林昌偉 袁祖君

腎細(xì)胞癌(renal cell carcino ma,RCC)已成為泌尿生殖系統(tǒng)最常見的腫瘤之一,約占所有惡性腫瘤的3%[1]。而其中最常見的亞型為腎透明細(xì)胞癌(clear cell renal cell carcino ma,cc RCC),約占RCC的80%～90%[2]。在首次診斷時,約有25%～30%的cc RCC患者已經(jīng)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移[3]。因此,研究cc RCC的發(fā)生發(fā)展機(jī)制,尋找新的生物標(biāo)志物和潛在的治療靶點對于cc RCC診療具有重要意義。

組蛋白甲基化異常是腫瘤細(xì)胞中常見的表觀遺傳學(xué)改變之一,針對相關(guān)基因進(jìn)行靶向治療能否成為惡性腫瘤的關(guān)鍵潛在治療策略也成為腫瘤研究的熱點[4]。賴氨酸特異性去甲基酶6B(lysine specific de met hylase 6B,KDM6B)是Ju monji C 組蛋 白去甲基化酶家族的成員,其作用是特異性去除組蛋白H3的第27個氨基酸的甲基化修飾,從而影響基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。KDM6B廣泛參與細(xì)胞的分化、增殖、衰老和凋亡過程,是細(xì)胞應(yīng)對環(huán)境壓力做出應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控基因。在多種病理生理過程中,賴氨酸特異性去甲基酶蛋白家族的成員發(fā)揮雙重作用[5-7]。在某些人類癌癥(如非小細(xì)胞肺癌[8]和結(jié)直腸癌[9])中,KDM6B 基因表達(dá)顯著下調(diào),然而在其他情況下(如食管鱗狀細(xì)胞癌[10]和肝癌[11]),KDM6B的表達(dá)水平在癌組織中顯著升高。盡管對KDM6B已有一定的研究,但對其在cc RCC 中的表達(dá)情況及具體作用機(jī)制仍知之甚少。因此,本研究旨在探究KDM6B 異常表達(dá)在cc RCC 中的潛在臨床意義,并研究KDM6B對cc RCC細(xì)胞增殖和遷移侵襲能力的影響及潛在的下游效應(yīng)。

材料與方法

一、實驗材料與組織樣本

cc RCC組織蠟塊來源于在我院診療的42名患者。排除標(biāo)準(zhǔn):①年齡小于18歲患者;②缺乏完整臨床病理資料的患者;③既往有其他惡性腫瘤病史的患者;④預(yù)期壽命<6個月的患者。南充市中心醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)本次研究,所有患者均簽署知情同意書,同意以匿名方式使用患者腫瘤組織蠟塊、臨床病理資料及隨訪信息。

人腎癌細(xì)胞株ACHN 和Caki-1均購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫;RPMI-1640培養(yǎng)基(31800),Cell Counting Kit-8 assay(CCK8,CA1210),BCA 蛋白定量試劑盒,SDS-PAGE預(yù)制膠試劑盒(P1200),超強(qiáng)化學(xué)發(fā)光ECL 試劑(PE0010),RIPA 蛋白裂解液(R0010)、一抗及二抗稀釋液(A1800)、1×TBST洗膜液(D1061)、PBS緩沖液(P1022)、結(jié)晶紫(C8470)均購自中國北京索萊寶科技有限公司;PVDF膜購自德國羅氏診斷有限公司(03010040001);胎牛血清(16140089)和Lipofectamine 2000脂質(zhì)體(11668500)購自美國Ther mo公司;垂直蛋白電泳儀和轉(zhuǎn)膜電泳槽購自美國Bio-Rad公司;酶標(biāo)儀購自Ther mo公司;電子顯微鏡購自Leica公司;小干擾RNA 的設(shè)計和合成、PON1基因及GAPDH 基因的PCR 引物均由上海生工生物工程有限公司完成。Transwell小室購自Merck Millipore,Matrigel膠購自BD Biosciences。兔源KDM6B 抗體(ab169197)和兔源GAPDH 抗體(ab8245)均購自美國Abcam 公司;兔源細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶蛋白(extracellular signal-regulated kinase,ERK)抗體(4695),兔源細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶蛋白(phosphor ylated extracell ular signal-regulated kinase,p-ERK)抗體(4370)購自美國CST 公司。

