陳茹佳,劉建霞,閔加威

新生兒缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-ischemic brain damage, HIBD)是指因圍產(chǎn)期新生兒腦部血流量減少、宮內(nèi)窘迫、臍帶繞頸等引起的腦組織缺氧缺血性損傷,主要表現(xiàn)有新生兒意識、肌張力改變及原始反射異常,可能引起新生兒死亡和智力低下、癲癇、腦癱等近遠期后遺癥[1],給患兒家庭及社會帶來沉重負擔。目前,臨床上治療HIBD的主要方法有糾正酸中毒、吸氧和亞低溫治療等[2],但這些方法并不能有效修復受損神經(jīng)細胞,在改善患兒遠期預后方面效果不顯著,故需要開發(fā)新的預防或協(xié)同治療手段。紅景天苷是中藥薔薇科草本植物紅景天的主要有效成分,本質(zhì)是苯丙烷類糖苷化合物(C14H20O7),安全性高且藥理作用廣泛。研究表明,紅景天苷通過抑制細胞凋亡、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等途徑發(fā)揮抗缺氧、抗氧化、抗炎癥、抗衰老、神經(jīng)保護等多種藥理作用[3-8],然而紅景天苷在新生兒HIBD中的作用機制尚不明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學作為一種系統(tǒng)性的醫(yī)藥研究新模式,能夠有效建立藥物活性成分與疾病作用靶點之間的內(nèi)在聯(lián)系[9],現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于探索單一成分或中醫(yī)藥制劑發(fā)揮藥效的途徑方式[10]。基于此,本研究擬利用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法,探討紅景天苷治療HIBD的可能機制,解析關(guān)鍵作用靶點和信號通路,并通過體內(nèi)實驗驗證紅景天苷治療新生小鼠HIBD的實際效果,為臨床深入研究紅景天苷治療新生兒HIBD提供借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、材料及儀器

1)實驗動物:C57BL/6小鼠購自湖北省實驗動物研究中心[SCXK(鄂)2020-0018],飼養(yǎng)于中南民族大學動物實驗中心,環(huán)境溫度18～22 ℃,相對濕度50%～60%,12 h循環(huán)照明,飼養(yǎng)密度為每10只小鼠0.09～0.63 m2。

2)藥物與試劑:紅景天苷購自MCE公司;HE染液套裝(G1003)、Bax抗體(2772)、Bcl-2抗體(3498)、Cleaved-caspase-3抗體(9661)購自Cell Signaling Technology(美國)。

3)主要儀器:小動物麻醉機(R500IE);全自動常壓持續(xù)性缺氧(富氧)裝置(XBS-03);大小鼠抓力測定儀(YLS-13A);化學發(fā)光成像系統(tǒng)(C280)。

1.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學分析

1)藥物靶點篩選:從PubChem數(shù)據(jù)庫搜索并下載紅景天苷2D結(jié)構(gòu)的SDF文件和SMILES結(jié)構(gòu)式。將SMILES結(jié)構(gòu)式輸入Similarity Ensemble Approach(SEA)數(shù)據(jù)庫篩選出藥物相關(guān)靶點。使用SDF文件搜索Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫和Pharm Mapper數(shù)據(jù)庫,設(shè)置種屬為“Homo sapiens”進行靶點篩選。

2)疾病靶點篩選:使用DisGeNET數(shù)據(jù)庫、GeneCards數(shù)據(jù)庫和OMIM數(shù)據(jù)庫分別以“neonatal hypoxia ischemia brain damage”“neonatal hypoxia ischemia encephalopathy”“neonatal hypoxic ischemic encephalopthy”為關(guān)鍵詞進行檢索,將獲得的相關(guān)靶點基因合并后刪除重復得到疾病相關(guān)靶點。

3)“藥物-疾病”交集靶點篩選:對所有收集到的靶點進行Uniprot ID轉(zhuǎn)換,統(tǒng)一轉(zhuǎn)換為“Gene name”。將紅景天苷作用靶點和疾病相關(guān)靶點導入Venny 2.1在線軟件做圖工具平臺,繪制韋恩圖,二者取交集后獲得紅景天苷-HIBD交集靶點。

