謝文亮 李明

膀胱癌是全球第十大常見癌癥,2020年全球185個(gè)國家約有573 278個(gè)新發(fā)病例和212 536個(gè)死亡病例[1]。非肌層浸潤性膀胱癌(non muscle-invasive bladder cancer,NMIBC)是膀胱癌的主要類型之一,占原發(fā)性膀胱癌的70%。經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)是目前治療NMIBC 的主要方法。然而,以往的研究表明,經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)后NMIBC 患者的5年復(fù)發(fā)率為31%～78%[2]。吉西他濱是NMIBC 患者術(shù)后的一線化療藥物,研究表明,NMIBC 患者行經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)后即刻行膀胱內(nèi)灌注吉西他濱藥物化療,可以降低5年復(fù)發(fā)率35%[3]。然而,長期的膀胱內(nèi)灌注化療會導(dǎo)致NMIBC患者對吉西他濱逐漸產(chǎn)生耐藥性,進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)。因此,探索導(dǎo)致NMIBC 患者對吉西他濱產(chǎn)生耐藥性的分子標(biāo)志物具有重要意義。本研究使用生物信息學(xué)分析的方法篩選出導(dǎo)致NMIBC患者對吉西他濱產(chǎn)生耐藥性的免疫相關(guān)核心基因,旨在提高對吉西他濱耐藥的NMIBC 患者的精準(zhǔn)治療水平。

對象與方法

一、數(shù)據(jù)收集

從高通量基因表達(dá)(gene expression o mnibus,GEO)數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nl m.nih.gov/geo)中獲得微陣列數(shù)據(jù)集GSE77883,該數(shù)據(jù)集包括3 個(gè)對吉西他濱耐藥的T24細(xì)胞系樣本和3個(gè)非吉西他濱耐藥的T24細(xì)胞系樣本。利用免疫學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析門戶網(wǎng)站 (https://www.i mmport.or g/ho me)和免疫互作和信號反應(yīng)數(shù)據(jù)庫(http://www.innatedb.com)獲得免疫基因。

二、數(shù)據(jù)分析

1.差異表達(dá)基因的篩選:利用GEO2R 工具獲取兩組樣本間的差異表達(dá)基因(differently expressed genes,DEGs)。以log FC>2和P<0.05作為篩選條件,篩選出兩組樣本間差異表達(dá)的上調(diào)基因;以log FC<2和P<0.05作為篩選條件,篩選出兩組樣本間差異表達(dá)的下調(diào)基因。

2.蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建:利用蛋白-蛋白相互作用數(shù)據(jù)庫(https://cn.string-db.org/)構(gòu)建DEGs的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)。用Cytoscape軟件對蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)中各個(gè)節(jié)點(diǎn)的連接度進(jìn)一步分析,以連接度大于10作為核心基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)。通過核心基因與免疫基因的交集獲取免疫相關(guān)核心基因。

3.功能注釋和富集分析:在注釋、可視化和綜合發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫(The database f or annotation,visualization and integrated discovery,DAVID) (https://david.ncifcrf.gov/)中使用基因本體論(Gene Ontology,GO)分析對基因進(jìn)行功能注釋,內(nèi)容包括生物過程、細(xì)胞成分以及分子功能。使用京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and geno mes,KEGG)分析進(jìn)行基因功能的富集分析。

4.生存分析:在基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)動態(tài)分析網(wǎng)站(Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA)(http://gepia.cancer-pku.cn/)上對免疫相關(guān)核心基因進(jìn)行生存分析。以P<0.05和95%CI作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。

5.免疫浸潤分析:在腫瘤免疫評估資源(Tu mor I mmune Esti mation Resource,TI MER)數(shù)據(jù)庫(http://ti mer.cistro me.org/)中對NMIBC的免疫浸潤進(jìn)行系統(tǒng)分析,評估六種類型的免疫細(xì)胞浸潤與免疫相關(guān)核心基因之間的關(guān)聯(lián)性。

三、免疫相關(guān)核心基因表達(dá)水平的驗(yàn)證

阿拉巴馬大學(xué)伯明翰分校癌癥數(shù)據(jù)分析門戶網(wǎng)站(The University of ALabama at Bir mingha m Cancer Data Analysis Portal,UALCAN)(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)包含癌癥基因組圖譜的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù),用于驗(yàn)證核心基因的mRNA 表達(dá)。使用該數(shù)據(jù)庫對免疫相關(guān)核心基因的表達(dá)水平進(jìn)行驗(yàn)證。

