程龍飛,江南松,劉榮昌,傅秋玲,梁齊章,萬春和,黃 瑜,傅光華,陳紅梅

(福建省禽病防治重點實驗室,福建省畜禽疫病防治工程技術(shù)研究中心,福建省畜禽疫病防控產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新研究院,福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,福建福州 350013)

鴨傳染性漿膜炎是由革蘭氏陰性的鴨疫里默氏菌(Riemerellaanatipestifer)引起的主要侵害雛鴨和雛鵝的一種慢性或急性敗血性傳染病,導(dǎo)致死亡、耐過鴨生長遲緩和胴體淘汰等,造成重大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。藥物曾經(jīng)在該病的防治方面發(fā)揮了重要作用,但實際生產(chǎn)中盲目用藥、不按規(guī)定療程、不按規(guī)定劑量用藥等不規(guī)范用藥行為導(dǎo)致鴨疫里默氏菌耐藥性增強(qiáng),越來越多的鴨疫里默氏菌分離株存在多重耐藥現(xiàn)象[2-4],使得有效抗菌藥物的種類越來越少,給該病的臨床預(yù)防和治療帶來困難。細(xì)菌耐藥性問題已成為全球高度關(guān)注的重大共性問題。細(xì)菌耐藥性的迅速發(fā)展和新型化學(xué)藥物研發(fā)進(jìn)度的緩慢,已導(dǎo)致了全球畜牧業(yè)的巨大經(jīng)濟(jì)損失。在此背景下,噬菌體防治技術(shù)重新受到人們的高度重視,成為研究熱點。

噬菌體是細(xì)菌的病毒,可特異性裂解細(xì)菌。早在1919年,科學(xué)家就將噬菌體用于禽傷寒的預(yù)防和控制,取得了較好的效果[5]。目前,噬菌體療法在畜禽養(yǎng)殖、水產(chǎn)養(yǎng)殖、人類疾病、食品領(lǐng)域都有成功應(yīng)用的報道[6-7]。分離的天然噬菌體株多數(shù)具有高度特異性,僅針對某一種細(xì)菌內(nèi)的部分菌株[8],并不適合臨床應(yīng)用。為此,將多種或多株同種具有不同裂解譜的噬菌體制成混合制劑即雞尾酒(phage cocktail)可以保證治療的有效性[9]。實驗室條件下拓寬噬菌體的噬菌譜,建立噬菌譜較寬的噬菌體庫,減少噬菌體雞尾酒制劑中的噬菌體數(shù)量,不僅可以降低生產(chǎn)成本,還能簡化生產(chǎn)工藝,具有廣闊的應(yīng)用前景。本研究將鴨疫里默氏菌噬菌體混合,與宿主菌、多重耐藥鴨疫里默氏菌分別培養(yǎng),收獲的噬菌體再次混合,同樣的方法傳代,結(jié)果顯示,30代噬菌體混合液及從中分離出的單一噬菌體,能裂解的菌株數(shù)量增加了,即噬菌譜拓寬了,試驗證明建立的方法可以拓寬噬菌體的噬菌譜。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和毒株 6株鴨疫里默氏菌噬菌體,vB_RanS_202(宿主菌為RAf488)、vB_RanS_205(宿主菌為RAf32)、vB_RanS_1016(宿主菌為RAf63)、vB_RanS_082(宿主菌為RAf40)、vB_RanS_1018(宿主菌為RAf71)和vB_RanS_092(宿主菌為RAf19)。RAf11等18株對常用藥物耐受10種及以上的鴨疫里默氏菌,詳見表1。均保存于福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所。

表1 實驗用噬菌體和鴨疫里默氏菌一覽表

1.1.2 主要試劑 胰蛋白胨大豆瓊脂(Tryptic Soy Agar,TSA),胰蛋白胨大豆肉湯(Tryptic Soy Broth,TSB),Luria-Bertani瓊脂(LB瓊脂),廣東環(huán)凱微生物科技有限公司產(chǎn)品;上層瓊脂,按LB瓊脂配方將干粉減半。96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,220 nm針頭式濾器,氯化鈉(NaCl),硫酸鎂(MgSO4),甘油,1 mol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)等,生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品。SM緩沖液(100 mmol/L NaCl、10 mmol/L MgSO4·7H2O、50 mmol/L Tris-HCl,pH 7.5),SMG緩沖液(含20%甘油的SM緩沖液)本實驗室配制,高壓滅菌后室溫保存。