4)潛在靶點蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建:將紅景天苷-HIBD共同靶點上傳STRING數(shù)據(jù)庫,將生物種類設(shè)定為“Homo Sapiens”,最小互相作用閾值設(shè)定為0.4,隱藏不相連蛋白,其余設(shè)置為默認,構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。將PPI網(wǎng)絡(luò)導入Cytoscape軟件,通過“Network Analyzer”得出相互作用網(wǎng)絡(luò)的拓撲學參數(shù),degree排序后,選取degree前10位基因作為核心靶點。

5)GO功能和KEGG通路富集分析:將紅景天苷-HIBD潛在作用靶點導入DAVID數(shù)據(jù)庫,利用GraphPad Prism軟件,分別從生物過程(BP)、細胞組分(CC)、分子功能(MF)層面進行GO功能富集分析。同時,將潛在作用靶點導入DAVID數(shù)據(jù)庫,利用微生信在線工具,通過選取前20位通路形成KEGG通路富集分析條形圖,進而找出紅景天苷-HIBD作用關(guān)鍵通路。

1.3 實驗驗證

1)模型制備:選取鼠齡10 d、平均體質(zhì)量5 g的小鼠,基于Rice Vannucci方法[11]建立HIBD模型。用4%異氟烷麻醉小鼠,固定并結(jié)扎右側(cè)頸總動脈,縫合傷口后回籠恢復。2 h后,將小鼠置于37 ℃、含10%氧氣和90%氮氣的恒溫缺氧箱中缺氧1 h。模型制備完成后,由尾部提起小鼠,當觀察到小鼠頭部產(chǎn)生單側(cè)偏轉(zhuǎn)現(xiàn)象,判斷模型制備成功。

2)實驗分組:將小鼠隨機分為假手術(shù)組(n=21)、缺氧缺血組(n=21)、安慰劑組(n=21)和紅景天苷組(n=21)。其中,假手術(shù)組僅進行麻醉、在切開暴露右側(cè)頸總動脈后直接縫合傷口;缺氧缺血組完成整個模型制備過程;基于文獻調(diào)研結(jié)果[12-13]和實驗室前期工作,造模后,紅景天苷組按100 mg/kg用二甲基亞砜(DMSO)稀釋紅景天苷后腹部注射給藥1次;安慰劑組不給藥,只腹部注射按100 mg/kg用DMSO稀釋的生理鹽水。

3)TTC染色:造模后24 h,將小鼠過量麻醉處死,剪刀斷頭,剖開頸部皮膚,剪開腦膜,去掉嗅球小腦,取出各實驗組小鼠完整腦組織(n=6),冷凍切片,厚度1～2 mm。配制2%TTC染液,浸沒切片,37 ℃避光孵育10～15 min。孵育完成后,回收染液,滴加4%多聚甲醛至完全覆蓋切片,在4 ℃下固定過夜。使用掃描儀觀察攝片,使用Image-Pro Plus 6.0軟件定量分析梗死區(qū)域。

4)HE染色:造模后24 h,將小鼠過量麻醉處死,剪刀斷頭,剖開頸部皮膚,剪開腦膜,去掉嗅球小腦,取出各實驗組小鼠完整腦組織(n=3),制備石蠟切片進行HE染色。脫蠟后,使用蘇木素染液染色3～5 min,分化返藍后流水沖洗。梯度乙醇脫水后,使用伊紅染液染色5 min,再次脫水后用中性樹膠封片。染色結(jié)束后,細胞核呈藍色,細胞質(zhì)呈紅色。使用尼康DS-U3相機×20物鏡在頂葉皮層、海馬CA1區(qū)域采集圖像。

5)Western blot:造模后24 h,將小鼠過量麻醉處死,剪刀斷頭,剖開頸部皮膚,剪開腦膜,去掉嗅球小腦,收集各實驗組小鼠腦損傷側(cè)腦組織(n=6),加入裂解液,獲取裂解液混合物。4 ℃下15 000 r/min離心15 min,獲得上清。將上清與5×loading buffer按4︰1混合煮沸,獲得所需樣品。采用雅酶快速配膠試劑盒配制電泳凝膠,跑電泳轉(zhuǎn)膜后,獲得目的條帶,并用一抗、二抗孵育。利用化學發(fā)光成像系統(tǒng)進行顯影,使用Quantity One 4.6.1軟件對獲取的蛋白印記進行分析。