二、癌癥基因組圖譜(The Cancer Geno me Atlas Progra m,TCGA)數(shù)據(jù)庫分析

通過基因表達(dá)譜交互分析(gene expression profiling interactive analysis,GEPIA)(http://gepia.cancer-pku.cn/)數(shù)據(jù)庫分析TCGA 數(shù)據(jù)庫中533個樣本KDM6B 表達(dá)水平與病理分期的關(guān)系。根據(jù)KDM6B 表達(dá)水平中位值,將患者分為KDM6B高表達(dá)水平組及KDM6B 低表達(dá)水平組。采用Kaplan-Meier分析L MNB1 表達(dá)水平高低對患者預(yù)后的影響,并生成Kaplan-Meier生存曲線。

三、免疫組化檢測

免疫組化法檢測腎透明細(xì)胞癌組織中KDM6B的表達(dá)。對于I HC染色,組織部分脫蠟后進(jìn)行抗原修復(fù):在10 m M 檸檬酸鈉煮沸(p H 值6.0)并在130℃維持3 min。切片自然冷卻后用3%的過氧化氫溶液處理為30 min,沖洗,用5%的正常山羊血清作為阻斷劑孵育20 min。切片用小鼠抗KDM6B抗體在4℃孵育過夜。第2天,載玻片在PBS中洗滌,室溫下與二抗孵育30 min。所有步驟之前都用PBS(p H 7.6)沖洗切片。使用含有3,3-二氨基聯(lián)苯胺的特殊試劑盒(中杉金橋,ZLI-9018)對染色片子進(jìn)行顯色。蘇木精復(fù)染,脫水膠作密封膠;然后對切進(jìn)行觀察、評分和成像。根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度評分為4級,無陽性著色(陰性)計0分,淡黃色(弱陽性)計1分,棕黃色(陽性)計2 分,棕褐色(強(qiáng)陽性)計3分;根據(jù)陽性細(xì)胞百分比評為4級,≤25%計1分,26%～50%計2分,51%～75%計3分,>75%計4分,將兩項評分相乘得出最終評分結(jié)果,小于6分定為低表達(dá)組,大于等于6分定為高表達(dá)組。兩名病理學(xué)醫(yī)師獨立評估免疫組化結(jié)果,評估不一致的免疫組化染色由兩名醫(yī)師協(xié)商得出最終染色結(jié)果。

四、細(xì)胞培養(yǎng)

人源腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞系A(chǔ)CHN 和Caki-1細(xì)胞系購自ATCC 并經(jīng)過STR 鑒定。ACHN 用1640培養(yǎng)基培養(yǎng),Caki-1 用MCCOYS 5 A 培養(yǎng)基培養(yǎng),培養(yǎng)液中均添加10%胎牛血清(Eall bio),1%l-谷氨酰胺(Gibco),1%非必需氨基酸溶液(Gibco)和1%青霉素-鏈霉素(Gibco,10378016,100 U/mL青 霉 素,100μg/mL 鏈 霉 素)。細(xì) 胞 培 養(yǎng) 在37°C,5%CO2的培養(yǎng)箱中。

五、細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗

為了抑制KDM6B 的表達(dá),我們使用RNAi MAX (Invitrogen)將si RNA 用Lipofectamine 2000試劑(Invitr ogen)轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。第1天將一定量的細(xì)胞接種于6-well細(xì)胞板(Cor ning),使其第二天密度達(dá)50%左右,將無血清培養(yǎng)基溶解的si RNA與無血清培養(yǎng)基溶解的RNAi MAX 等體積輕輕混勻后靜置15 min,緩慢加入細(xì)胞中。第2天更換新鮮的培養(yǎng)基,轉(zhuǎn)染48 h后,進(jìn)行后續(xù)實驗。小干擾RNA 序 列:si-KDM6B:GAGACCUCGUGUGGAUUAA;negative control(NC)5’-UUCUCCGA ACGUGUCACGU-3’。

六、RNA 提取與實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-ti me quantitative poly merase chain reaction,RT-q PCR)

