??精液質(zhì)量分析??精液質(zhì)量的相關(guān)指標(biāo)分析參照世界衛(wèi)生組織（World?Health?Organization，WHO）標(biāo)準(zhǔn)第5版，精液量≥1.5ml、總精子數(shù)≥39×106/ml、精子密度≥15×106/ml、精子活力前向運(yùn)動(dòng)百分率≥32%為正常參考標(biāo)準(zhǔn)[5]?？偩訑?shù)<39×106/ml或精子密度<15×106/ml為少精子癥，精子活力前向運(yùn)動(dòng)百分率<32%為弱精子癥。精子總數(shù)或濃度和前向運(yùn)動(dòng)精子百分率均低于參考值下限為少弱精子癥。

1.3??統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS?26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)（百分比）[n（%）]表示。

2??結(jié)果

在106例精液質(zhì)量異常組患者中共檢出異常染色體核型20例（18.87%），在186例正常對(duì)照組患者中檢出異常染色體核型9例（4.84%），兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。精液質(zhì)量異常組按異常類(lèi)型分，無(wú)精子癥組染色體異常檢出率最高，達(dá)50%，弱精子癥組未檢出異常核型，詳見(jiàn)表1。

從異常染色體核型檢出情況來(lái)看，異常類(lèi)型包括了性染色體數(shù)目異常、性染色體結(jié)構(gòu)異常、常染色體易位、常染色體倒位、標(biāo)記染色體幾種類(lèi)型。

本研究中性染色體數(shù)目異常占無(wú)精子癥患者異常核型的70%，包含了7例47，XXY，2例47，XYY，2例47，XXY/46，XY，1例45，XO/46，XY。其中，47，XXY及47，XXY/46，XY屬克氏綜合征（Klinefelter?syndrome，KS），9例KS患者中6例47，XXY為無(wú)精子癥患者，1例47，XXY為少弱精子癥患者，2例47，XXY/46，XY為正常對(duì)照組患者。

精液質(zhì)量異常組中無(wú)精癥患者性染色體異常為該組主要異常類(lèi)型，其中性染色體數(shù)目異常占該組異常核型比例最高，達(dá)70%。正常對(duì)照組中常染色體異常為該組主要異常類(lèi)型，其中常染色體倒位占該組異常核型比例最高，達(dá)44.44%。

3??討論

染色體核型異常在男性不育癥及生精異常中起重要作用，是男性不育癥患者最常見(jiàn)的遺傳學(xué)因素[1]。本研究男性不育癥患者異常核型檢出率為9.93%，低于胡晶晶等[4]統(tǒng)計(jì)的男性不育患者異常核型檢出率15.15%，高于薛會(huì)麗等[6]統(tǒng)計(jì)的男性不育患者異常核型檢出率7.19%，考慮為樣本量的差異導(dǎo)致。精液質(zhì)量異常組異常核型檢出率為18.87%，正常對(duì)照組患者異常核型檢出率為4.84%，均明顯高于健康成人的0.1～0.3%[7]。

染色體核型異常包含了染色體數(shù)目異常和結(jié)構(gòu)異常，后者包括了易位、倒位、插入、缺失、重復(fù)、等臂染色體和環(huán)狀染色體等。本研究中異常核型包含了性染色體數(shù)目異常、性染色體結(jié)構(gòu)異常、常染色體易位、常染色體倒位、標(biāo)記染色體幾種類(lèi)型，在不同精液質(zhì)量組中占比又各有不同。