6)運動神經(jīng)行為評估:在造模后21 d開展行為學測試,各實驗組小鼠(n=6)按照順序完成Y迷宮實驗[14-16]、拉力測試[17]和角落實驗[18],不提前訓練小鼠以便獲得客觀數(shù)據(jù)。a.Y迷宮實驗:Y迷宮由3個不透明手臂呈120°布置,測試時將小鼠放置于迷宮任意一臂末端,并允許其探索任意一個手臂,實驗時間8 min。觀察小鼠進入各臂順序,記錄總進臂次數(shù)(小鼠4只腳均進入迷宮臂記為1次)和自發(fā)交替次數(shù)(依次連續(xù)進入全部3個手臂記為1次),計算自發(fā)交替行為概率。自發(fā)交替行為概率=自發(fā)交替次數(shù)/(總進臂次數(shù)-2)×100%。b.拉力測試:實驗采用YLS13A拉力系統(tǒng)測量小鼠腦損傷對側(cè)前肢力量,每只小鼠實驗3次,取平均值進行分析,以便評估小鼠運動能力。c.角落實驗:實驗在2塊紙板形成的30°角落中開展,通過觀察小鼠的活動軌跡,記錄小鼠在20次實驗中右轉(zhuǎn)的次數(shù),以便評估小鼠記憶能力。右轉(zhuǎn)率=(右轉(zhuǎn)次數(shù)/20)×100%,以右側(cè)胡須接觸角落壁記為小鼠右轉(zhuǎn)。

7)腦萎縮量化:小鼠完成行為學測試后,取腦組織,采用高精度天平(精確值:0.000 1 g)分別對損傷對側(cè)和同側(cè)腦組織進行稱重。腦組織損失百分比=損傷同側(cè)半腦重量/損傷對側(cè)半腦重量×100%[19]。

1.4 統(tǒng)計學方法

以上所有實驗每組至少進行3次,操作人員嚴格遵守雙盲實驗流程。應(yīng)用GraphPad Prism 8.0軟件處理數(shù)據(jù),采用t檢驗或單因素方差分析,使用Tukey/鄧肯檢驗進行2組以上分析。α=0.05為檢驗水準。

2 結(jié)果

2.1 靶點搜索結(jié)果

1)藥物靶點搜索結(jié)果:搜索Swiss Target Prediction、SEA和pharm Mapper數(shù)據(jù)庫,共獲得靶點182個,刪除重復項,最終獲得有效藥物靶點176個。

2)疾病靶點搜索結(jié)果:搜索Gene Cards、OMIM和DisGeNET數(shù)據(jù)庫,共獲得靶點2 980個,刪除重復項,最終獲得有效疾病靶點2 173個。

2.2 交集靶點Venn圖

綜合藥物靶點和疾病靶點結(jié)果,利用Venny2.1繪制“藥物-疾病”靶點交集Venn圖(圖1),得到交集靶點61個。

圖1 紅景天苷治療缺氧缺血性腦損傷小鼠實驗交集靶點Venn圖

2.3 潛在靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖

采用STRING數(shù)據(jù)庫和Cytoscape 3. 9. 1軟件構(gòu)建潛在靶點PPI網(wǎng)絡(luò),刪除無相互作用的靶點后剩余有效靶點59個,見圖2。通過拓撲網(wǎng)絡(luò)分析篩選出前10位核心靶點,構(gòu)建核心靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖(圖3)。分析顯示,Akt1、IL6、EGFR、HSP90AA1、ESR1、PPARG、SRC、FGF2、KDR、IL2可能為紅景天苷治療HIBD的重要靶點。