使用TRIzol試劑(15596026,Life Technologies)從腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞中提取總RNA,并使用High-Capacity c DNA reverse Transcription Kit(4368814,Applied Biosyste ms)將2μg RNA 反轉(zhuǎn)錄為c DNA。然后用SYBR Green/ROX q PCR Master Mix (K0251,Ther mo Scientific)作為模板進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增。beta-actin 作為內(nèi)參。KDM6B 上游引物:TTGGGCAACTGTACGAGTCAG,下游引物:CCATAGTTCCGTTTGTGCTCAAG。actin上游引物:GATCATTGCTCCTCCTGAGC,下游引物:ACTCCTGCTTGCTGATCCAC。VEGFR1上游引物:GAAAACGCATAATCTGGGACAGT,下游引物:GCGTGGTGTGCTTATTTGGA。ALK 上游引物:TCTCATCGCAGCCGATATGG,下 游 引 物:GGCATCTCCTTAGAACGCTCT。FGFR2 上 游 引 物:AGCACCATACTGGACCAACAC 下 游 引 物:GGCAGCGAAACTTGACAGTG。RYK 上游引物:CCCAGGTCAACATTTCTGTTCA,下游引物:TGCCAGTACAGGAAAGCTCTAC。

七、Wester n blot實驗

貼壁生長的細(xì)胞用冷的PBS洗3次,加入含蛋白酶抑制劑PMSF 的RIPA 裂解液在冰上裂解30 min。細(xì)胞裂解液離心后收集上清。使用BCA 試劑盒(PC0020,Solar bio)對蛋白濃度進(jìn)行定量。等量(30μg)的總蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,轉(zhuǎn)移到0.45μm PVDF 膜上。在室溫下用5%牛血清白蛋白(BSA)在TBST 緩沖液中封閉膜2 h 后,在4℃與一抗孵育過夜。用TBST緩沖液洗滌膜3 次,然后在室溫下與過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)二抗孵育1 h。使用超強(qiáng)化學(xué)發(fā)光ECL試劑盒檢測特異性抗體結(jié)合。熒光信號由熒光圖像分析儀檢測。

八、細(xì)胞存活率和克隆形成試驗

使用CCK-8試劑盒來測量KDM6B 敲低對腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞增殖的影響。將細(xì)胞以1 000個細(xì)胞/孔的密度接種于96孔細(xì)胞板,并在200μl的培養(yǎng)基中生長過夜。第2 天開始,分別在之后的0、24、48、72、96 h,每孔加20μl CCK-8試劑,37℃孵育3 h。最后,用酶標(biāo)儀在450/650 n m 處測量吸光度(optical density,OD)。對于克隆形成實驗,在6-well細(xì)胞板中每個孔種600個細(xì)胞。其間每4 d更換一次培養(yǎng)基,2周后,用磷酸鹽緩沖鹽水 (PBS)洗滌3次,4%多聚甲醛固定20 min,0.5%結(jié)晶紫染色15 min,然后計數(shù)。

九、Transwell細(xì)胞遷移侵襲實驗

在24孔室板中,使用8μm 孔的transwell小室進(jìn)行細(xì)胞遷移和侵襲檢測。trans well室預(yù)涂(侵襲試驗)或不涂(遷移試驗)Matrigel膠(BD Biosciences)。底室充入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基500 μl,上室充入不含10%胎牛血清的2×104細(xì)胞培養(yǎng)液200μl,并于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h(遷移實驗)或48 h(侵襲試驗)。然后,細(xì)胞表面膜的底部固定在4%聚甲醛30 min和沾0.1%結(jié)晶紫20 min。每組隨機(jī)選取5個顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計。

十、統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 23.0 統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析,使用Graphpad pis m 9.5 繪圖,使用Kaplan-Meier分析對患者的生存期進(jìn)行分析,對所有計量資料進(jìn)行t檢驗,對所有計數(shù)資料進(jìn)行χ2檢驗,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、免疫組化檢測KDM6B 在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)

我們首先運(yùn)用免疫組化染色在腎透明細(xì)胞癌中對KDM6B進(jìn)行表達(dá)的檢測,在42例腎透明細(xì)胞癌患者的組織中,有26例呈KDM6B 高表達(dá)(評分≥6),16例呈KDM6B低表達(dá)(評分<6)(圖1 A、B),42例患者的臨床病理特征見表1,我們對KDM6B的表達(dá)和臨床病理特征進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)KDM6B 的高表達(dá)患者其腫瘤直徑更小(圖1C,表1),T 分期(圖1D,表1)、N 分期(圖1E,表1)、M 分期更低(圖1F,表1),且KDM6B 高表達(dá)患者有更長的總生存期(圖1B)。上述結(jié)果表明,KDM6B 低表達(dá)與患者預(yù)后不良顯著相關(guān),其可能是腎透明細(xì)胞癌的一個重要的生物標(biāo)志物。