KS是一般人群中最常見(jiàn)的染色體異常，典型的KS患者80～90%核型為47，XXY的性染色體的非整倍變異，是非梗阻性無(wú)精子癥和嚴(yán)重少精子癥最常見(jiàn)的遺傳病因之一[8-9]。姜柯安等[10]統(tǒng)計(jì)的145例47，XXY中有130例為無(wú)精子癥，15例為嚴(yán)重少精子癥。吳曉燕等[11]在就診的68例KS患者中僅發(fā)現(xiàn)1例47，XXY/46，XY患者為少精子癥。47，XXY/46，XY嵌合型KS患者精液質(zhì)量參數(shù)更好，睪丸體積更大，激素水平更接近于正常[12]。綜上所述，核型47，XXY患者絕大部分為無(wú)精癥，但由于外周血淋巴細(xì)胞染色體核型不能代表睪丸細(xì)胞的染色體核型，因此也有極少數(shù)患者表現(xiàn)為少弱精子癥。2例47，XXY/46，XY患者精液量、精液密度、精子活力都處于正常范圍。分析此類(lèi)患者僅在自然生育出現(xiàn)困難時(shí)才被發(fā)現(xiàn)染色體核型異常，而生育正常者并未做相應(yīng)檢查，推測(cè)人群中該核型的比例可能高于預(yù)期?？耸暇C合征患者需注意防范產(chǎn)生性染色體異常后代的風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)嚴(yán)格進(jìn)行輔助生殖術(shù)前的遺傳學(xué)咨詢(xún)和產(chǎn)前遺傳學(xué)診斷[13]。

男性47，XYY又稱(chēng)為超雄綜合征，一般認(rèn)為此類(lèi)患者大多數(shù)性發(fā)育正常，具有生育能力，部分患者也可出現(xiàn)睪丸發(fā)育不良，甚至無(wú)精子。歐陽(yáng)海等[14]在15例患者中發(fā)現(xiàn)有4例精液質(zhì)量正常。江峰等[13]發(fā)現(xiàn)的8例47，XYY其中3例為無(wú)精子癥患者，2例為少弱精子癥患者，2例為弱精子癥患者。本研究中2例47，XYY患者都為少弱精子癥，有進(jìn)一步進(jìn)行輔助生殖的可能，且額外的Y染色體會(huì)在生殖細(xì)胞減數(shù)分裂時(shí)凋亡而被清除，接受輔助生殖其后代出現(xiàn)染色體異常的風(fēng)險(xiǎn)極低[14]。45，XO/46，XY也被稱(chēng)為“男性特納綜合征”，一些患者雖有睪丸形成和發(fā)育，但睪丸功能存在不同程度的缺陷，表現(xiàn)為隱睪、睪酮產(chǎn)量不足致尿道下裂和生精障礙[15]。本研究中的1例45，XO/46，XY為無(wú)精子癥患者。

性染色體結(jié)構(gòu)異常在本研究?jī)H發(fā)現(xiàn)2例，1例46，X，?inv（Y）（p11q11）為正常對(duì)照組患者，inv（Y）的臨床及遺傳效應(yīng)目前學(xué)者的觀念尚不統(tǒng)一，考慮Y染色體倒位攜帶者的配子形成時(shí)Y染色體與X染色體只在同源基因片段產(chǎn)生配對(duì)交換，并不形成類(lèi)似常染色體倒位時(shí)產(chǎn)生的倒位環(huán)，不能用常規(guī)的減絲分裂理論來(lái)分析，且不同斷裂位點(diǎn)的基因功能可能也會(huì)有所不同[16]。也有報(bào)道認(rèn)為inv（Y）與少精子癥伴精子活力異常存在一定的相關(guān)性[16]。該患者在遺傳咨詢(xún)選擇輔助生殖可與其他染色體正常的患者一樣。1例46，XY，t（X;1）（p11.4;q11）為無(wú)精子癥患者，該核型是性染色體與常染色體之間發(fā)生的染色體平衡異位。

染色體平衡異位不僅發(fā)生在常染色體之間，也會(huì)在性染色體之間、性染色體與常染色體之間發(fā)生，羅伯遜易位也是平衡易位的一種特殊形式。本研究發(fā)現(xiàn)的6例平衡異位患者僅1例在正常對(duì)照組。45，XY，-13，der（18）t（18;13q11→13qter）為無(wú)精子癥患者，46，XY，t（5;22）（p11;p13）及2例羅伯遜異位為少弱精子癥患者。提及染色體平衡異位對(duì)生育的影響，通常會(huì)考慮易導(dǎo)致子代染色體出現(xiàn)重復(fù)、缺失等異常核型，以及易引起流產(chǎn)、胎停、死胎等不良孕產(chǎn)、胎兒出生缺陷的現(xiàn)象，染色體平衡異位與男性精液質(zhì)量之間的關(guān)聯(lián)并未引起臨床足夠的重視。胡俊青等[17]對(duì)包含羅伯遜易位的28例染色體平衡異位的生殖異常男性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)男性染色體平衡易位攜帶者其精子密度明顯低于正常對(duì)照組。

