擺玉薔，任 馳，吳賽賽，方 菲，侯成立,2，李 欣,2,*，李金活，張德權(quán)

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全收貯運(yùn)管控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與營(yíng)養(yǎng)健康研究院（滄州），河北 滄州 061019；3.河北金宏清真肉類有限公司，河北 定州 073000）

生鮮肉在宰后加工、貯藏、流通等過(guò)程中發(fā)生的品質(zhì)劣變?cè)斐闪巳忸愘Y源的巨大浪費(fèi)、環(huán)境污染和經(jīng)濟(jì)損失[1]。由于僵直前的肉味道鮮美，在中國(guó)的消費(fèi)市場(chǎng)中受到消費(fèi)者廣泛歡迎[2-3]。然而如何在減少經(jīng)濟(jì)損失的同時(shí)保持僵直前的肉品質(zhì)，成為肉類產(chǎn)業(yè)關(guān)注的重點(diǎn)和難點(diǎn)。

糖酵解是宰后重要的生理生化過(guò)程，在宰后肌肉到肉的轉(zhuǎn)變過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[4]。隨著糖酵解的進(jìn)行，ATP含量和pH值降低導(dǎo)致肌肉僵直[5]。糖酵解酶是糖酵解過(guò)程的核心[6]，其表達(dá)量與肉品質(zhì)密切相關(guān)。在不同嫩度、肉色和持水力的肉中，磷酸甘油酸激酶（phosphoglycerate kinase，PGK）的表達(dá)量差異顯著[7]，葡萄糖磷酸變位酶可能是糖酵解酶中豐度與肉品質(zhì)關(guān)系最緊密的蛋白[8]。作為糖酵解途徑的關(guān)鍵酶之一，烯醇化酶與肉的嫩度[9]和顏色[10]密切相關(guān)。糖酵解酶的豐度在不同類型的肌肉中也存在顯著差異[11]。根據(jù)糖酵解酶在不同品質(zhì)肉和不同部位肉中表達(dá)量的差異，丙酮酸激酶、PGK、磷酸葡萄糖變位酶、烯醇化酶、肌球蛋白結(jié)合蛋白C、肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈2和肌鈣蛋白I可以作為表征和預(yù)測(cè)羊肉品質(zhì)特征的強(qiáng)有力生物標(biāo)志物[11]。

冷卻是宰后生鮮肉必須經(jīng)歷的環(huán)節(jié)，超快速冷卻憑其高效的冷卻效果受到廣泛關(guān)注[12]。超快速冷卻是指在宰后5 h內(nèi)將肌肉的中心溫度快速降溫至-1 ℃的過(guò)程[13]。超快速冷卻既可通過(guò)抑制胴體表面嗜冷細(xì)菌的數(shù)量保持肉品新鮮度[14]，又可以保持肉品質(zhì)。處于僵直前狀態(tài)的羊肉經(jīng)過(guò)超快速冷卻處理后剪切力減小，肌原纖維小片化指數(shù)升高[15]。超快速冷卻處理促進(jìn)骨架蛋白降解，改善嫩度[15]。超快速冷卻處理包括降溫和貯藏兩個(gè)環(huán)節(jié)，不同的降溫速率和貯藏溫度糖酵解進(jìn)程均存在差異。其中較快的降溫速率通過(guò)影響糖原磷酸化酶（glycogen phosphorylase，PYGM）、磷酸果糖激酶（phosphofructokinase，PFKM）、PGK、磷酸果糖異構(gòu)酶和醛縮酶（aldolase，ALDOA）等多種糖酵解酶的磷酸化和乙酰化，延緩糖酵解過(guò)程，從而改善肉品質(zhì)[12]。研究表明，與25、15 ℃和4 ℃貯藏相比，-1.5 ℃貯藏能夠顯著抑制肉中肌漿蛋白磷酸化水平和pH值下降速率[16]。總地來(lái)說(shuō)，超快速冷卻通過(guò)影響宰后肉的僵直進(jìn)程改善肉品質(zhì)。因此，本研究分析不同超快速冷卻條件對(duì)5 種糖酵解關(guān)鍵酶（PYGM、ALDOA、PFKM、PGK和磷酸丙糖異構(gòu)酶1（triosephosphate isomerase 1，TPI1））表達(dá)量的影響，旨在探究超快速冷卻通過(guò)糖酵解調(diào)控肉品質(zhì)的機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

