羅錕 王智 王柯

基金項目：武漢市中醫(yī)藥科研項目（WZ22C62）

作者單位：武漢市中醫(yī)醫(yī)院骨傷科（郵編430014）

作者簡介：羅錕（1984），男，主治醫(yī)師，主要從事中醫(yī)骨傷方面研究。E-mail：350644108@qq.com

△通信作者 E-mail：826969050@qq.com

摘要：目的 探討山姜素（APT）調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子/鞘氨醇激酶1/1磷酸鞘氨醇（VEGF/SphK1/S1P）信號通路對膝骨關(guān)節(jié)炎（KOA）大鼠血管生成的影響。方法 采用改良的Videman法構(gòu)建KOA大鼠模型，將90只大鼠分為對照組（Control組）、模型組（Model組）、山姜素低劑量組（L-APT組）、山姜素高劑量組（H-APT組）、山姜素高劑量組+慢病毒陰性對照組（APT+NC組）、山姜素高劑量組+過表達(dá)SphK1慢病毒組（APT+SphK1組），每組15只。HE染色觀察大鼠軟骨組織病理變化；酶聯(lián)免疫吸附試驗測定軟骨組織白細(xì)胞介素（IL）-1β、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、IL-6、基質(zhì)金屬蛋白酶-13（MMP-13）水平；TUNEL檢測軟骨組織細(xì)胞凋亡情況；免疫組化檢測血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、CD31蛋白表達(dá)情況；Western blot檢測血管內(nèi)皮生長因子受體2（VEGFR2）、磷酸化VEGFR2（p-VEGFR2）、SphK1、S1P蛋白水平。結(jié)果 與Control組比較，Model組大鼠出現(xiàn)病理損傷，細(xì)胞凋亡率、IL-1β、TNF-α、IL-6、MMP-13、VEGF陽性表達(dá)、CD31陽性表達(dá)和p-VEGFR2、SphK1、S1P蛋白表達(dá)水平增加（P＜0.05）；與Model組比較，L-APT組、H-APT組病理損傷明顯減輕，細(xì)胞凋亡率、IL-1β、TNF-α、IL-6、MMP-13、VEGF陽性表達(dá)、CD31陽性表達(dá)和p-VEGFR2、SphK1、S1P蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與APT+NC組比較，APT+SphK1組軟骨組織病理損傷加重，細(xì)胞凋亡率、IL-1β、TNF-α、IL-6、MMP-13、VEGF陽性表達(dá)、CD31陽性表達(dá)和p-VEGFR2、SphK1、S1P蛋白表達(dá)水平增加（P＜0.05）。結(jié)論 APT通過抑制VEGF/SphK1/S1P信號通路抑制KOA大鼠血管生成。

關(guān)鍵詞：骨關(guān)節(jié)炎，膝；新生血管化，病理性；血管內(nèi)皮生長因子類；山姜素；鞘氨醇激酶1；1磷酸鞘氨醇

中圖分類號：R684.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOI：10.11958/20230892

Impacts of alpinetin on angiogenesis in knee osteoarthritis rats by regulating the

VEGF/SphK1/S1P signaling pathway

LUO Kun， WANG Zhi， WANG Ke△

Department of Orthopedics and Traumatology， Wuhan Hospital of Traditional Chinese Medicine， Wuhan 430014， China

