鄧仙梅 甘柯林 唐鐵鑫 曹娟娟

肇慶醫(yī)學高等專科學校，廣東 肇慶 526020

番石榴葉為桃金娘科植物番石榴PsidiumguajavaLinn.的干燥葉。春、夏季采收，曬干或鮮用。其性平，味甘、澀，歸大腸、肝經(jīng)。具有澀腸止瀉、收斂止血的功效。臨床上入湯劑用于治療泄瀉，下痢不止；外用治療皮膚濕疹瘙癢，跌打損傷，創(chuàng)傷出血[1]。番石榴葉是廣東地區(qū)常用中草藥，國醫(yī)大師鄧鐵濤教授就非常善于用單味番石榴葉治療泄瀉。此外，它還具有很好的降血糖保健作用，素有天然的“胰島素”之美稱，是眾多糖尿病患者選擇的保健茶療方。很早以來民間就流傳著一句話“血糖高不用愁，炒番石榴葉來解憂”。市面上也一直有炒番石榴葉茶包賣。李丹等[2]研究發(fā)現(xiàn)：炒番石榴葉安全劑量大；炒番石榴葉能降低 STZ 糖尿病大鼠血糖水平，作用機制可能與增強肝臟GK、GLUT2、IGF-1、IRS-1基因表達有關。

據(jù)現(xiàn)有文獻資料報道，有關番石榴葉的現(xiàn)代研究主要集中在其化學成分[3-12]、藥理作用[10-18]及臨床應用方面[19-21]，其中有幾篇是關于其炮制品藥理作用研究的文獻。但尚不見有關于番石榴葉的炮制工藝研究報道，故本實驗擬對番石榴葉的清炒炮制工藝進行研究，為炒番石榴葉的現(xiàn)代生產工藝提供實驗依據(jù)，保證炒番石榴葉的飲片質量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent1260型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；BP124S型、BP211D型電子天平(德國Sartorius公司)；KQ250B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥 金絲桃苷(批號：C13469877，Macklin，CAS：482-36-0，質量分數(shù)≥98.8%HPLC)；槲皮素(批號：C12374611，Macklin，CAS：117-39-5，質量分數(shù)≥98.8%HPLC)。水為純化水(超純水機，廣州盟歐儀器有限公司)；乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純。實驗用番石榴葉藥材于2021年9月采自廣東茂名高州，經(jīng)廣東藥科大學中藥學院劉基柱副教授鑒定為桃金娘科植物番石榴PsidiumguajavaL.的干燥葉子。

2 方法與結果

2.1 HPLC法測定金絲桃苷、槲皮素的含量

2.1.1 對照品溶液的制備 分別取金絲桃苷、槲皮素對照品7.75 mg、5.75 mg，精密稱定，分別置于5 mL容量瓶中，加60%乙醇溶液定容至刻度，配成濃度分別為1.55 mg/mL，1.15 mg/mL的對照品母液，于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。分別精密吸取金絲桃苷、槲皮素對照品母液100 μL、150 μL置于5 mL容量瓶中，加60%乙醇溶液定容至刻度，配制成濃度分別為31 μg/mL，34.5 μg/mL的混合對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取樣品粉末1.2 g，精密稱定，加入25 mL 60%乙醇溶液，稱定重量，液超聲提取30 min。取出放冷至室溫，加入60%乙醇溶液補足減失的重量。用 0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.1.3 色譜條件及專屬性試驗 色譜柱：Zorbax SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈(A) -0.2% 磷酸水溶液(B)；梯度洗脫(0～15 min，11%～13.5% A；15～30 min，13.5%～18% A；30～40 min，18% A；40～65 min，18%～49% A；65～70 min，49%～11% A)；檢測波長：360 nm；進樣量：10 μL；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃[7]。

按照以上方法條件進行專屬性試驗，結果如圖1。在該方法下測定清炒番石榴葉樣品的金絲桃苷、槲皮素含量，專屬性強，穩(wěn)定可行。

圖1 60%乙醇空白試液、混合對照品、炒番石榴葉樣品的HPLC圖

2.1.4 線性關系考察 分別吸取“2.1.1”項下的混合對照品溶液2 μL、3 μL、5 μL、10 μL、15 μL、30 μL、45 μL，按“2.1.3”項下的色譜條件進行測定。以各成分的進樣量X為橫坐標，峰面積Y為縱坐標進行線性回歸分析，得回歸方程為：金絲桃苷Y=1541.1X+68.198 (R2=0.9860)，槲皮素Y=2395.9X+9.0884 (R2=0.9999)。

2.1.5 精密度試驗 吸取“2.1.1”項下的混合對照品溶液10 μL，按“2.1.3”項下的色譜條件進行測定，連續(xù)平行測定6次，記錄各對照品的峰面積。結果金絲桃苷、槲皮素的峰面積RSD值分別為0.32%、0.45%。該結果表明儀器精密性良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗 精密吸取“2.1.2”項下的樣品試液10 μL，分別于0 h、3 h、6 h、9 h、12 h、18 h 進樣測定，記錄峰面積。結果金絲桃苷、槲皮素的峰面積RSD值分別為1.21%、1.34%。表明該樣品溶液在18 h內穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復性試驗 按照“2.1.2”項下的供試品溶液制備方法平行制備6份供樣品溶液，按“2.1.3”項下的色譜條件進行進樣測定，記錄峰面積。結果金絲桃苷、槲皮素的峰面積RSD值分別為0.65%、0.84%。表明該方法重復性良好。