降溫速率實(shí)驗(yàn)用小尾寒羊背最長(zhǎng)肌購(gòu)自河北金宏清真肉類有限公司；超快速冷卻結(jié)合貯藏溫度實(shí)驗(yàn)用小尾寒羊背最長(zhǎng)肌購(gòu)自北京二商穆香源清真肉類有限公司。

蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑 瑞士Roche公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜美國(guó)Millipore公司；增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL）顯色液 美國(guó)Bio-Rad公司；PYGM抗體 中國(guó)博奧森生物技術(shù)有限公司；ALDOA抗體、TPI1抗體、PGK抗體 美國(guó)Proteintech公司；PFKM抗體、辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的羊抗鼠免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）G 武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司；全蛋白提取試劑盒、葡萄糖含量、糖原含量和乳酸含量試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；異丙醇、甲醇、乙醇（均為分析純）國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Mini-PROTEAN Tetra電泳槽、Mini Trans-Blot轉(zhuǎn)膜設(shè)備、ChemiDocTMMP成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司；JYH-103恒溫恒濕培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；Ultra Turrax Disperser S25分散器 德國(guó)IKA公司；205便攜式pH計(jì) 德國(guó)Testo公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

降溫速率實(shí)驗(yàn)：選擇30 只生長(zhǎng)發(fā)育水平一致的7 月齡小尾寒羊，屠宰后立即取雙側(cè)背最長(zhǎng)肌，隨機(jī)分成3 組，在宰后1 h放置在不同的冷卻溫度中。對(duì)照組：樣品在0～4 ℃冷卻間冷卻（降溫速率：4.8 ℃/h）；降溫處理組1：樣品在-20 ℃冷凍庫(kù)（降溫速率：23.0 ℃/h）中冷卻至樣品中心溫度-1 ℃時(shí)轉(zhuǎn)至-1～0 ℃恒溫培養(yǎng)箱中；降溫處理組2：樣品在-35 ℃冷凍庫(kù)（降溫速率：25.1 ℃/h）中冷卻至樣品中心溫度-1 ℃時(shí)轉(zhuǎn)至-1～0 ℃恒溫培養(yǎng)箱中[12]。分別在宰后1 h、6 h、12 h、1 d、3 d和5 d留樣，液氮速凍。

超快速冷卻結(jié)合貯藏溫度實(shí)驗(yàn)：選取30 只生長(zhǎng)發(fā)育水平一致的7 月齡小尾寒羊，屠宰后立即取雙側(cè)背最長(zhǎng)肌，在宰后1 h內(nèi)置于-35 ℃冷凍庫(kù)中，宰后90 min肉的中心溫度穩(wěn)定在4 ℃，降溫處理結(jié)束（平均降溫速率：22.1 ℃/h）。降溫完成后樣品隨機(jī)分為3 組，分別放置在4（冷藏）、-1.5 ℃（冰溫）和-4 ℃（超冰溫）貯藏。分別在貯藏0 h、2 h、12 h、1 d、3 d和5 d留樣，液氮速凍。

1.3.2 pH值測(cè)定

便攜式pH計(jì)探頭插入肌肉中的深度為2 cm，連續(xù)測(cè)定3 次，結(jié)果取平均值。

1.3.3 蛋白質(zhì)提取

取0.5 g背最長(zhǎng)肌，加入6 倍體積的全蛋白提取液[12,17]。冰上勻漿，室溫孵育2 min，15 000×g離心2 min后取上清液。利用BCA法調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)濃度，與等量上樣緩沖液混合后沸水浴5 min。

1.3.4 葡萄糖含量測(cè)定

利用葡萄糖含量試劑盒測(cè)定，取約0.1 g背最長(zhǎng)肌組織，加入1 mL蒸餾水，勻漿，沸水浴10 min，冷卻至室溫后8 000×g離心10 min，取上清液。加入工作液后渦旋混勻，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱反應(yīng)15 min后，于505 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.3.5 糖酵解潛力（glycolytic potential，GP）測(cè)定