PPI為蛋白質(zhì)相互作用。

PPI為蛋白質(zhì)相互作用。

2.4 GO功能富集分析結(jié)果

GO功能富集結(jié)果前10個條目見圖4。BP主要富集到信號傳導、細胞增殖的正調(diào)控、凋亡過程的負調(diào)控;CC主要富集到細胞溶質(zhì)、細胞膜、胞外區(qū)域;MF主要富集到蛋白質(zhì)結(jié)合、ATP結(jié)合、相同蛋白質(zhì)結(jié)合。

圖4 紅景天苷治療缺氧缺血性腦損傷小鼠實驗潛在靶點GO功能富集分析

2.5 KEGG通路富集分析結(jié)果

KEGG通路富集分析顯著性居前20位的信號通路氣泡圖見圖5。KEGG通路富集分析結(jié)果表明,PI3K-Akt、Rap1、Estrogen等信號通路與紅景天苷-HIBD潛在靶點作用機制緊密聯(lián)系。

圖5 紅景天苷治療缺氧缺血性腦損傷小鼠實驗潛在靶點KEGG通路富集分析

2.6 紅景天苷對新生小鼠HIBD誘導腦梗死體積的影響

TTC染色結(jié)果示:假手術(shù)組小鼠腦組織完整,未見腦梗死區(qū)域;缺氧缺血組和安慰劑組小鼠腦組織出現(xiàn)明顯白色梗死區(qū)域;紅景天苷組小鼠腦組織梗死區(qū)域相比缺氧缺血組和安慰劑組明顯減小。使用Image-Pro Plus 6.0軟件進行定量分析,結(jié)果見圖6。與缺氧缺血組和安慰劑組相比,紅景天苷組腦梗死體積顯著縮小(P<0.01),提示紅景天苷治療可有效緩解HIBD誘導的腦梗死。

HIBD為缺氧缺血性腦損傷;與紅景天苷組比較,①P<0.01。

2.7 紅景天苷對新生小鼠HIBD誘導的頂葉皮層神經(jīng)元和海馬神經(jīng)元損傷的影響

HE染色結(jié)果見圖7,假手術(shù)組的頂葉皮層神經(jīng)元形態(tài)完整、排列整齊,層次清晰、形態(tài)及數(shù)量正常,染色均勻;海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列整齊,可見清晰的海馬結(jié)構(gòu)形態(tài);缺氧缺血組和安慰劑組出現(xiàn)大量空泡,神經(jīng)元結(jié)構(gòu)萎縮、分布紊亂、排列松散,細胞胞質(zhì)空泡化,細胞核固縮;紅景天苷組神經(jīng)元的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、排列得到明顯改善,空泡減少。結(jié)果顯示,紅景天苷治療逆轉(zhuǎn)了新生小鼠HIBD后腦損傷同側(cè)頂葉皮層和海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)損傷。

HIBD為缺氧缺血性腦損傷。

2.8 紅景天苷可激活PI3K/Akt信號通路、減少新生小鼠HIBD誘導的細胞凋亡

Western blot結(jié)果及統(tǒng)計分析見圖8。從蛋白條帶看(圖8a),紅景天苷組p-PI3K和p-Akt表達量相較缺氧缺血組和安慰劑組明顯增多,PI3K和Akt表達量明顯減少。從統(tǒng)計結(jié)果看(圖8b、8c),與缺氧缺血組和安慰劑組相比,紅景天苷組p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白相對表達量顯著增加(P<0.05、P<0.01),說明紅景天苷促進了PI3K和Akt的磷酸化,提升了磷酸化的PI3K和Akt占比,激活了PI3K/Akt信號通路。從蛋白條帶看,紅景天苷組抗凋亡蛋白Bcl-2表達水平較缺氧缺血組和安慰劑組均有升高;紅景天苷組促凋亡蛋白Bax表達水平較假手術(shù)組變化不大,但缺氧缺血組和安慰劑組Bax表達水平相較假手術(shù)組明顯升高。為衡量Bcl-2和Bax表達的綜合作用,分析二者的相對含量(圖8d),紅景天苷組Bcl-2/Bax表達水平較假手術(shù)組、缺氧缺血組和安慰劑組均顯著升高(P<0.01),說明紅景天苷治療使小鼠體內(nèi)抗凋亡蛋白相較促凋亡蛋白表達更有力。此外,從統(tǒng)計結(jié)果看(圖8e),缺氧缺血組和安慰劑組促凋亡蛋白Cleaved-caspase-3表達水平相較假手術(shù)組升高明顯;紅景天苷組Cleaved-caspase-3表達水平相較假手術(shù)組升高不明顯。這些結(jié)果表明,紅景天苷可以激活PI3K/Akt信號通路、減少新生小鼠HIBD誘導的細胞凋亡。