1.1.3 主要儀器 生物潔凈工作臺(BCM-1000A),蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品;恒溫培養(yǎng)箱(GNP-9080),上海精宏實驗設(shè)備有限公司產(chǎn)品;離心機(jī)(Sorvall biofuge stratos),德國Thermo Electron LED GmbH公司產(chǎn)品;數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-4),青島聚創(chuàng)環(huán)保集團(tuán)有限公司產(chǎn)品;高壓滅菌器(MLS-3750),日本SANYO公司產(chǎn)品;酶標(biāo)儀(ELX800),美國Bio-Tek公司產(chǎn)品;二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱(WCI-180),德國WIGGENS公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 鴨疫里默氏菌的培養(yǎng) 取鴨疫里默氏菌凍干粉,劃線培養(yǎng)于TSA平板,置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～20 h,挑3～6個菌落接種于20 mL TSB,37℃振蕩培養(yǎng)10～16 h,當(dāng)OD525值為1.0～1.5時置2～8 ℃保存,3 d內(nèi)使用。

1.2.2 噬菌體的培養(yǎng) 將適當(dāng)濃度的噬菌體和相應(yīng)的宿主菌混合,加入50 ℃水浴的上層瓊脂,鋪于TSA平板上,自然冷卻凝固后置37 ℃培養(yǎng)16～20 h,挑取平板上層瓊脂中的成片或單個噬斑,浸泡于1 mL SM緩沖液中數(shù)小時,吸上清經(jīng)220 nm針頭式濾器過濾即為噬菌體液。

1.2.3 噬菌體效價的測定 按文獻(xiàn)[10]的方法,將噬菌體液以SM緩沖液進(jìn)行連續(xù)10倍稀釋,取適當(dāng)稀釋度的噬菌體液100 μL,與新鮮培養(yǎng)的宿主菌100 μL混勻,37℃水浴15 min,加入50 ℃水浴的上層瓊脂,混勻后立即倒入TSA上制成雙層平板,待瓊脂凝固后將平板置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～20 h后統(tǒng)計噬菌斑,并推算原噬菌體的濃度,以空斑形成單位(plaque forming unit,PFU)/mL表示,為保證結(jié)果的可靠性,每個稀釋度做2個重復(fù),取平均值。

1.2.4 噬菌譜的測定 采用噬斑分析法,以SM緩沖液將待測噬菌體液作10倍連續(xù)稀釋至10-5。鴨疫里默氏菌菌液,與50 ℃水浴的TSA混合,鋪于平板上,室溫放置60 min。將平板分區(qū),每區(qū)滴加5 μL各稀釋度噬菌體,待液體吸收后轉(zhuǎn)至37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～20 h,觀察平板上各區(qū)的噬斑。當(dāng)高濃度噬菌體液形成大噬斑,隨著濃度的降低,可以見到數(shù)量不等的小噬斑時,提示該噬菌體可以裂解相應(yīng)的菌株。

1.2.5 噬菌譜拓寬試驗方法 將效價為1×109PFU/mL的6株噬菌體等量混合,標(biāo)記為HRE-0。取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,旋轉(zhuǎn)90度,每板12行8列。每列重復(fù),第1列每孔加入180 μL HRE-0,其余所有孔,每孔加入180 μL TSB。吸20 μL HRE-0加入第2列的孔中,混勻,吸出20 μL加入第3列中,依次稀釋至第7列,吸出20 μL棄去。第8列作為對照。取24株鴨疫里默氏菌培養(yǎng)液,每行加入1株,每孔20 μL。置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～20 h。以酶標(biāo)儀測定各孔的OD490值,將同一行的數(shù)值進(jìn)行比較。將低于對照孔OD490值60%的實驗孔及前1孔的培養(yǎng)液吸出,如果所有實驗孔的OD490值都與對照孔的接近,則將第1、2列孔中的培養(yǎng)液吸出,所有吸出的培養(yǎng)液混合,加入100 μL氯仿,輕輕顛倒混勻,10 000 g離心2 min,吸上清用220 nm針頭式濾器,濾液標(biāo)記HRE-1。采用同樣的方法繼續(xù)傳代,共進(jìn)行30次傳代。余下的加入終濃度為20%的甘油,保存于-20 ℃。