利用試劑盒測(cè)定糖原和乳酸含量，根據(jù)下式計(jì)算GP[18-19]：

1.3.6 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳和蛋白免疫印跡

采用10%的分離膠和4%的濃縮膠，樣品上樣量20 μg[12]。電泳初始電壓為70 V，隨后調(diào)整為110 V。當(dāng)溴酚藍(lán)指示帶距離凝膠底部0.5 cm處停止電泳。電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上（100 V，150 min）。轉(zhuǎn)膜后，用Tris含吐溫-20緩沖鹽溶液（Tris buffered saline with Tween-20，TBST）（137 mmol/L氯化鈉、20 mmol/L Tris、0.1% 吐溫-20，pH 7.6）洗滌、封閉液（5%脫脂牛奶，溶劑為TBST溶液）封閉、一抗（稀釋倍數(shù)1 000）孵育過(guò)夜、TBST溶液洗滌、二抗（稀釋倍數(shù)1 000）室溫孵育80 min、TBST溶液洗滌、ECL顯色后成像。用Quantity One軟件分析圖像，以單個(gè)蛋白的灰度值與全蛋白的灰度值之比表示糖酵解酶的表達(dá)量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析。采用一般線性方程分析不同溫度條件對(duì)pH值和糖酵解酶表達(dá)量的影響；采用最小顯著性差異法進(jìn)行差異顯著性分析（P＜0.05）；利用多元線性回歸計(jì)算相關(guān)系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 降溫速率對(duì)糖酵解進(jìn)程的影響

2.1.1 降溫速率對(duì)糖酵解代謝物的影響

由圖1可知，在宰后6 h～3 d，降溫處理組2的pH值最高；在宰后6 h和1～3 d，對(duì)照組的pH值顯著低于其他處理組（P＜0.05）。在宰后貯藏過(guò)程中，不同處理組的pH值均下降，對(duì)照組pH值在宰后3 d達(dá)到極限，降溫處理組在宰后5 d達(dá)到極限。在宰后6～12 h內(nèi)，對(duì)照組和降溫處理組1的葡萄糖濃度無(wú)顯著差異（P＞0.05），均顯著低于降溫處理組2。不同處理組的葡萄糖含量隨宰后時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸上升，宰后1 d后趨于穩(wěn)定。宰后1 h之后降溫處理組2的GP顯著低于其他兩個(gè)處理組。對(duì)照組和降溫處理組1的GP在宰后1 d內(nèi)上升，隨后趨于穩(wěn)定。降溫處理組2的GP在宰后5 d內(nèi)無(wú)顯著差異。

圖1 不同降溫速率處理肉中pH值、葡萄糖濃度和GP在宰后不同時(shí)間的變化Fig.1 Changes in pH,glucose content and glycolytic potential in meat with different chilling rates at different times postmortem

隨著宰后時(shí)間延長(zhǎng)，糖酵解過(guò)程生成的乳酸和ATP水解生成的氫離子積累，導(dǎo)致pH值下降[20]。葡萄糖通過(guò)轉(zhuǎn)化生成葡萄糖-1-磷酸為宰后糖酵解過(guò)程提供底物，同時(shí)糖原和一些大分子糖類轉(zhuǎn)化生成葡萄糖[21-22]。肌糖原貯存和糖原降解為葡萄糖相關(guān)的代謝過(guò)程和分子過(guò)程影響宰后肌肉轉(zhuǎn)化為肉的生化過(guò)程，特別是pH值下降速率的影響[23-24]。葡萄糖含量升高是由于轉(zhuǎn)化生成的葡萄糖多于糖酵解過(guò)程的消耗量，這與先前研究結(jié)果一致[21]。因此降溫處理組2中較高的葡萄糖含量可能是由于葡萄糖消耗慢、轉(zhuǎn)化生成量較高或者兩者共同作用。與對(duì)照組相比，降溫處理延緩了pH值的下降和葡萄糖的消耗，但并沒(méi)有改變?nèi)庵械臉O限pH值和葡萄糖含量，因此宰后1～5 d內(nèi)葡萄糖和糖原均是糖酵解的底物。有研究表明，宰后1～5 d內(nèi)不同處理組葡萄糖含量無(wú)顯著差異，糖原含量顯著下降[12]，因此宰后1～5 d內(nèi)降溫處理組糖酵解的底物可能是以糖原為主。GP可以更好地體現(xiàn)從肌肉到肉轉(zhuǎn)化過(guò)程中能量變化的能力，反映通過(guò)糖酵解可以轉(zhuǎn)化為乳酸的底物含量和產(chǎn)生的乳酸含量[19]。在糖酵解過(guò)程中，一分子糖原或葡萄糖生成兩分子乳酸[25]。與對(duì)照組和降溫處理組1相比，貯藏過(guò)程中降溫處理組2中GP變化不顯著，表明糖原經(jīng)糖酵解生成乳酸的過(guò)程處于動(dòng)態(tài)平衡[26]。降溫處理后生鮮肉中的GP顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），再次表明降溫處理延緩了宰后糖酵解的進(jìn)程。