結(jié) 果

根據(jù)GEO2R 的分析結(jié)果,一共得到917個(gè)DEGs,包括375個(gè)上調(diào)基因和542個(gè)下調(diào)基因,然后通過STRING 數(shù)據(jù)庫和Cytoscape軟件對DEGs的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)中各個(gè)節(jié)點(diǎn)的連接度進(jìn)行分析,得到85個(gè)核心基因。再將免疫基因和核心基因相交集,最終篩選出24個(gè)免疫相關(guān)核心基因,其中包括10 個(gè) 上 調(diào) 基 因:IL6、TNF、ICA M1、CXCR、CSF2、BMP2、SYK、WNT5 A、RELB 和FGF1;14 個(gè) 下 調(diào) 基 因:CDC42、TLR4、CCL2、CCR7、ITGB2、TLR3、F2R、S1PR1、PDGFA、IL-33、TNFSF10、FABP4、ANGPTL4和CXCL5。

通過GO 分析表明,免疫相關(guān)核心基因主要富集在白細(xì)胞介素-6產(chǎn)生的正向調(diào)節(jié)(生物過程)、質(zhì)膜的整體成分(細(xì)胞成分)和腫瘤壞死因子受體結(jié)合(分子功能)。KEGG 富集分析結(jié)果顯示,免疫相關(guān)核心基因在細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用通路中明顯富集。

通過GEPIA 網(wǎng)站對24個(gè)免疫相關(guān)核心基因進(jìn)行生存分 析,分析結(jié) 果 表 明S1PR1、IL33 和FGF1 與NMIBC 總 體生存密切相關(guān)。

基于TI MER 數(shù)據(jù)庫,本研究分析了3個(gè)與生存最為相關(guān)的免疫相關(guān)核心基因和免疫細(xì)胞浸潤之間的關(guān)系。結(jié)果顯示,1-磷酸鞘氨醇Ⅰ型受體(sphingosine-1-phosphate typeⅠreceptor,S1PR1)的表達(dá)與不同的浸潤性免疫細(xì)胞類型呈正相關(guān),包括CD4+T 細(xì)胞(r=0.101,P=0.054)、中性粒細(xì)胞(r=0.204,P<0.001)和樹突狀細(xì)胞(r=0.050,P<0.001),CD8+T 細(xì) 胞(r=0.135,P=0.009),B 細(xì) 胞(r=0.123,P=0.019),與巨噬細(xì)胞(r=0.340,P<0.001)強(qiáng)烈相關(guān);白介素33(interleukin-33,IL-33)的表達(dá)與CD8+T 細(xì)胞(r=0.109,P=0.038)、CD4+T 細(xì) 胞(r=0.114,P=0.029)、樹突狀細(xì)胞(r=0.025,P=0.628)、巨噬細(xì)胞(r=0.120,P=0.022)呈正相關(guān),與中性粒細(xì)胞(r=0.210,P<0.001)強(qiáng)烈相關(guān);成纖維細(xì)胞生長因子1(fibroblast growth factor 1,FGF1)的表達(dá)與CD8+T 細(xì)胞(r=0.237,P<0.001)、CD4+T 細(xì)胞(r=0.194,P<0.001)、樹突狀細(xì)胞(r=0.213,P<0.001)、中性粒細(xì)胞(r=0.264,P<0.001)呈正相關(guān),與巨噬細(xì)胞(r=0.368,P<0.001)強(qiáng)烈相關(guān)。

使用UALCAN 數(shù)據(jù)庫分析驗(yàn)證免疫相關(guān)核心基因的表達(dá)水平, 其中包含了19 個(gè)正常樣本和22 個(gè)NMIBC 樣本。分析結(jié)果顯示,NMIBC 組織中FGF1、S1PR1 和IL-33的mRNA 表達(dá)水平均顯著高于正常樣本(P<0.05)。

討 論

吉西他濱是一種脫氧胞苷核苷類似物,其主要作用是通過抑制DNA 的合成來抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。NMIBC 患者行經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)后即刻行膀胱內(nèi)灌注吉西他濱可降低腫瘤復(fù)發(fā)率,但其缺點(diǎn)是腫瘤細(xì)胞易對吉西他濱產(chǎn)生耐藥性。目前大多數(shù)NMIBC患者因發(fā)生化療藥物耐藥而導(dǎo)致病情進(jìn)展甚至死亡,對于耐藥的分子機(jī)制仍不清楚。本研究通過生物信息學(xué)分析的方法探索NMIBC患者對吉西他濱產(chǎn)生耐藥性的機(jī)制,篩選NMIBC 患者對吉西他濱產(chǎn)生耐藥性的免疫相關(guān)核心基因。