△Corresponding Author E-mail： 826969050@qq.com

Abstract： Objective To investigate effects of alpinetin （APT） on angiogenesis in knee osteoarthritis （KOA） rats by regulating vascular endothelial growth factor/sphingosine kinase 1/sphingosine 1 phosphate （VEGF/SphK1/S1P） signaling pathway. Methods The KOA rat model was established by Videman method. Ninety rats were grouped into the control group， the model group， the low-dose kaempferol group （L-APT group）， the high-dose kaempferol group （H-APT group）， the high-dose kaempferol group+lentivirus negative control group （APT+NC group） and high-dose kaempferol+overexpression of SphK1 lentivirus group （APT+SphK1 group）， with 15 rats in each group. Pathological changes of cartilage tissue in rats were observed by HE staining. Contents of IL-1β， TNF-α， IL-6 and MMP-13 in cartilage tissue were measured by enzyme linked immunosorbent assay. Chondrocyte apoptosis of cartilage tissue cells was detected by TUNEL. VEGF and CD31 protein positive expression levels were detected by immunohistochemistry assay. The p-VEGFR2， VEGFR2， SphK1 and S1P protein levels were detected by Western blot assay. Results Rats in the model group showed pathological damage. Compared with the control group， the apoptosis rate， IL-1b， TNF-a， IL-6， MMP-13 levels， VEGF positive expression， CD31 positive expression， p-VEGFR2， SphK1 and S1P protein expression levels were increased in the model group （P＜0.05）. Compared with the model group， the pathological damage was obviously reduced in the L-APT group and the M-APT group， and cell apoptosis rate， IL-1β， TNF-α， IL-6， MMP-13 levels， VEGF positive expression， CD31 positive expression， p-VEGFR2， SphK1 and S1P protein expression levels were obviously reduced （P＜0.05）. Compared with the APT+NC group， the pathological injury of cartilage tissue increased in the APT+SphK1 group， cell apoptosis rate， IL-1β， TNF-α， IL-6， MMP-13 levels， VEGF positive expression， CD31 positive expression， p-VEGFR2， SphK1 and S1P protein expression levels were obviously increased （P＜0.05）. Conclusion APT inhibits angiogenesis in knee osteoarthritis rats by inhibiting the VEGF/SphK1/S1P signaling pathway.

Key words： osteoarthritis， knee; neovascularization， pathologic; vascular endothelial growth factors; alpinetin; sphingosine kinase 1; sphingosine 1 phosphate

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種膝關(guān)節(jié)退行性疾病，以軟骨退變?yōu)橹饕±硖卣鳎?］。KOA主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、僵硬，伴功能障礙及血管生成因子增多，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量［2］。目前，KOA早期治療以非甾體類抗炎藥為主，但其臨床效果不佳，易復(fù)發(fā)［3］。由于KOA是一種慢性病，需要長期治療，因此尋找安全有效的藥物至關(guān)重要。山姜素（APT）是一種天然類黃酮，是傳統(tǒng)藥用植物草豆蔻的主要活性成分，具有抗腫瘤、抗氧化、抗風(fēng)濕、鎮(zhèn)痛和利膽等作用［4］。研究表明，APT可改善冠心病大鼠血管內(nèi)皮功能［5］。在四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)的肝纖維化中，APT可通過激活核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid-2-related factor 2，Nrf2）通路和抑制Nod樣受體蛋白3（Nod-like receptor pyrin domain3，NLRP3）通路發(fā)揮抗炎、抗氧化和抗血管生成作用［6］。APT還可通過減輕骨關(guān)節(jié)炎的核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear transciption factor kappa B，NF-κB）/胞外信號調(diào)控激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）途徑保護(hù)軟骨細(xì)胞并表現(xiàn)出抗炎作用［7］。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）主要由成纖維樣滑膜細(xì)胞（fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS）分泌，在KOA的軟骨中大量表達(dá)［8］。1磷酸鞘氨醇（sphingosine 1 phosphate，S1P）是體內(nèi)主要的鞘脂分子，是鞘氨醇激酶1（sphingosine kinase 1，SphK1）活化的產(chǎn)物，具有廣泛的生物活性［9］。據(jù)報道，VEGF可通過Ser 225磷酸化激活SphK1［10］，而抑制VEGF/SphK1/S1P途徑能減輕類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中體內(nèi)和體外血管生成［11］。然而，APT對KOA大鼠抗血管生成的作用是否由VEGF/SphK1/S1P信號通路介導(dǎo)尚不清楚。本研究旨在構(gòu)建KOA大鼠模型，探討APT對KOA大鼠血管生成和VEGF/SphK1/S1P信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 APT（純度≥98%）購自成都樂美天醫(yī)藥科技有限公司；白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis fctor-alpha，TNF-α）、基質(zhì)金屬蛋白酶-13（matrix metalloproteinase-13，MMP-13）酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；蘇木素伊紅（hematoxylin eosin，HE）染色試劑盒、原位末端標(biāo)記（TdT- mediated dUTP nick and labeling，TUNEL）染色試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；VEGF、血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子（platelet endothelial cell adhesion molecule，CD31）購自Santa Cruz Biotechnology；兔源抗大鼠血管內(nèi)皮生長因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）、磷酸化VEGFR2（p-VEGFR2）一抗購自英國Abcam公司；兔源抗SphK1、S1P一抗購自上海賽信通生物試劑有限公司。光學(xué)顯微鏡、熒光倒置顯微鏡（日本Nikon公司），多功能酶標(biāo)儀（賽默飛世爾科技）。