2.1.8 加樣回收試驗 取已知含量的樣品粉末0.6 g，精密稱定，然后按1∶1的比例加入金絲桃苷、槲皮素對照品，再按照“2.1.2”項下的提取方法制備加樣供試品溶液，平行制備6份。然后吸取各份加樣樣品溶液10 μL進樣分析，記錄峰面積，并計算加樣回收率。結果金絲桃苷、槲皮素的加樣回收率為98.2%、100.1%，RSD值分別為1.15%、2.01%。表明該方法準確性良好。

2.2 單因素試驗

2.2.1 炒制溫度 稱取30 g 番石榴葉生飲片，平行稱取5份，分別在80 ℃、120 ℃、150 ℃、180 ℃、200 ℃清炒2 min，測定其金絲桃苷、槲皮素的含量。結果見表1。即選定炒制溫度的范圍是120～180 ℃。

表1 不同炒制溫度樣品的含量和外觀性狀

2.2.2 炒制時間 稱取30 g 番石榴葉生飲片，平行稱取4份，在180 ℃下分別炒0.7 min、2 min、3 min、4 min，測定其金絲桃苷、槲皮素的含量。 結果見表2。即選定炒制時間的范圍是0.7～2 min。

表2 不同炒制時間樣品的含量和外觀性狀

2.2.3 投藥量 稱取30 g 、50 g、80 g、100 g番石榴葉生飲片，分別在180 ℃下炒2 min，測定其金絲桃苷、槲皮素的含量。結果見表3。即選定投藥量的范圍是30～80 g。

表3 不同投藥量樣品的含量和外觀性狀

2.3 正交試驗 根據(jù)預試驗和單因素試驗結果可知，炒制溫度A、炒制時間B以及投藥量C對清炒番石榴葉飲片質量都有一定影響，故本試驗以金絲桃苷、槲皮素含量的加權評分OD值為主要評價指標(OD=金絲桃苷含量/金絲桃苷最大值×0.5×100+槲皮素含量/槲皮素最大值×0.5×100)，成品的外觀性狀作為參考評價指標，選取L9(34)正交表對炒制溫度、炒制時間以及投藥量這3個因素進行考察。結果見表4、表5、表6。

表4 正交設計因素水平表

表5 正交試驗優(yōu)選清炒番石榴葉的炮制工藝結果

表6 方差分析

根據(jù)表4結果可知，各因素影響大小次序為炒制時間(B)>炒制溫度(A)>投藥量(C)，其最佳工藝為A3B2C3。表4方差分析結果表明炒制溫度(A)和炒制時間(B)對OD值有顯著性影響，但投藥量(C)對OD值無顯著性影響。結合清炒番石榴葉外觀性狀特點綜合分析確定清炒番石榴葉的最佳炮制工藝為A3B2C1，即180 ℃清炒2 min，投藥量為30 g。

2.4 最佳工藝驗證 取同批番石榴葉按照“2.3”項下所確定的最佳炮制工藝進行制備清炒番石榴葉，平行做3份，測定其金絲桃苷、槲皮素含量。結果見表7。驗證試驗結果表明本次試驗優(yōu)選的清炒炮制工藝穩(wěn)定可行。

表7 最佳工藝驗證結果

3 討論

現(xiàn)代研究[22]表明，金絲桃苷在多種疾病中具有多種生物活性，具有抗氧化應激和細胞凋亡、抗急性肝損傷、抗腫瘤、抗炎、抗癌、抗抑郁、抗高血糖等作用。槲皮素具有止瀉、抗氧化、抗病毒、抗炎作用，在細胞和動物實驗中可以用來治療肝、心、脾、肺、腎、骨科疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等[23-24]。由此可見，金絲桃苷、槲皮素均為番石榴葉中的重要活性成分，故本試驗選擇這2種成分含量的加權評分作為工藝評價指標，可以很好地標示其飲片質量。

從“2.2”項下的單因素試驗結果可知，在番石榴葉中金絲桃苷含量隨著炒制的溫度升高而降低，而槲皮素含量則是隨著炒制的溫度升高而升高。在一定溫度下，番石榴葉中金絲桃苷含量隨著炒制時間的延長而降低，而槲皮素含量則是隨著炒制時間的延長而升高。槲皮素作為其重要的止瀉成分但在生品中的含量很低，清炒后可大大提高槲皮素含量，提高有效成分煎出率。此外，番石榴葉清炒過后可緩解其苦澀之味，改善口感。故建議用番石榴葉治療腹瀉時選擇炒番石榴葉。本試驗所確定的清炒番石榴葉的炮制工藝可為炒番石榴葉的生產提供實驗指導，具有一定的實際意義。