根據(jù)綜合性分析結(jié)果,本研究共獲得了24個(gè)與免疫相關(guān)的核心基因。GO 和KEGG 富集分析表明,這些基因主要富集在白細(xì)胞介素-6產(chǎn)生的正向調(diào)節(jié)、質(zhì)膜的整體成分、腫瘤壞死因子受體結(jié)合和細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用通路等方面。生存分析結(jié)果表明,其中的3個(gè)免疫相關(guān)核心基因:S1PR1、IL-33和FGF1均與NMIBC 的生存預(yù)后密切相關(guān),它們可能在吉西他濱耐藥的NMIBC進(jìn)展中發(fā)揮了作用。在查閱文獻(xiàn)時(shí)筆者了解到Song等[4]對吉西他濱耐藥的膀胱癌進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,但他們的研究主要針對MIBC 患者。本研究從NMIBC患者的角度出發(fā),通過生物信息學(xué)分析確定NMIBC患者對吉西他濱產(chǎn)生耐藥的免疫標(biāo)志物。

S1PR1是一種鞘氨醇-1-磷酸的細(xì)胞表面受體,其通過刺激腫瘤細(xì)胞的血管生成、擴(kuò)張、生長和轉(zhuǎn)移來促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[5]。S1PR1是體內(nèi)免疫細(xì)胞功能的重要調(diào)節(jié)因子,并在腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞中發(fā)揮關(guān)鍵作用[6]。鞘氨醇-1-磷酸與巨噬細(xì)胞上的S1PR1偶聯(lián)促進(jìn)血管生成巨噬細(xì)胞表型,這是許多實(shí)體腫瘤中腫瘤浸潤性免疫細(xì)胞的主要成分[7]。Go等[8]研究發(fā)現(xiàn),S1PR1的過表達(dá)與NMIBC 中較差的臨床病理學(xué)特征、P53表達(dá)以及STAT3激活有關(guān)。Lankadasari等[9]研究表明,在吉西他濱耐藥的胰腺癌細(xì)胞中檢測到S1PR1 表達(dá)增加。抑制S1PR1/STAT3信號通路,能夠提高胰腺癌細(xì)胞對吉西他濱的敏感性。然而,需要進(jìn)一步的研究證實(shí)S1PR1在吉西他濱耐藥的NMIBC中是否有同樣的作用。

化療藥物耐藥和腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)被認(rèn)為是癌癥患者死亡的主要原因。已有研究表明,IL-33的表達(dá)可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性。研究人員發(fā)現(xiàn),與對照組相比,腫瘤細(xì)胞中IL-33基因的敲除顯著降低了腫瘤細(xì)胞對化療藥物的耐藥性。其可能的機(jī)制是IL-33表達(dá)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞向多倍體巨細(xì)胞轉(zhuǎn)化,導(dǎo)致P53失活、細(xì)胞周期異常和細(xì)胞分裂缺失所致[10]。這提示IL-33可能通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化來誘導(dǎo)NMIBC患者對吉西他濱的耐藥性。

FGF1 及其受體在許多腫瘤中都存在過表達(dá),基于FGF1在組織再生和炎癥過程中的重要作用,人們對FGF1信號在惡性腫瘤中的作用進(jìn)行了廣泛的研究[11]。Kostas等[12]研究發(fā)現(xiàn),FGF1通過阻止細(xì)胞凋亡來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖,其可能的機(jī)制是FGF1 通過細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移到胞漿和細(xì)胞核,激活下游的信號通路。Manousakidi等[13]研究發(fā)現(xiàn),FGF1過表達(dá)誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞對化療藥物的產(chǎn)生耐藥性,其具體的機(jī)制是過表達(dá)的FGF1通過降低線粒體中P53的表達(dá)水平發(fā)揮抗腫瘤細(xì)胞凋亡作用。這提示FGF1 可能通過降低線粒體中P53的表達(dá)水平來誘導(dǎo)NMIBC 細(xì)胞對吉西他濱的耐藥性。P53突變是膀胱癌中研究最廣泛的基因之一,已被報(bào)道與腫瘤進(jìn)展和化療敏感性有關(guān)[14-15]。P53位于染色體17p13.1上,主要參與細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控。有研究表明,P53免疫陰性的T1期膀胱癌患者的術(shù)后復(fù)發(fā)率為7%,而P53免疫陽性的T1期膀胱癌患者的術(shù)后復(fù)發(fā)率為62%[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn),免疫相關(guān)的核心基因S1PR1、IL-33和FGF1均與P53在NMIBC中的作用密切相關(guān)。

綜上所述,本研究推測S1PR1、IL-33和FGF1可能是導(dǎo)致NMIBC患者對吉西他濱產(chǎn)生耐藥性的免疫相關(guān)核心基因,并發(fā)現(xiàn)它們與P53 的作用密切相關(guān)。S1PR1、IL-33 和FGF1可被視為未來治療對吉西他濱耐藥的NMIBC 的潛在靶點(diǎn)。然而,S1PR1、IL-33 和FGF1 導(dǎo)致NMIBC 患者對吉西他濱產(chǎn)生耐藥性的相關(guān)機(jī)制仍需進(jìn)一步的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)來研究和證實(shí)。