1.2.6 不同代次噬菌體混合液的噬菌譜測定 取HRE-0、HRE-5、HRE-10、HRE-15、HRE-20、HRE-25、HRE-30的噬菌體混合液,按1.2.4的方法測定各混合液對24株鴨疫里默氏菌的裂解情況。

1.2.7 30代噬菌體混合液中單一噬菌體的分離及噬菌譜測定 將HRE-30的噬菌體混合液適當(dāng)稀釋,分別與6株宿主菌、新增加的能被裂解的13株菌菌液鋪雙層平板,培養(yǎng)后各挑取6個單噬斑,分別浸泡于1 mL SM緩沖液數(shù)小時并不時顛倒混勻,吸取液體經(jīng)過220 nm針頭式濾器,加入終濃度為20%的甘油,保存于-20 ℃。標(biāo)記為HRE-30/RAf488-1、HRE-30/RAf488-2等,按1.2.4的方法測定各單一噬菌體對這19株鴨疫里默氏菌的裂解情況。

1.2.8 單一噬菌體的穩(wěn)定性 將1.2.7篩選出的能裂解菌株數(shù)量最多的5株噬菌體,以原培養(yǎng)菌為宿主菌,傳代10次。按1.2.4的方法測定傳代后噬菌體的噬菌譜。

1.2.9 噬菌體雞尾酒的噬菌譜測定 根據(jù)1.2.7篩選出的結(jié)果,將具有互補(bǔ)特點的、能裂解菌株數(shù)量較多的4株噬菌體等量組合成雞尾酒CT1、CT2、CT3和CT4,按1.2.4的方法測定對19株菌株的裂解情況。

2 結(jié)果

2.1 不同代次噬菌體混合液的噬菌譜

6株噬菌體的混合液與6株宿主菌及18株非宿主多重耐藥鴨疫里默氏菌培養(yǎng)后,第5代混合液可裂解的菌株數(shù)迅速增加至14株,隨著培養(yǎng)代次的增加,能裂解的菌株數(shù)緩慢增加,第25代和30代混合液能裂解的菌株數(shù)量穩(wěn)定在19株,仍有5株細(xì)菌不能被裂解,詳見表1和圖1。

圖1 不同培養(yǎng)代次噬菌體混合液的裂解特點

2.2 從30代噬菌體混合液分離出的單一噬菌體的裂解特點

HRE-30噬菌體混合液,與能裂解的19株鴨疫里默氏菌分別鋪雙層平板,共挑出114株單斑噬菌體,這些單一噬菌體對19株菌的裂解特點見表2,其中能裂解細(xì)菌菌株數(shù)量最少的僅為2株,最多的為9株,多數(shù)單一噬菌體(66.7%)能裂解的細(xì)菌菌株數(shù)為4～6株。裂解9株細(xì)菌的單一噬菌體有5株,分別是以RAf488、RAf32和RAf71為宿主菌培養(yǎng)獲得的。單一噬菌體能裂解的菌株數(shù)遠(yuǎn)低于HRE-30能裂解的菌株數(shù),但多數(shù)超過了原始噬菌體株。

表2 HRE-30分離出的單一噬菌體的裂解特點

2.3 單一噬菌體的穩(wěn)定性

將能裂解9株細(xì)菌的5株單一噬菌體HRE-30/RAf488-5、HRE-30/RAf32-3、HRE-30/RAf32-4、HRE-30/RAf488-1、HRE-30/RAf71-1,以原培養(yǎng)菌為宿主菌傳代10次,對19株鴨疫里默氏菌的裂解情況沒有發(fā)生改變。