Zhang等[19]發(fā)現(xiàn)的5名性染色體與常染色體相互異位的患者也均為無(wú)精子癥患者。分析原因，染色體平衡易位會(huì)導(dǎo)致易位的同源染色體在減數(shù)分裂前期不能聯(lián)會(huì)，或干擾正常染色體在減數(shù)分裂中的配對(duì)與分離從而導(dǎo)致減數(shù)分裂障礙；同時(shí)斷裂處可能會(huì)伴有基因功能（例如具有生精功能）的改變從而引發(fā)不同程度的精液質(zhì)量異常[2，?19-20]。由于平衡易位攜帶者形成的配子僅1/18正常，1/18為平衡易位，剩余的16/18均為不平衡配子，因此，此類(lèi)患者可通過(guò)植入前胚胎遺傳學(xué)診斷技術(shù)選擇正常胚胎移植，再進(jìn)行產(chǎn)前診斷以獲得染色體核型正常后代。

本研究中發(fā)現(xiàn)的常染色體倒位包括了9號(hào)染色體臂間倒位及1號(hào)染色體臂間倒位。5例46，XY，inv（9）?（p12q13）僅1名為少弱精子癥患者，其余4例皆為正常對(duì)照組患者。9號(hào)染色體的臂間倒位的臨床及遺傳效應(yīng)目前學(xué)者的觀念尚不能統(tǒng)一，部分研究認(rèn)為會(huì)產(chǎn)生胚胎停育或反復(fù)流產(chǎn)甚至將其劃分為染色體多態(tài)性的表現(xiàn)[7，?17，21]。本研究中該核型為正常對(duì)照組異常核型的主要組成，在遺傳咨詢(xún)中如果擔(dān)心因此帶來(lái)生育障礙或反復(fù)流產(chǎn)等可行植入前胚胎遺傳學(xué)診斷。2例46，XY，inv（1）（p13q21）患者1例為無(wú)精子癥患者，1例為少精子癥患者。1號(hào)染色體斷裂區(qū)域與男性精液異常有關(guān)，以1p32、1p22、1q12、1q21?和1q24?最為常見(jiàn)，其中1q21斷裂點(diǎn)的患者精子的密度與活力受影響最大[2，?19-20]。1q21斷裂點(diǎn)處共鑒定出171個(gè)基因，其中4個(gè)已被報(bào)道在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟、精子生成、精子獲能或精子運(yùn)動(dòng)中起作用[3]。因此，患者在選擇輔助生殖時(shí)還是建議選擇正常胚胎移植，以防后代出現(xiàn)相同生育障礙。

額外小標(biāo)記染色體（small?supernumerary?marker?chromosome，sSMC）是一種結(jié)構(gòu)重排染色體，該染色體是?能通過(guò)細(xì)胞遺傳學(xué)常規(guī)顯帶方法分辨的結(jié)構(gòu)畸變的染色色體。人群中的發(fā)生率為0.15%，多數(shù)sSMC攜帶者是可以生育的，且多為母方遺傳，作為父方異常則比較少見(jiàn)[13]。本研究共發(fā)現(xiàn)3名嵌合型標(biāo)記染色體，2例為少弱精子癥，1例在正常對(duì)照組中經(jīng)父母雙親對(duì)照后識(shí)別為母源性。由于3名患者均未行分子遺傳學(xué)檢查，對(duì)于sSMC的來(lái)源和致病性目前還處于未知，將分子遺傳學(xué)與細(xì)胞遺傳學(xué)結(jié)合更有利于不育癥患者病因查找及遺傳咨詢(xún)。

綜上所述，不同精液質(zhì)量的男性不育癥患者其外周血染色體核型異常的發(fā)生類(lèi)型和發(fā)生率各有不同，對(duì)不育癥患者及時(shí)行外周血染色體核型分析可有效分析病因并能為輔助生殖提供方案選擇依據(jù)，對(duì)于出生缺陷的一級(jí)預(yù)防也有著重要意義。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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（收稿日期：2023–05–31）

（修回日期：2024–02–17）

《中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生》雜志誠(chéng)聘審稿專(zhuān)家的啟事

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