關(guān)茵,張國平,劉文超,裴垚昶,郭超群

(1.焦作市中心血站 a.血型室;b.業(yè)務(wù)科,河南 焦作 454000;2.焦作市第二人民醫(yī)院 輸血科,河南 焦作 454000;3.焦作市人民醫(yī)院 輸血科,河南 焦作 454000)

ABO血型系統(tǒng)是一種廣泛存在于人類中的遺傳現(xiàn)象,常常被用于獻(xiàn)血、輸血、器官移植等臨床操作中[1]。ABO血型系統(tǒng)是判斷獻(xiàn)血和輸血相容性最基本的指標(biāo)之一[2]。根據(jù)ABO血型系統(tǒng)的分類,人群被分為A、B、AB和O型,不同類型之間應(yīng)該采取不同的獻(xiàn)血和輸血策略,以避免引起輸血反應(yīng)等不良后果[3]。在基因測(cè)序技術(shù)出現(xiàn)后,它成為了ABO血型系統(tǒng)分型鑒定的 “金標(biāo)準(zhǔn)”,因?yàn)榛驕y(cè)序能夠非常準(zhǔn)確地揭示ABO基因的遺傳信息。同時(shí),利用基因測(cè)序技術(shù)可以檢測(cè)到常規(guī)檢測(cè)方法無法檢測(cè)到的罕見ABO亞型,從而提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性[4]。然而,基因測(cè)序技術(shù)的成本較高,操作難度大,需要專業(yè)人員進(jìn)行操作和解讀結(jié)果,因此在臨床實(shí)踐中并不是所有情況下都會(huì)使用基因測(cè)序技術(shù)進(jìn)行ABO血型鑒定[5]?；蚍中蜋z測(cè)和血清學(xué)檢測(cè)都是常用的血型鑒定方法,不過兩種方法的機(jī)理不同,因此在某些方面會(huì)存在一些差異[6]。為了比較兩種檢測(cè)方法在ABO疑難血型鑒定的差異,本研究通過對(duì)106例ABO疑難血型分別進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)、基因分型檢測(cè)和基因測(cè)序,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2021年10月至2022年10月焦作市中心血站進(jìn)行血型鑒定的106例疑難血型標(biāo)本(血清格局反應(yīng)定型表現(xiàn)為弱抗體標(biāo)本)。血清學(xué)格局見表1。(1)納入標(biāo)準(zhǔn):①年齡在18周歲以上;②進(jìn)行血型評(píng)估;③入組前6個(gè)月內(nèi)無輸血、獻(xiàn)血史;④了解研究相關(guān)內(nèi)容及利弊,簽署知情同意書。(2)排除標(biāo)準(zhǔn):①入組前6個(gè)月有相關(guān)抗血小板等藥物使用史;②存在自身凝血功能障礙;③不愿參與研究;④妊娠期婦女。其中,男52例、女54例;年齡23～75歲;平均(48.64±10.85)歲。

表1 血型血清學(xué)格局

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1基因測(cè)序鑒定ABO疑難血型

采集患者口腔黏膜拭子,從樣本中提取出DNA,并進(jìn)行純化處理,以消除影響測(cè)序結(jié)果的雜質(zhì)和污染物。通過PCR技術(shù)特異性擴(kuò)增ABO基因序列,以獲取DNA片段。對(duì)PCR擴(kuò)增所得DNA片段進(jìn)行高通量測(cè)序,可以使用二代測(cè)序儀、三代測(cè)序儀等設(shè)備進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序得到的數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫比對(duì),對(duì)比對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析,判斷樣本中的ABO基因型?？?H、抗-AB、人ABO反定型用紅細(xì)胞購自上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司;抗-A抗-B試劑購自長春博德生物技術(shù)有限責(zé)任公司。儀器及試劑盒包括全自動(dòng)血型分析儀(奧森多公司,型號(hào)為AutoVueInnova)、血液基因組DNA抽提試劑盒(上海生工生物技術(shù)有限公司)、TaKaRa La Tap酶(日本TaKaRa公司)、DNA瓊脂糖凝膠純化試劑盒(北京TianGen公司)、pMD18-T載體(日本TaKaRa公司))、PCR儀(美國ABI公司)、DNA測(cè)序儀(美國ABI公司,型號(hào)為PRISM377)、離心機(jī)(日本久保田公司,型號(hào)為KA-2200)。

1.2.2吸收放散試驗(yàn)