2.4 噬菌體雞尾酒的噬菌譜

4個噬菌體雞尾酒的組成見表3,均能裂解19株鴨疫里默氏菌。

表3 噬菌體雞尾酒的組成

3 討論

噬菌體是細(xì)菌的病毒,由于細(xì)菌基因組的快速進(jìn)化[11]及固有免疫原性[12]共同導(dǎo)致天然噬菌體株的宿主范圍很窄,特定的天然噬菌體株通常只能裂解一個細(xì)菌種內(nèi)的少數(shù)菌株,極少覆蓋所有臨床流行的致病菌株。前期的研究表明,77.14%的鴨疫里默氏菌噬菌體對臨床分離株裂解率低于20%,即噬菌譜較窄,這一點限制了天然噬菌體的臨床應(yīng)用[13]。但噬菌體的宿主特異性不是一成不變的,已有的研究表明,噬菌體可以與細(xì)菌在生長循環(huán)過程中相互作用并共同進(jìn)化,使得噬菌體能夠發(fā)生適應(yīng)性變異[14-15]。本研究針對現(xiàn)有噬菌體不能裂解的多重耐藥鴨疫里默氏菌臨床分離株,開展已有噬菌體的噬菌譜拓寬試驗,結(jié)果證實培養(yǎng)后的噬菌體混合液及從混合液中分離出來的單一噬菌體的宿主范圍都拓寬了,單一噬菌體能裂解的菌株數(shù)量遠(yuǎn)低于噬菌體混合液,但比初始噬菌體有了一定程度的增加。本研究建立的噬菌譜拓寬方法和分離到的相對寬譜噬菌體,為今后噬菌體雞尾酒制劑的制備提供了侯選毒株,具有一定的實用性和潛在的應(yīng)用前景。

常用的拓寬噬菌體噬菌譜的方法有共培養(yǎng)法和基因改造法。周艷等[16]將高效價的產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌的噬菌體JS09按MOI為100的比例與非宿主的腸出血性大腸埃希氏菌進(jìn)行多輪共培養(yǎng),篩選到6株能同時裂解上述兩種細(xì)菌的噬菌體,拓寬了親本噬菌體JS09的宿主譜。徐焰等[17]將高濃度噬菌體與6株非宿主菌混合液進(jìn)行長時間、多周期的混合培養(yǎng),使大腸埃希氏菌噬菌體XY-1的噬菌譜擴(kuò)展至非其宿主菌的4株大腸桿菌,且經(jīng)過30周期的傳代培養(yǎng)仍具有多宿主裂菌效應(yīng)。Mapes A C等[14]將銅綠假單胞菌特異性噬菌體與多株耐藥性不同的銅綠假單胞菌經(jīng)過多輪共培養(yǎng),不僅拓寬了噬菌體的宿主譜,還能有效抑制銅綠假單胞菌形成生物膜。本研究將6株噬菌體混合液分別與宿主菌和18株多重耐藥鴨疫里默氏菌經(jīng)過多輪共培養(yǎng),也成功獲得噬菌譜拓寬的噬菌體。Yosef I等[18]將T7-like噬菌體的尾部蛋白基因與其他噬菌體的類似基因進(jìn)行替換,出現(xiàn)了可預(yù)測的宿主范圍變化。T3噬菌體通過尾絲蛋白上的4個不同區(qū)域結(jié)合其宿主受體,Yehl K等[19]針對這4個DNA區(qū)域設(shè)計隨機(jī)簡并引物,整合至尾絲蛋白基因上,建立了一個多樣性非常大的突變噬菌體庫,進(jìn)而產(chǎn)生能夠感染新宿主的噬菌體。Zhang J等[20]將T5-like沙門氏菌噬菌體的長尾絲蛋白進(jìn)行編輯,獲得寬宿主范圍的工程噬菌體?；蚋脑旆梢园搭A(yù)定的目標(biāo)對噬菌體的噬菌譜進(jìn)行改造,具有非常重要的應(yīng)用價值,這也是我們接下來的研究方向。

本研究建立了一種可以拓寬鴨疫里默氏菌噬菌體噬菌譜的方法,既能獲得噬菌譜更寬的噬菌體混合液,也能獲得穩(wěn)定的噬菌譜更寬的單一噬菌體。