封 韜,付 堃,張智慧,蘆小單,高 鵬

(1.吉林省人民醫(yī)院血液科,吉林 長(zhǎng)春 130021;2.吉林省人民醫(yī)院精準(zhǔn)分子醫(yī)學(xué)中心,吉林 長(zhǎng)春 130021)

血液病尤其是惡性血液病患者,由于腫瘤細(xì)胞惡性克隆性增生、骨髓正常造血功能被抑制、免疫細(xì)胞功能受抑等原因,病程中常伴隨感染、出血、肺部彌漫性損傷及多器官功能障礙等嚴(yán)重并發(fā)癥。其中感染是導(dǎo)致病情加重甚至死亡的主要原因之一[1]。此外,患者接受化療、使用糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑等治療措施,可導(dǎo)致病人黏膜免疫屏障受損,免疫細(xì)胞功能受抑進(jìn)一步加劇,因此惡性血液病患者的感染發(fā)病率較高,甚至導(dǎo)致死亡。血液病合并感染可發(fā)生于任何組織器官,以肺部、血液、口腔及肛周最為常見(jiàn),主要病原微生物包括細(xì)菌、真菌及病毒等。病原微生物通過(guò)各種途徑進(jìn)入血液循環(huán),可導(dǎo)致血流感染,甚至可引起感染性休克、彌散性血管內(nèi)凝血、多臟器功能衰竭乃至死亡[2]。

宏基因組二代測(cè)序(metagenomic next-generation sequencing, mNGS)是精確診斷感染的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)力,可一次性對(duì)數(shù)百萬(wàn)甚至千萬(wàn)個(gè)DNA序列進(jìn)行測(cè)序,對(duì)DNA的序列分子進(jìn)行讀取,獲得豐富的遺傳學(xué)信息的同時(shí),還可大大降低測(cè)序費(fèi)用、縮短測(cè)序時(shí)間,一次檢測(cè)大量靶基因[3]。此外,mNGS涵蓋耐藥基因檢測(cè),可以在檢出病原體的同時(shí)提示其可能存在的耐藥性,指導(dǎo)臨床合理選擇敏感抗生素[4]。本研究對(duì)血液病合并感染患者的傳統(tǒng)病原體檢測(cè)結(jié)果和mNGS檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較,探討mNGS檢測(cè)對(duì)血液病合并感染在診療及臨床用藥等方面的優(yōu)勢(shì)及臨床應(yīng)用價(jià)值,為血液病患者感染類(lèi)疾病的診斷提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2021年8月至2022年12月吉林省人民醫(yī)院血液科血液病合并感染患者作為研究對(duì)象,根據(jù)研究需要納入患者20例,納入標(biāo)準(zhǔn)為:(1)依據(jù)MICM分型、病理學(xué)等實(shí)驗(yàn)室檢查,明確診斷為血液系統(tǒng)疾病的患者,腫瘤性疾病優(yōu)先;(2)住院期間出現(xiàn)持續(xù)或間斷發(fā)熱、臨床診斷為病原微生物感染、常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)病原菌并給予經(jīng)驗(yàn)性抗生素治療后療效欠佳者,送檢標(biāo)本行mNGS檢測(cè)。排除標(biāo)準(zhǔn)為:(1)未明確診斷血液惡性腫瘤或伴有其他惡性腫瘤疾病患者;(2)生命體征不穩(wěn)定或心肺功能不全的患者;(3)無(wú)常規(guī)實(shí)驗(yàn)室病原體檢測(cè)結(jié)果的患者。

1.2 方法

宏基因組測(cè)序:(1)總DNA提取及DNA文庫(kù)構(gòu)建:應(yīng)用自動(dòng)化提取建庫(kù)儀制備文庫(kù),采用熒光定量PCR進(jìn)行文庫(kù)定量;(2)上機(jī)測(cè)序:應(yīng)用NextSeq CN500測(cè)序儀(美國(guó)Illumina公司)對(duì)構(gòu)建好的DNA文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序;(3)生物信息學(xué)分析:對(duì)讀取的文庫(kù)序列數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析,過(guò)濾其中的人類(lèi)基因組序列數(shù)據(jù),將其余序列數(shù)據(jù)與微生物參考數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),從而確定病原體物種及其相對(duì)豐度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,單因素分析采用卡方檢驗(yàn),P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 研究結(jié)果