1.2 實驗動物 無特定病原體（SPF）級雄性SD大鼠90只，6～7周齡，體質(zhì)量（200±20） g，購自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號：SYXK（鄂）2019—0106。所有大鼠在本院動物中心按SPF級標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)于溫度（22±2）℃、光照/黑暗交替12 h環(huán)境（動物使用許可證號：22031524），期間自由飲水和進(jìn)食。遵循中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部頒行的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》處置動物。本研究得到本院倫理委員會的批準(zhǔn)（批號：2022-0916）。

1.3 研究方法

1.3.1 KOA大鼠模型建立 將大鼠分為對照（Control）組、模型（Model）組、山姜素低劑量（L-APT）組、山姜素高劑量（H-APT）組、山姜素高劑量組+慢病毒陰性對照（APT+NC）組、山姜素高劑量組+過表達(dá)SphK1慢病毒（APT+SphK1）組，每組15只。除Control組外，采用改良的Videman法構(gòu)建KOA大鼠模型［12］，大鼠均造模成功。L-APT組、H-APT組膝關(guān)節(jié)內(nèi)分別注射10、20 mmol/L山姜素［7］，1次/周，持續(xù)3周；APT+NC組膝關(guān)節(jié)內(nèi)注射200 mL慢病毒空載體（1×109 TU/mL）和20 mmol/L的APT；APT+SphK1組膝關(guān)節(jié)內(nèi)注射200 mL過表達(dá)SphK1慢病毒載體（1×109 TU/mL）和20 mmol/L的APT；Control組和Model組常規(guī)飼養(yǎng)，不進(jìn)行任何干預(yù)處理。

1.3.2 取材 干預(yù)后3周，各組大鼠3%戊巴比妥鈉溶液（30 mg/kg）腹腔注射麻醉并處死，剪斷股骨、脛骨1/2處骨干，取大鼠完整左膝關(guān)節(jié)，除去關(guān)節(jié)囊外多余軟組織后，用4%多聚甲醛固定，制作石蠟切片。

1.3.3 HE染色觀察大鼠KOA軟骨組織病理變化 各組取出5只大鼠的膝骨關(guān)節(jié)軟骨組織，石蠟包埋，5 μm切片，HE染色，顯微鏡下觀察各軟骨組織病理變化。

1.3.4 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡 取各組5只大鼠的軟骨組織，石蠟包埋，5 μm切片，用3% H2O2和蛋白酶K處理后，加入TUNEL試劑，室溫下處理1 h，DAB顯色，蘇木精反染。凋亡陽性細(xì)胞為細(xì)胞核被染成棕黃色顆粒，隨機(jī)讀取5個視野觀察TUNEL陽性細(xì)胞；TUNEL陽性細(xì)胞（%）=陽性細(xì)胞/DAPI個數(shù)×100%。

1.3.5 ELISA檢測軟骨組織中炎性因子表達(dá) 參照ELISA試劑盒說明書，測定各組大鼠軟骨組織中IL-1β、TNF-α、IL-6、MMP-13水平，酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處光密度（OD）值，參照試劑盒說明書做標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算各炎性因子表達(dá)水平。

1.3.6 免疫組化染色實驗檢測VEGF和CD31陽性表達(dá) 取1.3.3中大鼠軟骨組織石蠟切片，經(jīng)二甲苯脫蠟，乙醇水化后在10 nmol/L檸檬酸緩沖液中熱修復(fù)10 min，3% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，加入VEGF（1∶250）、CD31（1∶50）抗體，4 ℃孵育過夜，加入HRP偶聯(lián)的IgG二抗（1∶1 000），室溫孵育2 h后用DAB檢測，各組隨機(jī)讀取5個視野，顯微鏡觀察拍照。VEGF和CD31陽性表達(dá)為細(xì)胞質(zhì)被染成黃色或棕黃色，Image J 1.8.0軟件計算VEGF和CD31陽性表達(dá)。陽性表達(dá)百分比=目的蛋白陽性表達(dá)面積/視野面積×100%。