HIBD為缺氧缺血性腦損傷;8a.Western blot檢測各組新生小鼠PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白和凋亡相關(guān)蛋白表達圖;8b～8e.各蛋白表達水平的定量分析;與假手術(shù)組比較,①P<0.01;與紅景天苷組比較,②P<0.05,③P<0.01。

2.9 紅景天苷對新生小鼠HIBD誘導的長期神經(jīng)功能和腦萎縮的影響

Y迷宮實驗結(jié)果見圖9a,與假手術(shù)組相比,缺氧缺血組和安慰劑組小鼠表現(xiàn)較低的自發(fā)交替率;而與缺氧缺血組和安慰劑組相比,紅景天苷組自發(fā)交替成功的比率明顯提高(P<0.01)。拉力測試結(jié)果見圖9b,與假手術(shù)組相比,缺氧缺血組和安慰劑組損傷側(cè)對側(cè)前肢拉力明顯降低;而與缺氧缺血組和安慰劑組相比,紅景天苷組小鼠損傷側(cè)對側(cè)前肢拉力顯著增強(P<0.01)。角落實驗結(jié)果見圖9c,與假手術(shù)組相比,缺氧缺血組和安慰劑組小鼠明顯更傾向于右轉(zhuǎn);而與缺氧缺血組相比,紅景天苷組小鼠右轉(zhuǎn)率明顯降低(P<0.01)。假手術(shù)組小鼠的腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)完好,而缺氧缺血組和安慰劑組小鼠均出現(xiàn)了不同程度的腦萎縮和腦組織丟失;紅景天苷治療后,腦萎縮情況得到改善。小鼠損傷同側(cè)和對側(cè)大腦半球的質(zhì)量比分析見圖9d,與缺氧缺血組和安慰劑組相比,假手術(shù)組右腦出現(xiàn)了腦組織缺損;與缺氧缺血組相比,紅景天苷組提高了損傷同側(cè)和對側(cè)半球的質(zhì)量比(P<0.01),改善了右腦的組織丟失情況。

HIBD為缺氧缺血性腦損傷;9a～9c為使用Y迷宮實驗、拉力測試、角落實驗評估各組新生小鼠的神經(jīng)功能;9d采用損傷同側(cè)與對側(cè)半球的腦重量比評估腦組織丟失程度;與假手術(shù)組比較,①P<0.01;與紅景天苷組比較,②P<0.01。

3 討論

新生兒HIBD多是由圍產(chǎn)期窒息所引發(fā)的新生兒腦損傷疾病,隨著現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展,HIBD的神經(jīng)保護策略、神經(jīng)康復技術(shù)及相關(guān)基礎(chǔ)研究均取得了較大進步,但目前針對HIBD尚無確切有效的治療方法。既往研究表明,紅景天苷有多種豐富的藥理作用,已被證實其可通過多個信號通路發(fā)揮腦缺血性神經(jīng)損傷保護作用[20-23],但其對新生兒HIBD的保護機制尚未見報道。為明確紅景天苷對HIBD作用的相關(guān)分子機制,本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學方法探索紅景天苷治療新生兒HIBD的可能機制,并在此基礎(chǔ)上進行實驗驗證。

網(wǎng)絡(luò)藥理學分析結(jié)果表明,紅景天苷作用于HIBD的核心靶點包括Akt1、EGFR和IL6等。GO功能和KEGG通路富集分析顯示,紅景天苷治療HIBD涉及多種生物過程和多個信號通路,主要在調(diào)控細胞增殖、抑制細胞凋亡等過程中發(fā)揮作用,相關(guān)性較高的信號通路包括PI3K/Akt、Rap1和Estrogen等,其中PI3K/Akt通路富集基因較多,同時Akt1是PPI網(wǎng)絡(luò)中的顯著靶點,提示紅景天苷可能通過PI3K/Akt通路治療HIBD。