2.1 臨床特征

共納入患者20例,其中男性8例,女性12例,中位年齡為53.5歲。血液病類(lèi)型包括:骨髓增生異常綜合征1例,急性髓系白血病6例,急性淋巴細(xì)胞白血病2例,再生障礙性貧血3例,淋巴瘤2例,免疫性血小板減少癥1例,骨髓纖維化2例,自身免疫性溶血性貧血1例,不明原因貧血2例。標(biāo)本送檢前所有患者均出現(xiàn)不同程度發(fā)熱、血常規(guī)及其他感染指標(biāo)異常、懷疑嚴(yán)重感染且經(jīng)驗(yàn)性抗感染治療效果不佳等狀況。

2.2 mNGS與常規(guī)檢測(cè)方法結(jié)果的比較及治療轉(zhuǎn)歸

在20例出現(xiàn)感染的患者中,16例(80%)患者的mNGS結(jié)果呈陽(yáng)性,4例(20%)呈陰性;3例(15%)患者的傳統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性,17例(85%)患者檢測(cè)結(jié)果呈陰性,說(shuō)明mNGS陽(yáng)性檢出率大于傳統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果(P<0.05)。其中3例mNGS結(jié)果與傳統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性,13例僅mNGS結(jié)果呈陽(yáng)性,4例mNGS結(jié)果與傳統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果均為陰性,兩種檢測(cè)方法的一致性較差(P>0.05)。

患者入院時(shí),依據(jù)病史、臨床表征以及常規(guī)檢測(cè)結(jié)果,臨床給予基礎(chǔ)經(jīng)驗(yàn)性抗感染治療。mNGS檢測(cè)結(jié)果回報(bào)后,臨床依據(jù)檢測(cè)結(jié)果調(diào)整用藥方案,最終12名患者明顯好轉(zhuǎn),8名患者死亡?；厮莘治霭l(fā)現(xiàn),在感染早期進(jìn)行mNGS的檢測(cè),對(duì)改善患者預(yù)后、提高生存率具有重要意義。

2.3 mNGS 與常規(guī)檢測(cè)方法結(jié)果的病原體分布比較

在20例患者中,mNGS直接檢出病原菌16例,未檢出4例,其中單純細(xì)菌感染3例(18.8%)、單純真菌感染1例(6.2%)、單純病毒感染4例(25%)、兩種以上感染8例(50%)。mNGS檢測(cè)出病原菌的16例中,檢出細(xì)菌12種、真菌8種、病毒7種。通過(guò)傳統(tǒng)檢測(cè)血培養(yǎng)檢出病原菌3例, 未檢出17例,其中細(xì)菌3種、真菌1種、病毒0種,兩種檢測(cè)方法的病原體檢出結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 兩種檢測(cè)方法檢出病原菌種例數(shù)

檢出率最高的為細(xì)菌類(lèi)(44.5%),其次為真菌類(lèi)(29.6%),檢出率最低的是病毒類(lèi)(25.9%),細(xì)菌類(lèi)銅綠假單胞菌的檢出率較高,其他菌株種類(lèi)較分散;真菌類(lèi)煙曲霉檢出率較高,其次為黃曲霉和白色念珠菌、耶氏肺孢子菌;病毒中以人皰疹病毒4型、人皰疹病毒5型最常見(jiàn)。

2.4 不同樣本的mNGS檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性率比較

采用mNGS檢測(cè)肺泡灌洗液、痰液、組織的陽(yáng)性率為100%,而血樣本的陽(yáng)性率為55%,相較于肺泡灌洗液、痰液、組織等局部標(biāo)本的檢出率明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明相較于血液樣本,肺泡灌洗液、房水、痰液等采集于局部病灶的樣本檢出率更高、檢測(cè)效果更好。

2.5 mNGS檢測(cè)結(jié)果中耐藥基因的分布

mNGS檢測(cè)在檢測(cè)樣本中是否含有致病菌的同時(shí),還可對(duì)患者是否存在耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)。20例患者中,2例檢測(cè)出耐藥基因,1例對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)、林可酰胺類(lèi)、鏈陽(yáng)霉素以及頭孢霉素抗生素耐藥,1例對(duì)肽類(lèi)、氟喹諾酮類(lèi)、利福霉素、四環(huán)素類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)、林可酰胺類(lèi)、鏈陽(yáng)霉素、頭孢霉素、碳青霉烯類(lèi)、青霉烷類(lèi)、砜類(lèi)以及磺胺類(lèi)耐藥。相較于傳統(tǒng)檢測(cè)方法,mNGS可全面檢出患者存在的耐藥基因,可及時(shí)、準(zhǔn)確地給予臨床用藥指導(dǎo),對(duì)患者的治療具有重要價(jià)值。