表1 不同臨床病理特征患者KDM6B表達(dá)水平比較

圖1 KDM6B與腎透明細(xì)胞癌臨床病理特征關(guān)系

二、GEPIA 網(wǎng)站分析KDM6B表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌分期與預(yù)后的關(guān)系

我們利用GEPIA 網(wǎng)絡(luò)工具分析了TCGA 數(shù)據(jù)庫中的不同KDM6B表達(dá)水平的腎透明細(xì)胞癌患者的臨床分期和預(yù)后是否具有顯著差異。如圖2 A 所示,Ⅰ、Ⅱ期患者的KDM6B 表達(dá)水平顯著高于Ⅲ、Ⅳ期的患者;如圖2B及2C所示,KDM6B高表達(dá)的患者,總生存期和無病生存期均顯著高于低表達(dá)患者。這些結(jié)果說明KDM6B可能與腎透明細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)。

圖2 GEPIA 網(wǎng)站分析KDM6B表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌分期與預(yù)后的關(guān)系

三、小干擾RNA 轉(zhuǎn)染敲低KDM6B 的效率檢測

本研究分別從mRNA 表達(dá)水平與蛋白表達(dá)水平對小干擾RNA 轉(zhuǎn)染ACHN 和Caki-1細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行驗證。RT-q PCR 驗證ACHN 和Caki-1細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染小干擾RNA 后KDM6B 的mRNA表達(dá)水平,結(jié)果顯示在ACHN 和Caki-1細(xì)胞系中,與陰性對照組相比,轉(zhuǎn)染小干擾RNA 實驗組的KDM6B表達(dá)水平顯著降低(圖3 A)。我們還通過Wester n blot實驗驗證KDM6B蛋白水平的敲低效率,與mRNA 水平結(jié)果一致,轉(zhuǎn)染小干擾RNA 實驗組的KDM6B蛋白表達(dá)水平明顯比對照組低(P<0.05)(圖3B),這些結(jié)果表明小干擾RNA 轉(zhuǎn)染ACHN 和Caki-1細(xì)胞后有效地敲低了KDM6B 的表達(dá)。

圖3 小干擾RNA 可有效敲低腎癌細(xì)胞中KDM6B的表達(dá)

四、KDM6B基因敲低對ACHN 和Caki-1細(xì)胞增殖的影響

我們使用CCK8法檢測敲低KDM6B后不同時間點腫瘤細(xì)胞的活性驗證KDM6B對細(xì)胞增殖能力的影響,如圖4 A、B 所示,與對照組相比,敲低KDM6B實驗組中ACHN 和Caki-1細(xì)胞的增殖能力顯著增高(P<0.05)。如圖4C-D 所示,在ACHN 和Caki-1細(xì)胞系中敲低KDM6B后,與陰性對照組相比,敲低組中細(xì)胞克隆形成率明顯增多(P<0.05)。表明敲低KDM6B 后ACHN 和Caki-1細(xì)胞的克隆形成顯著增加。以上表明在腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞中敲低KDM6B可以有效促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖活性。

圖4 敲低KDM6B可以影響腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞增殖活性

五、KDM6B基因敲低對ACHN 和Caki-1細(xì)胞遷移侵襲的影響

我們使用Transwell實驗檢測敲低KDM6B后對細(xì)胞增殖能力的影響,如圖5 所示,與對照組相比,敲低KDM6B 實驗組中ACHN 和Caki-1 細(xì)胞的遷移和侵襲能力顯著增高(P<0.05)。表明KDM6B可以影響腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程,抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。

圖5 Trans well實驗檢測敲低KDM6B基因?qū)δI透明細(xì)胞癌細(xì)胞遷移侵襲能力的影響

六、KDM6B基因敲低可激活A(yù)CHN 和Caki-1細(xì)胞的絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated pr otein kinase,MAPK)信號通路