2.1.2 降溫速率對(duì)糖酵解酶表達(dá)量的影響

由圖2可知，在宰后貯藏過(guò)程中，降溫處理組2顯著上調(diào)PYGM、ALDOA和TPI1的表達(dá)量，下調(diào)PFKM和PGK的表達(dá)量。降溫處理組1下調(diào)了PFKM和ALDOA的表達(dá)量；對(duì)照組和降溫處理組1對(duì)PYGM、TPI1和PGK表達(dá)量的影響基本一致。隨著宰后時(shí)間的延長(zhǎng)，PYGM和PFKM的表達(dá)量逐漸上調(diào)，其他3 個(gè)酶的表達(dá)量先上升后下降，在12 h～1 d達(dá)到峰值。

圖2 不同降溫速率處理肉中ALDOA、PFKM、PGK、PYGM和TPI1表達(dá)量在宰后不同時(shí)間的變化Fig.2 Changes in the expression of ALDOA,PFKM,PGK,PYGM and TPI1 in meat with different chilling rates at different times postmortem

作為一種參與糖原代謝的重要酶，PYGM的表達(dá)對(duì)機(jī)體組織能量供應(yīng)起重要作用。降溫處理后，肌肉中的溫度下降更快，機(jī)體內(nèi)需要更多的能量從而保持正常的代謝，因此降溫處理組的PYGM表達(dá)量更高。PYGM表達(dá)量高意味著對(duì)能量的需求較高，在對(duì)成年牛和胎牛6 個(gè)組織中PYGM的表達(dá)量進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，能量需求最高的心臟中PYGM的表達(dá)量最高[27]。另一方面，由于降溫處理延緩了糖酵解的進(jìn)行，當(dāng)糖原含量較高時(shí)，需要更多PYGM催化糖原降解[20]。研究表明，糖尿病患者體內(nèi)的PYGM水平異常升高且明顯高于健康機(jī)體[28]，證明糖原含量對(duì)PYGM表達(dá)量有影響。PFKM催化Mg2+、ATP依賴的果糖-6-磷酸形成ADP和果糖-1,6-二磷酸，以及刺激6-PFKM的活性控制機(jī)體的糖酵解代謝[29]。伊犁馬PFKM基因在心臟、肝臟、夾肌、斜方肌、背闊肌、臀中肌、半腱肌以及腹外斜肌8 種組織部位中都有表達(dá)，在心臟中相對(duì)表達(dá)量最高[30]，研究證實(shí)PFKM基因的相對(duì)表達(dá)量直接影響糖酵解的反應(yīng)速率[31-32]。降溫處理后PFKM的表達(dá)量降低，這是由于降溫處理延緩了肌肉中葡萄糖的消耗，糖酵解速率減慢。PFKM的表達(dá)量與游離葡萄糖顯著負(fù)相關(guān)[33]，PFKM表達(dá)量升高引起線粒體結(jié)構(gòu)損傷，降低細(xì)胞抗凋亡能力和細(xì)胞能量代謝效率[34]。推測(cè)其原因可能是PFKM催化生成果糖-1,6-二磷酸是糖酵解過(guò)程中第一個(gè)耗能的環(huán)節(jié)，機(jī)體為了節(jié)約能量，減少了PFKM的表達(dá)。醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究表明，PFKM的表達(dá)量升高能夠改善患者體內(nèi)氧化應(yīng)激水平，有效調(diào)節(jié)紅細(xì)胞糖代謝狀態(tài)[35]，與本研究中較低的PFKM表達(dá)量和較慢的糖酵解結(jié)果一致。