1.3.7 Western blot檢測p-VEGFR2、VEGFR2、SphK1、S1P蛋白表達(dá) 從各組軟骨組織中提取總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度，SDS-PAGE轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉阻斷2 h，加入一抗p-VEGFR2（1∶1 000）、VEGFR2（1∶1 000）、SphK1（1∶1 000）、S1P（1∶2 000），4 ℃過夜，TBST沖洗，加入HRP偶聯(lián)的二抗（1∶2 000），室溫下靜置1.5 h，ECL反應(yīng)，凝膠成像，以β-actin為內(nèi)參，Image J軟件計算各蛋白相對表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以[x] ±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠KOA軟骨組織病理變化 Control組大鼠軟骨組織結(jié)構(gòu)正常，層次分明，軟骨細(xì)胞排列整齊；Model組大鼠軟骨組織結(jié)構(gòu)被破壞，軟骨層變薄且粗糙，軟骨細(xì)胞排列紊亂，有大量炎性細(xì)胞浸潤，小血管增多；與Model組比較，L-APT、H-APT組大鼠軟骨組織結(jié)構(gòu)相對完整清晰，軟骨細(xì)胞排列相對整齊，血管生成和炎性細(xì)胞浸潤明顯減少；與APT+NC組比較，APT+SphK1組軟骨組織病理損傷加重，見圖1。

2.2 各組大鼠軟骨細(xì)胞凋亡水平比較 Control組、Model組、L-APT組、H-APT組、APT+NC組、APT+SphK1組的軟骨細(xì)胞凋亡率（%）分別為3.37±0.35、45.10±3.69、36.23±2.33、24.47±1.85、22.60±1.64、32.53±2.12，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（n=5，F(xiàn)=206.887，P＜0.01）。與Control組比較，Model組軟骨組織細(xì)胞凋亡增加（P＜0.05）；與Model組比較，L-APT、H-APT組軟骨組織細(xì)胞凋亡降低，H-APT組降低效果更明顯（P＜0.05）；與APT+NC組比較，APT+SphK1組軟骨組織細(xì)胞凋亡增加（P＜0.05），見圖2。

2.3 各組大鼠軟骨組織中炎性因子比較 與Control組比較，Model組大鼠軟骨組織中IL-1β、TNF-α、IL-6和MMP-13水平增加（P＜0.05）；與Model組比較，L-APT、H-APT組大鼠IL-1β、TNF-α、IL-6和MMP-13水平降低，H-APT組降低效果更明顯（P＜0.05）；與APT+NC組比較，APT+SphK1組大鼠IL-1β、TNF-α、IL-6和MMP-13水平增加（P＜0.05），見表1。

2.4 各組大鼠滑膜組織中VEGF、CD31陽性表達(dá)比較 與Control組比較，Model組大鼠VEGF、CD31陽性表達(dá)增加（P＜0.05）；與Model組比較，L-APT、H-APT組大鼠VEGF、CD31陽性表達(dá)降低，且H-APT組降低效果更明顯（P＜0.05）；與APT+NC組比較，APT+SphK1組大鼠VEGF、CD31陽性表達(dá)增加（P＜0.05），見表2、圖3。

2.5 各組大鼠軟骨組織中相關(guān)蛋白表達(dá) 與Control組比較，Model組大鼠p-VEGFR2、SphK1、S1P表達(dá)水平增加（P＜0.05）；與Model組比較，L-APT、H-APT組p-VEGFR2、SphK1、S1P表達(dá)水平降低，且H-APT組降低效果更明顯（P＜0.05）；與APT+NC組比較，APT+SphK1組p-VEGFR2、SphK1、S1P表達(dá)水平增加（P＜0.05），見圖4、表3。

3 討論

臨床上治療KOA的方法多以緩解癥狀、改善關(guān)節(jié)功能為主，但KOA的發(fā)病機(jī)制和病因尚不明確，各治療方案的療效有限。因此，明確KOA的病理機(jī)制對尋找治療KOA途徑具有重要意義。