3 討論

血液病患者由于其疾病的自身特點(diǎn),以及治療過(guò)程中使用大量的激素、免疫抑制劑及化療藥物等,易造成黏膜屏障破壞,免疫功能損傷繼而引發(fā)感染等并發(fā)癥,感染是造成患者治療失敗甚至死亡的主要原因之一[5]。然而血液病患者的感染常伴有病原菌檢出率低、病情進(jìn)展快、臨床經(jīng)驗(yàn)性治療效果欠佳等問(wèn)題,因而在感染早期快速、準(zhǔn)確地檢出致病菌,在早期給予干預(yù),對(duì)患者的治療及預(yù)后具有重大意義。

細(xì)菌培養(yǎng)是病原體檢測(cè)的傳統(tǒng)方法,用于培養(yǎng)的樣本包括外周血、痰液、體液等,然而細(xì)菌培養(yǎng)的靈敏度較低,且受技術(shù)影響部分病原菌培養(yǎng)困難,限制了其在精確診療中的廣泛應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn),AHO患者外周血的細(xì)菌培養(yǎng)敏感性不足50%[6]。而mNGS作為高通量測(cè)序技術(shù),被認(rèn)為在病原體檢測(cè)中發(fā)揮重要作用[7]。相比于傳統(tǒng)病原體檢測(cè)方法,mNGS的靈敏度高,在細(xì)菌病毒等載量較低時(shí),即可精確診斷,指導(dǎo)臨床在感染早期予以控制,療效顯著。ZHANG等[8]研究發(fā)現(xiàn),mNGS可精準(zhǔn)診斷細(xì)菌培養(yǎng)尚為陰性的隱球菌感染所致骨髓炎。CHEN等[9]研究表明,針對(duì)外周血的mNGS檢測(cè)可早期診斷重癥肺炎患者的血流感染。

本研究將傳統(tǒng)病原體檢測(cè)方法和mNGS檢測(cè)進(jìn)行對(duì)比,結(jié)果顯示mNGS在檢出率(80%)以及檢出病原菌的豐富度方面均優(yōu)于傳統(tǒng)檢測(cè)方法。此外,20例患者樣本中血液樣本的檢出率為55%,顯著低于局部病灶的樣本檢出率(100%)。針對(duì)感染傳統(tǒng)的檢測(cè)手段主要是血培養(yǎng)、痰培養(yǎng),然而20例樣本中17例樣本的血、痰培養(yǎng)為陰性,顯著低于mNGS的檢出率,血培養(yǎng)敏感度低,在感染早期易造成漏診,可能延誤病情,對(duì)患者的治療及預(yù)后不利。此外,結(jié)果表明,在出現(xiàn)感染的患者中,多為細(xì)菌、真菌及病毒兩種或兩種以上混合型感染,給臨床的診療及用藥帶來(lái)了巨大的阻力。同時(shí),真菌及病毒培養(yǎng)困難,因此傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)難以檢出或僅檢出部分病原體,而mNGS檢測(cè)具有準(zhǔn)確度高、覆蓋面廣等優(yōu)點(diǎn),對(duì)臨床進(jìn)一步優(yōu)化用藥方案、提高患者整體預(yù)后具有重要意義。

通過(guò)與傳統(tǒng)病原體檢測(cè)手段作比較,證實(shí)了mNGS具有覆蓋面廣、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn),對(duì)臨床診療具有重要指導(dǎo)意義,但本研究樣本數(shù)量有限,得出的結(jié)論僅為mNGS的研究提供部分理論基礎(chǔ),未來(lái)將繼續(xù)深入研究mNGS在病原體篩查診斷中的作用。目前mNGS技術(shù)尚處于快速發(fā)展階段,在藥敏和毒力基因檢測(cè)等方面仍存在局限性[10],因此尚不能作為臨床診療的獨(dú)立依據(jù),應(yīng)結(jié)合臨床表征進(jìn)行甄別、診斷。隨著技術(shù)的飛速發(fā)展、臨床經(jīng)驗(yàn)的不斷積累,未來(lái)mNGS將廣泛應(yīng)用于臨床診療,以綜合判定病情,及時(shí)為患者提供個(gè)體化治療方案。