為了最大限度將果糖-1,6-二磷酸轉(zhuǎn)化生成甘油醛-3-磷酸，ALDOA和TPI1的表達(dá)量顯著上升。ALDOA與高鐵肌紅蛋白還原活性負(fù)相關(guān)[36]，ALDOA介導(dǎo)的糖酵解增強(qiáng)是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的因素之一。ALDOA在肺癌及胰腺癌等多種疾病中高表達(dá)[37]，促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)[38]和卵巢顆粒細(xì)胞的糖酵解和增殖[39]。TPI1的高表達(dá)與肝內(nèi)膽管癌的復(fù)發(fā)與不良預(yù)后顯著相關(guān)[40]。TPI1在肉色穩(wěn)定的牛背最長(zhǎng)肌中過(guò)表達(dá)，與高鐵肌紅蛋白還原活性正相關(guān)[36]，TPI1的豐度與剪切力和硬度正相關(guān)[41]，TPI1還被認(rèn)為是蛋白降解酶發(fā)揮活性的標(biāo)志，其條帶完整性作為嫩度的指標(biāo)[42]。在宰后肌肉中，降溫處理導(dǎo)致ALDOA的高表達(dá)并不能加快糖酵解速率。PGK催化糖酵解過(guò)程中的第一個(gè)產(chǎn)能反應(yīng)，降溫處理后較低的PGK表達(dá)量與延緩的糖酵解速率相一致。研究表明腫瘤細(xì)胞中PGK的高表達(dá)促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取及利用，增加了乳酸的產(chǎn)生[43]。

總而言之，糖酵解酶對(duì)降溫處理的響應(yīng)不一致（圖3），降溫處理抑制了PFKM和PGK的表達(dá)量，較低的PFKM和PGK表達(dá)量與延緩的糖酵解速率相印證。PYGM、ALDOA和TPI1等單一酶過(guò)表達(dá)可能改變代謝物水平，但可能不足以控制糖原代謝的整個(gè)途徑[24]。針對(duì)屠宰和超快速冷卻這類外界應(yīng)激，不同糖酵解酶的變化都向著維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)的方向發(fā)展[12]，超快速冷卻處理增加了這種效應(yīng)。在25.1 ℃/h的降溫速率條件下，PGK和PFKM的表達(dá)量對(duì)糖酵解變化的貢獻(xiàn)更大。

圖3 降溫處理組2對(duì)5 種糖酵解酶表達(dá)量的調(diào)節(jié)作用Fig.3 Regulatory effect of chilling treatment II on the expression levels of five glycolytic enzymes

2.2 貯藏溫度對(duì)糖酵解進(jìn)程的影響

2.2.1 貯藏溫度對(duì)糖酵解代謝物的影響

由圖4可知，降溫處理后，在貯藏2 h～1 d內(nèi)，-4 ℃貯藏的pH值顯著高于4 ℃貯藏（P＜0.05）；不同貯藏溫度肉中pH值逐漸下降，-1.5 ℃和-4 ℃在貯藏3 d時(shí)達(dá)到極限pH值。在貯藏過(guò)程中-1.5 ℃貯藏組中葡萄糖濃度顯著低于其他兩個(gè)處理組（P＜0.05），4 ℃貯藏組葡萄糖濃度最高。在貯藏12 h～3 d內(nèi)，4 ℃和-1.5 ℃貯藏組中GP無(wú)顯著區(qū)別（P＞0.05），顯著低于-4 ℃貯藏組（P＜0.05）。不同貯藏溫度組中葡萄糖濃度和GP逐漸上升。