血管生成是指從原有的血管結(jié)構(gòu)中產(chǎn)生的新血管，在KOA進(jìn)程中主要表現(xiàn)為滑膜、軟骨和軟骨下骨病變［13］。相關(guān)研究表明，正常軟骨中沒有血管存在，而發(fā)生KOA時，血管生成數(shù)明顯增多［14］。炎癥反應(yīng)是KOA的病理特征之一，軟骨組織中MMP-13的分泌及炎性因子的釋放可引起軟骨損傷，刺激血管生成，而新生血管又反過來促進(jìn)炎癥發(fā)生，抑制KOA大鼠血管生成的同時，可抑制IL-1β、TNF-α、IL-6等炎性因子的釋放［15-16］。本研究結(jié)果顯示，Model組軟骨組織中大量炎性細(xì)胞浸潤和小血管較Control組增多，炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-6、MMP-13水平升高，血管因子VEGF、CD31陽性表達(dá)增加，提示炎癥和血管形成與KOA有關(guān)。

APT具有緩解骨關(guān)節(jié)炎的作用。在LPS誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞損傷中，APT能減輕軟骨細(xì)胞炎癥損傷，促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖［17］。另有研究顯示，山姜素可用作類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎治療的候選藥物［18］。因而，筆者推測APT有助于緩解KOA。本研究結(jié)果亦顯示，與Model組比較，L-APT組和H-APT組大鼠軟骨組織病理變化明顯減輕，軟骨組織中IL-1β、TNF-α、IL-6、MMP-13水平和細(xì)胞凋亡率明顯降低，提示APT可通過抑制軟骨組織炎性因子釋放和細(xì)胞凋亡來緩解KOA。VEGF是血管生成的標(biāo)志性調(diào)節(jié)因子。相關(guān)研究表明，KOA患者軟骨細(xì)胞中VEGF高度表達(dá)，并與KOA嚴(yán)重程度相關(guān)，抑制VEGF表達(dá)可延緩KOA進(jìn)展［19］。此外，VEGFR2是VEGF的受體之一，參與血管生成的整個過程，激活VEGF/VEGFR2可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移，以及血管的形成和通透性增加，進(jìn)而加速關(guān)節(jié)炎進(jìn)展［20］。本研究結(jié)果表明，APT可抑制促血管生成因子VEGF、CD31陽性表達(dá)及p-VEGFR2蛋白表達(dá)，提示APT可抑制KOA大鼠血管生成，減輕KOA，在KOA緩解中具有很好的前景。

S1P是一種生物活性鞘脂，具有通過激活細(xì)胞表面受體或細(xì)胞內(nèi)介質(zhì)來傳遞多種功能的作用，如細(xì)胞增殖、遷移、炎性細(xì)胞浸潤、血管生成和自身免疫［21］。SphK1是體內(nèi)催化鞘氨醇轉(zhuǎn)化為血管生成因子S1P的關(guān)鍵酶，其表達(dá)水平與KOA的發(fā)生密切相關(guān)［22］。研究表明，抑制SphK1/S1P途徑可抑制細(xì)胞增殖活性、遷移能力和管生成能力［23］。激活SphK1/S1P會增加炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生，敲低SphK1表達(dá)可減少膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎小鼠踝關(guān)節(jié)的血管生成、關(guān)節(jié)腫脹和軟骨侵蝕［24］。本研究結(jié)果顯示，Model組大鼠較Control組SphK1、S1P表達(dá)水平升高，表明KOA大鼠SphK1/S1P通路被激活；給予APT干預(yù)后，KOA大鼠軟骨組織中SphK1/S1P相關(guān)蛋白表達(dá)水平降低，且在使用APT的基礎(chǔ)上，加用SphK1過表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染可促進(jìn)VEGF/SphK1/S1P信號通路，加重KOA大鼠軟骨病理損傷，表明APT可能通過抑制VEGF/SphK1/S1P信號通路活化，從而抑制KOA大鼠血管形成，緩解病情進(jìn)展。

綜上所述，APT通過抑制VEGF/SphK1/S1P信號通路活化，從而抑制KOA大鼠血管形成，但本研究未能加入陽性藥分析APT對膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠的藥效學(xué)，且未能深入分析VEGF/SphK1/S1P信號通路在APT抑制膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠血管形成中的具體作用機(jī)制，后續(xù)有待進(jìn)一步深入研究。

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（2023-06-13收稿 2023-08-31修回）

（本文編輯 陸榮展）