研究表明,PI3K/Akt信號通路是參與調(diào)控細胞分化、增殖和凋亡等功能的重要信號通路,可以通過激活PI3K/Akt信號通路,發(fā)揮相關(guān)神經(jīng)保護作用[24-28]。PI3K是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶,PI3K激活后可磷酸化細胞膜表面的二磷酸磷脂肌醇,形成三磷酸磷脂肌醇(PIP3),PIP3通過與Akt的PH結(jié)構(gòu)域結(jié)合,促使Akt從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到細胞膜并引發(fā)構(gòu)象改變,進而磷酸化Akt的蘇氨酸和絲氨酸位點使Akt完全活化[29]。Akt作為細胞凋亡的強效抑制因子,對細胞凋亡起著重要調(diào)控作用。Akt1是Akt的3種亞型之一,能夠介導調(diào)整新陳代謝、細胞存活和血管生成等諸多生物學過程[30-31]。活化的Akt進一步磷酸化Bax、Bcl-2、Cleaved-caspase-3等下游蛋白,從而介導細胞生長、增殖及細胞周期和糖代謝的調(diào)控[32]。在新生兒HIBD發(fā)病過程中,細胞凋亡起著重要作用[33]。Bcl-2是重要的細胞凋亡抑制基因,而Bax具有促進細胞凋亡作用,Cleaved-caspase-3是凋亡過程主要執(zhí)行者,在細胞凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵性作用[34-35]。紅景天苷通過抑制細胞凋亡內(nèi)源性途徑發(fā)揮HIBD保護作用[36],它能夠借助上調(diào)抗凋亡因子Bcl-2或下調(diào)促凋亡因子Bax表達[37],抑制Cytochrome C從線粒體向細胞質(zhì)釋放,進而下調(diào)Cleaved-caspase-3表達,抑制細胞凋亡。PI3K/Akt信號通路和相關(guān)蛋白在治療HIBD過程中起重要作用,LI等[38]和陽梅等[39]也分別借助刺囊酸和芍藥內(nèi)酯苷做出了探索性工作。

本研究驗證了紅景天苷在調(diào)節(jié)HIBD小鼠腦組織凋亡方面的作用,Western blot實驗結(jié)果顯示,紅景天苷可上調(diào)HIBD新生小鼠腦組織p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt的蛋白表達,降低促凋亡蛋白Bax和Cleaved-caspase-3的表達,同時上調(diào)抑制凋亡蛋白Bcl-2的表達,提升Bcl-2/Bax相對表達水平,使得小鼠體內(nèi)抗凋亡蛋白較促凋亡蛋白表達更明顯。實驗進一步表明,紅景天苷治療可明顯減輕HIBD新生小鼠腦損傷程度,降低腦梗死率,顯著改善小鼠腦損傷,提高小鼠的記憶和運動能力,有助于小鼠運動神經(jīng)功能障礙和腦萎縮的長期恢復。

綜上,紅景天苷通過激活PI3K/Akt信號通路抑制神經(jīng)元凋亡,進而對新生小鼠HIBD提供神經(jīng)保護。本研究提示紅景天苷是治療新生兒HIBD的潛在化合物,為臨床藥物的研發(fā)提供了實驗證據(jù)和理論依據(jù)。

倫理學聲明：本研究遵照了科學可行的實驗方案,并通過了中南民族大學倫理委員會審查批準(2024-scuec-050),符合實驗室動物管理與使用準則。

利益沖突聲明：文章的全部作者聲明,在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：1)閔加威負責設(shè)計論文框架,負責擬定寫作思路,指導撰寫文章并最后定稿;2)陳茹佳負責實驗操作,研究過程的實施,實驗數(shù)據(jù)收集,統(tǒng)計學分析和圖示繪制,起草并修改論文;3)劉建霞負責藥物和疾病的網(wǎng)絡(luò)藥理學分析,網(wǎng)絡(luò)藥理學相關(guān)方法,圖示和結(jié)果編寫和修改。