圖4 不同貯藏溫度肉中pH值、葡萄糖含量和GP在宰后不同貯藏時(shí)間的變化Fig.4 Changes in pH,glucose content and glycolytic potential of meat during postmortem storage at different temperatures

未經(jīng)超快速冷卻處理的生鮮肉在4 ℃貯藏組的pH值下降速率大于-1.5 ℃貯藏，且-1.5 ℃貯藏組pH值顯著高于4 ℃組（P＜0.05），說(shuō)明宰后貯藏溫度升高促進(jìn)糖酵解進(jìn)程的發(fā)生，導(dǎo)致pH值下降速率更快[16]。在本研究中，與-1.5 ℃貯藏相比，降溫處理后4 ℃貯藏組的pH值僅在貯藏2 h和12 h時(shí)較低，表明超快速冷卻處理削弱了貯藏溫度對(duì)生鮮肉pH值的調(diào)節(jié)作用。-4 ℃貯藏減緩了pH值下降速率，這是由于ATP水解生成氫離子的速率較慢[16]。-1.5 ℃貯藏組葡萄糖濃度顯著低于4 ℃和-4 ℃貯藏組（P＜0.05），表明葡萄糖可能是超快速冷卻處理后-1.5 ℃貯藏機(jī)體內(nèi)糖酵解的主要底物。與-1.5 ℃貯藏相比，4 ℃延緩了葡萄糖的消耗，但是兩者之間GP無(wú)顯著差異（P＞0.05），這表明糖原可能是4 ℃組糖酵解過(guò)程的主要底物。與-1.5 ℃貯藏相比，-4 ℃貯藏肉中GP較大，表明其糖酵解生成乳酸的速率快[23]。糖原含量低、乳酸含量高的肌肉在宰后早期的糖酵解速率高于糖原含量高、乳酸含量低的肌肉[23]。從代謝物的變化可以看出降溫處理后-1.5 ℃貯藏和4 ℃貯藏對(duì)糖酵解的延緩作用一致，-4 ℃貯藏延緩了pH值下降，但提升了GP。

2.2.2 貯藏溫度對(duì)糖酵解酶表達(dá)量的影響

由圖5可知，貯藏過(guò)程中4 ℃和-1.5 ℃條件下PYGM的表達(dá)量先上升后下降，-4 ℃貯藏下PYGM表達(dá)量無(wú)顯著變化（P＞0.05）。貯藏過(guò)程中4 ℃和-4 ℃貯藏組中PGK表達(dá)量先上升后下降，-1.5 ℃貯藏組中PGK表達(dá)量隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而下降。在貯藏過(guò)程中-1.5 ℃的PYGM表達(dá)量顯著高于-4 ℃貯藏組。ALDOA的表達(dá)量在不同貯藏溫度條件下均先上升后下降，4、-1.5 ℃和-4 ℃分別在貯藏2、12 h和1 d時(shí)達(dá)到極值。不同貯藏溫度條件下肉中PFKM表達(dá)量隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸下降，僅在貯藏5 d時(shí)4 ℃貯藏組的PFKM表達(dá)量顯著低于其他溫度貯藏組（P＜0.05）。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，不同溫度貯藏組中TPI1表達(dá)量先上升后下降。-1.5 ℃貯藏溫度條件下TPI1的表達(dá)量在貯藏12 h時(shí)最高，貯藏3 d時(shí)最低。

