梁彩娟 李思遠 高 晗 李雪利 田 方 李軍山，2，3*

1.神威藥業(yè)集團有限公司，河北 石家莊 051430；2.云南省配方顆粒重點實驗室，云南 楚雄 675000；3.云南神威施普瑞藥業(yè)有限公司，云南 楚雄 675000

決明子為豆科植物鈍葉決明CassiaobtusifoliaL.或決明(小決明)CassiatoraL.的干燥成熟種子。決明子用藥歷史悠久，其既可食用，也可作藥用，是衛(wèi)健委公布的110種藥食同源的品種之一[1]。本品味甘、苦、咸，性微寒。入肝、大腸經(jīng)。具有清熱明目，潤腸通便的功效[2]。決明子含有蒽醌類、萘并吡喃酮類、多糖類、氨基酸類等多種化學成分，具有降壓調(diào)脂、抗氧化、保護肝臟、抑菌等作用[3-7]。

決明子為典型的清熱瀉火藥，因其在中醫(yī)臨床中用藥廣泛，需求量大，目前已被加工成多種劑型，如決明子粉，決明子配方顆粒等。決明子配方顆粒由決明子飲片經(jīng)提取、濃縮、干燥、制粒等工序制成，具有攜帶方便，易沖服，質(zhì)量穩(wěn)定均一等優(yōu)勢。2021年國家藥典委員會發(fā)布了《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標準制定技術(shù)要求》，文中提出將“標準湯劑”作為衡量單位中藥配方顆粒是否與臨床湯劑基本一致的物質(zhì)基準，并說明從原料到中間體到配方顆粒生產(chǎn)全過程的特征圖譜應具有相關(guān)性[8]。此外，由于配方顆粒失去了飲片的性狀、氣味及顯微特性，難以進行直觀的真?zhèn)舞b別，因此需建立專屬性強、重復性好且穩(wěn)定的檢測方法來控制決明子配方顆粒的質(zhì)量。目前有利用特征圖譜及多組分含量測定的方法控制決明子藥材質(zhì)量的相關(guān)報道[9-18]，但并無決明子飲片-標準湯劑-配方顆粒的相關(guān)性研究，全面控制決明子配方顆粒質(zhì)量的研究也較少。特征圖譜是一種從整體上控制中藥質(zhì)量的方法，能很好地體現(xiàn)配方顆粒中化學成分的分布情況。本研究采用HPLC法建立了決明子飲片、標準湯劑、配方顆粒特征圖譜，并以特征峰為分析對象進行相似度分析。決明子飲片、標準湯劑、配方顆粒之間主要成分的相關(guān)性評價，能準確地反映飲片、標準湯劑和配方顆粒之間主要化學成分的可追溯性，為決明子配方顆粒生產(chǎn)全過程質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 島津LC-20AT高效液相色譜儀，CPA225D型電子天平(賽多利斯公司)，R502B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申生科技有限公司)，DK-98-IIA電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)，shunliu-12N冷凍干燥機(南京順流儀器有限公司)。乙腈為色譜純(美國Fisher公司)，水為純化水，其他試劑均為分析純。

1.2 對照品 決明子(鈍葉決明)配方顆粒由神威藥業(yè)集團有限公司提供。橙黃決明素(批號：111900-202006)，大黃素(批號：110756-201913)，蘆薈大黃素(批號：110795-202011)，大黃酚(批號：110796-201922)，均購自中國食品藥品檢定研究院。

1.3 藥材、標準湯劑與配方顆粒

1.3.1 藥材 15批決明子藥材購自浙江、四川、安徽3個產(chǎn)區(qū)，經(jīng)原河北省藥品檢驗所孫寶惠老師鑒定均為鈍葉決明CassiaobtusifoliaL.的干燥成熟種子。15批藥材的產(chǎn)地信息見表1。

表1 15批藥材產(chǎn)地信息

1.3.2 標準湯劑 根據(jù)《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標準制定技術(shù)要求》及《醫(yī)療機構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》中相關(guān)規(guī)定，確定決明子標準湯劑制備工藝為：取決明子飲片100 g，加水煎煮兩次，一煎加8倍水，浸泡30 min，煎煮30 min，過200目篩，立即冷卻至室溫；二煎加6倍水，煎煮 20 min，過200目篩，立即冷卻至室溫，合并2次煎液，低溫濃縮至密度為1.02～1.08(65 ℃)，冷凍干燥，即得。

1.3.3 配方顆粒 依據(jù)標準湯劑出膏率、特征圖譜、含量等參數(shù)要求進行工藝優(yōu)化，確定決明子配方顆粒制備工藝為取決明子飲片200 g，加水提取兩次，第一次加飲片量8倍水，煎煮1 h，200目篩濾過，第二次加飲片量6倍水，煎煮30 min，200目篩濾過。80 ℃以下真空濃縮至相對密度為1.03～1.07(65 ℃)的濃縮液，過300目篩，噴霧干燥。膏粉加輔料適量，混勻，干法制粒，制成決明子配方顆粒。