MAPK 通路是腫瘤的重要促癌信號通路,其中以細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶蛋白(extracellular signalregulated kinase,ERK)為特征蛋白的級聯(lián)反應(yīng)主要代表對生長因子和有絲分裂原的反應(yīng),從而有利于細(xì)胞的生長、分化和存活[14]。本研究中為了進(jìn)一步探究KDM6B作用于腎透明細(xì)胞癌的機(jī)制,我們通過Western Blot檢測了MAPK 信號通路激活指標(biāo)磷酸化ERK 的表達(dá)水平,結(jié)果顯示,在ACHN和Caki-1細(xì)胞系中,與對照組相比,敲低KDM6B后ERK 的活化形式磷酸化的細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶蛋白(phosphorylated extracellular signal-regulated kinase,p-ERK)的表達(dá)水平明顯增加,但總ERK表達(dá)的水平?jīng)]有明顯變化(圖6 A)。p-ERK 的表達(dá)水平極大的受其上游眾多絡(luò)氨酸激酶(Receptor tyr osine kinases,RTKs)表達(dá)的影響,因此我們檢測了ACHN 和Caki-1細(xì)胞系中KDM6B敲低后幾個常見的RTKs的表達(dá)變化,發(fā)現(xiàn)它們的表達(dá)水平在KDM6B 敲低后均有不同程度的上調(diào),說明KDM6B 可能是通過下調(diào)RTKs 的表達(dá)抑制MAPK 信號通路,進(jìn)而促進(jìn)癌細(xì)胞增殖(圖6B、C)。

圖6 敲低KDM6B激活腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞MAPK 信號通路活性

討 論

KDM6B是一種重要的組蛋白去甲基化酶,在炎癥、發(fā)育、衰老和癌癥等多種病理生理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[8]。有研究指出在非小細(xì)胞肺癌患者中,血清KDM6B mRNA 水平降低,并且隨著臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的增加,血清KDM6B mRNA 水平降低的趨勢更加明顯[13]。然而,KDM6B 也可以通過多種機(jī)制發(fā)揮癌基因的作用,包括促進(jìn)增殖、炎癥和細(xì)胞遷移,以及抑制細(xì)胞的分化和凋亡等。本研究結(jié)果表明,降低KDM6B 的表達(dá)會顯著增強(qiáng)cc RCC細(xì)胞的增殖和遷移能力;生物信息學(xué)分析和免疫組化實驗證實,在進(jìn)展期cc RCC 中,KDM6B 的表達(dá)明顯下降,提示患者預(yù)后不良。綜合本研究的實驗結(jié)果,KDM6B是影響cc RCC 患者臨床病理分期和長期預(yù)后的關(guān)鍵因素之一。檢測KDM6B表達(dá)水平可能成為預(yù)測患者預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物。

MAPK 通路通過一系列關(guān)鍵激酶傳遞細(xì)胞內(nèi)外信號[14]。MAPK 通路活化過程存在兩類經(jīng)典的級聯(lián)反應(yīng):以激活ERK 為特征的級聯(lián)反應(yīng),主要受到生長因子和有絲分裂原的調(diào)控,從而有利于細(xì)胞的生長、分化和存活。相反,以應(yīng)激活化蛋白激酶參與為主要特征的級聯(lián)反應(yīng),主要受到細(xì)胞應(yīng)激和炎癥刺激的激活,因此激活后有利于細(xì)胞出現(xiàn)分化、凋亡和炎癥反應(yīng)[15]。因此,本研究探究了KDM6B 對MAPK 通路活性的影響,并發(fā)現(xiàn)敲低KDM6B表達(dá)水平可顯著激活MAPK 通路活性。作為MAPK通路上游分子,RTKs 的表達(dá)水平直接影響到MAPK 通路的激活程度。為了深入研究KDM6B敲低激活MAPK 通路的具體機(jī)制,我們檢測了KDM6B敲低后RTKs的表達(dá)變化,結(jié)果顯示,在KDM6B敲低后,多種RTKs的mRNA 水平顯著升高。這表明KDM6B可能通過抑制RTKs表達(dá)來抑制MAPK 活性,從而驗證了其在cc RCC 中作為抑癌基因的作用機(jī)制。

綜上所述,本研究確認(rèn)了KDM6B 在腎透明細(xì)胞癌中作為一種重要的表觀遺傳修飾物,并與患者的疾病分期和預(yù)后密切相關(guān)。降低KDM6B表達(dá)后增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的增值和遷移侵襲能力,并激活了MAPK 信號通路。因此,本研究為腎透明細(xì)胞癌的預(yù)后提供了一個重要的新的生物標(biāo)志物和潛在治療的新靶點。