與-1.5 ℃貯藏相比，4 ℃和-4 ℃貯藏肌肉中PYGM表達(dá)量較低，這可能是由于體系內(nèi)糖原含量低。-4 ℃貯藏組中較高的PFKM和PGK表達(dá)量也證明了其較快的糖酵解速率[33]。較高的PFKM表達(dá)量伴隨ATP的生成，機(jī)體內(nèi)因?yàn)锳TP水解導(dǎo)致的游離氫離子減少，因此-4 ℃貯藏組pH值下降速率慢?？傊?，經(jīng)過(guò)相同降溫速率處理后，不同貯藏溫度對(duì)糖酵解酶表達(dá)量的影響存在差異。-1.5 ℃貯藏和4 ℃貯藏對(duì)糖酵解酶表達(dá)量的影響相同，不改變降溫速率對(duì)糖酵解酶表達(dá)量的調(diào)控作用，均通過(guò)抑制PGK的表達(dá)量延緩糖酵解，而-4 ℃貯藏通過(guò)上調(diào)PGK的表達(dá)量促進(jìn)了糖酵解過(guò)程（圖6）。結(jié)合不同降溫速率糖酵解酶表達(dá)量的結(jié)果，超快速冷卻中降溫處理對(duì)糖酵解速率的調(diào)控作用更強(qiáng)，降溫處理后4 ℃和-1.5 ℃貯藏不改變降溫處理對(duì)糖酵解的延緩作用，且降溫處理后糖酵解的主要底物是葡萄糖。

2.3 不同處理?xiàng)l件對(duì)糖酵解和糖酵解酶表達(dá)量的相關(guān)性分析

選擇糖酵解底物葡萄糖和5 個(gè)糖酵解酶的表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如表1 所示，在不同降溫速率條件下，葡萄糖水平與PFKM表達(dá)量顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），與PYGM的表達(dá)量極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與其他蛋白的表達(dá)量無(wú)顯著相關(guān)性（P＞0.05）。在不同貯藏溫度條件下，葡萄糖水平與PFKM和PYGM的表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。

表1 不同降溫速率和貯藏溫度肉中葡萄糖水平和糖酵解酶表達(dá)量回歸系數(shù)參數(shù)估計(jì)值Table 1 Regression coefficient parameter estimates for glucose contents and expression levels of glycolytic enzymes in meat at different chilling rates and storage temperatures

在宰后糖酵解過(guò)程中，葡萄糖和糖原分解生成乳酸和氫離子，導(dǎo)致pH值下降[20]。葡萄糖是糖酵解過(guò)程的底物，與pH值負(fù)相關(guān)。在不同降溫速率和貯藏溫度處理中PFKM和PYGM的表達(dá)量與葡萄糖含量存在相關(guān)性，表明PFKM和PYGM的表達(dá)量在一定程度上反映糖酵解的進(jìn)程。不同溫度條件下PYGM表達(dá)量與葡萄糖含量相關(guān)性的差異表明，隨著宰后貯藏條件變化和宰后時(shí)間延長(zhǎng)，糖酵解過(guò)程底物含量的變化模式不同。降溫處理時(shí)，糖酵解以糖原為主要底物；在不同貯藏溫度條件下，糖酵解主要消耗的底物是葡萄糖。雖然葡萄糖水平隨不同溫度條件變化顯著，但是并不改變糖原是糖酵解過(guò)程的有效底物[44]。高表達(dá)量的PFKM可能有助于糖酵解的進(jìn)行，為后續(xù)甘油醛-3-磷酸的生成提供底物?？偠灾?，PFKM的表達(dá)量可以表征不同降溫速率和貯藏溫度處理對(duì)糖酵解反應(yīng)速率的影響，PFKM的高表達(dá)與較快的糖酵解速率相關(guān)。

3 結(jié)論

超快速冷卻顯著延緩生鮮羊肉中pH值和葡萄糖含量的下降，抑制了糖酵解速率。降溫處理是延緩糖酵解的核心環(huán)節(jié)，25.1 ℃/h的降溫速率通過(guò)下調(diào)PFKM和PGK的表達(dá)量，上調(diào)PYGM、ALDOA和TPI1的表達(dá)量實(shí)現(xiàn)延緩糖酵解。降溫處理后冷藏和冰溫貯藏不改變降溫速率對(duì)糖酵解過(guò)程的延緩作用。超快速冷卻處理后生鮮羊肉中的糖酵解底物以葡萄糖為主，生鮮羊肉中葡萄糖含量與PFKM的表達(dá)量之間的負(fù)相關(guān)進(jìn)一步體現(xiàn)了超快速冷卻處理后PFKM對(duì)糖酵解速率的調(diào)控作用，PFKM可能是超快速冷卻過(guò)程中調(diào)控糖酵解的關(guān)鍵酶。