2 方法與結(jié)果

2.1 決明子飲片、標準湯劑、配方顆粒特征圖譜建立

2.1.1 色譜條件 Agilent TC C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相：以乙腈為流動相A，以0.1%乙酸溶液為流動相B進行梯度洗脫，0～10 min 17%A→28%A，10～15 min 28%A→34%A，15～25 min 34%A→55%A，25～30 min 55%A→80%A，30～35 min 80%A；流速：1.0 mL/min；檢測波長：290 nm；進樣量：10 μL。理論板數(shù)按橙黃決明素峰計算應不低于5000。

2.1.2 對照品溶液的制備 取橙黃決明素、蘆薈大黃素、大黃素和大黃酚對照品適量，加70%甲醇制成每1 mL含橙黃決明素100 μg、蘆薈大黃素 20 μg、大黃素40 μg和大黃酚10 μg的混合溶液，作為對照品參照物溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備

2.1.3.1 決明子飲片供試品溶液制備 取本品粉末(過四號篩)約0.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理 30 min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，作為飲片供試品溶液。

2.1.3.2 標準湯劑、配方顆粒供試品溶液制備 取本品粉末約0.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，作為標準湯劑供試品溶液。

2.2 方法學考察

2.2.1 精密度 取同一批決明子標準湯劑，按2.1.3.2項下供試品制備方法處理，按2.1.1項下連續(xù)進樣6次，以橙黃決明素峰為參照物，經(jīng)計算特征峰相對保留時間的RSD為0.00%～0.11%，相對峰面積的RSD為0.00%～1.02%，表明儀器精密度良好。

2.2.2 重復性 取同一批決明子標準湯劑6份，按2.1.3.2項下進行處理，按2.1.1項下測定。以橙黃決明素峰為參照物，經(jīng)計算特征峰相對保留時間的RSD為0.00%～0.13%之間，相對峰面積的RSD為0.00%～1.07%，表明該方法重復性良好。

2.2.3 穩(wěn)定性 取同一批決明子標準湯劑按2.1.3.2項下進行處理，分別于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h按2.1.1項下進樣測定。以橙黃決明素峰為參照物，經(jīng)計算特征峰相對保留時間的RSD為0.00%～0.14%，相對峰面積的RSD為0.00%～0.86%，表明樣品在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3 樣品測定 取15批決明子飲片、決明子標準湯劑、決明子配方顆粒，按2.1.1項下進樣檢測，色譜圖如圖1～3所示。

圖1 決明子飲片特征圖譜

圖2 決明子標準湯劑特征圖譜

圖3 決明子配方顆粒特征圖譜

2.4 特征峰指認 通過比較供試品與對照品的保留時間并對色譜峰進行標定，確認了4個特征峰，分別為橙黃決明素、蘆薈大黃素、大黃素和大黃酚。如圖4所示。

R：決明子標準湯劑對照特征圖譜；S：混合對照品；峰3：橙黃決明素；峰4：蘆薈大黃素；峰6：大黃素；峰7：大黃酚

2.5 相似性分析 將決明子飲片、標準湯劑、配方顆粒對照圖譜進行比較，如圖5所示。并導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”(2012版)計算相似度，見表2。結(jié)果表明7個特征成分在決明子飲片→標湯→顆粒的制備過程中得到保留。通過計算，決明子飲片、標準湯劑、配方顆粒對照圖譜相似度在0.90～1.00之間，表明決明子飲片、標準湯劑、配方顆粒有較好的相似性。

圖5 決明子飲片(S3)、標準湯劑(S2)和配方顆粒(S1)對照圖譜比較圖

表2 決明子飲片、標準湯劑、配方顆粒對照圖譜相似度計算結(jié)果

3 討論

3.1 流動相的選擇 本研究以乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%乙酸溶液、乙腈-0.3%乙酸溶液為流動相進行梯度洗脫，發(fā)現(xiàn)采用乙腈-0.1%乙酸溶液進行洗脫時，特征峰的峰形及分離度均較好。嘗試甲醇和乙腈，發(fā)現(xiàn)乙腈洗脫能力更強，特征圖譜中特征峰的分布及峰形更好，最終選擇乙腈-0.1%乙酸溶液為流動相。

3.2 波長選擇 經(jīng)全波長掃描發(fā)現(xiàn)，樣品中特征峰在290 nm處均有較大吸收，各色譜峰響應及分離度均較好，能反映出決明子中的主要成分，因此選擇290 nm為檢測波長。

3.3 供試品制備方法考察 通過比較水、30%、50%、70%甲醇等不同提取溶劑，發(fā)現(xiàn)采用70%甲醇超聲處理，圖譜中特征峰數(shù)量較多，響應值均較高。超聲與回流提取方式考察，發(fā)現(xiàn)超聲與回流效果無太大差別，因此選擇操作簡單的超聲提取法。

通過相似性研究發(fā)現(xiàn)決明子配方顆粒與飲片、標準湯劑特征圖譜相似性高，化學成分基本一致，能準確的反映飲片、標準湯劑和配方顆粒之間主要化學成分的可追溯性，為決明子配方顆粒生產(chǎn)過程的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。