利用抗-A抗-B抗AB血型定型試劑(人血清)進(jìn)行吸收放散試驗(yàn),采集被檢測(cè)者的全血樣本,并將其離心分離出紅細(xì)胞。準(zhǔn)備吸收劑:將抗A、抗B、抗AB吸附在已知ABO血型的紅細(xì)胞上,將其離心沉淀,去除懸浮液。用紅細(xì)胞洗滌緩沖液對(duì)被檢測(cè)者分離出的紅細(xì)胞進(jìn)行洗滌處理。在洗滌后的紅細(xì)胞中加入吸附劑,反應(yīng)一定時(shí)間后,離心分離,去除上清液。然后,分別用抗A、抗B、抗AB 3種試劑進(jìn)行血型的鑒定,根據(jù)細(xì)胞凝集情況判斷血型。對(duì)于吸收實(shí)驗(yàn)結(jié)果為疑難血型的樣本,可以進(jìn)行放散實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步確定血型。在吸收放散試驗(yàn)中,通過加入適量的滲透劑,使細(xì)胞凝集消失或放散,觀察細(xì)胞凝集情況,判斷血型。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR試驗(yàn)

利用人類紅細(xì)胞ABO血型基因分型試劑盒檢測(cè)A、A205、B、O261del、01、01、02等位基因,采集被檢測(cè)者的全血樣本,并將其離心分離出紅細(xì)胞。將紅細(xì)胞中的DNA提取出來。PCR反應(yīng)體系準(zhǔn)備:準(zhǔn)備PCR反應(yīng)體系,包括PCR引物、熒光標(biāo)記探針、Taq聚合酶、dNTPs等。將提取出的DNA加入PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行反應(yīng)。PCR條件根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)室的設(shè)備和引物可適當(dāng)調(diào)整,常見的反應(yīng)條件為預(yù)變性5 min,95 ℃ 10 min,40個(gè)循環(huán)(94 ℃ 30 s,60 ℃ 60 s,72 ℃ 30 s),終止延伸72 ℃ 10 min。利用熒光定量PCR設(shè)備,檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)生的熒光信號(hào)。檢測(cè)結(jié)果會(huì)顯示出被檢測(cè)樣本的基因型信息。根據(jù)熒光信號(hào)檢測(cè)結(jié)果,將被檢測(cè)者的基因型信息轉(zhuǎn)化為表型信息,比對(duì)參考文獻(xiàn),判斷被檢測(cè)者的ABO血型。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)數(shù)資料用頻數(shù)和百分?jǐn)?shù)(%)表示,進(jìn)行χ2檢驗(yàn);檢測(cè)方式與金標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果的差異比較采用配對(duì)χ2檢驗(yàn)。檢測(cè)方式與金標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果的一致性采用Kappa配對(duì)檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種檢測(cè)方式檢測(cè)結(jié)果分析

106例疑難血型標(biāo)本基因測(cè)序結(jié)果顯示,陽性有46例,陰性有60例。吸收放散試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果中,陽性有48例,陰性有58例;實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果中,陽性有47例,陰性有59例。吸收放散試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果、實(shí)施熒光定量PCR結(jié)果與基因測(cè)序檢測(cè)結(jié)果對(duì)應(yīng),吸收放散試驗(yàn)結(jié)果與基因測(cè)序結(jié)果比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.845>0.05),實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果與基因測(cè)序結(jié)果比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.999)。見表2。

表2 兩種檢測(cè)方式與基因測(cè)序的比較

2.2 兩種檢測(cè)方式與金標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)結(jié)果一致性分析

根據(jù)兩種檢測(cè)方式與基因測(cè)序(金標(biāo)準(zhǔn))檢測(cè)結(jié)果的對(duì)應(yīng)情況,進(jìn)行一致性分析。吸收放散試驗(yàn)結(jié)果與基因測(cè)序結(jié)果呈中度一致性(Kappa=0.503,P<0.001),實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果與基因測(cè)序結(jié)果的一致性很好(Kappa=0.904,P<0.001)。Kappa值與符合度的關(guān)系見表3。

表3 Kappa值的范圍與符合度的關(guān)系

2.3 兩種檢測(cè)方式診斷效能比較

實(shí)時(shí)熒光定量PCR方式的診斷準(zhǔn)確率、靈敏度、特異度均高于吸收放散試驗(yàn),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 兩種檢測(cè)方式的診斷效能比較(%)

3 討論

ABO血型系統(tǒng)是判斷獻(xiàn)血和輸血相容性最基本的指標(biāo)之一[7]。根據(jù)ABO血型系統(tǒng)的分類,人群被分為A、B、AB和O型,不同類型之間應(yīng)該采取不同的獻(xiàn)血和輸血策略,以避免引起輸血反應(yīng)等不良后果。然而,ABO血型系統(tǒng)的分型鑒定檢查率低可能會(huì)導(dǎo)致誤診和漏診等問題[8-9]。例如,在輸血操作中,如果沒有正確地區(qū)分供者和接受者的ABO血型,就有可能引起輸血反應(yīng),嚴(yán)重時(shí)可能會(huì)導(dǎo)致死亡[10]。因此,在臨床操作中,對(duì)于ABO血型的檢查和判定應(yīng)該嚴(yán)格把關(guān),以確保操作的準(zhǔn)確性和安全性。而ABO血型的檢查方式便成了其關(guān)鍵。

本研究中,通過對(duì)106例ABO疑難血型實(shí)施血清學(xué)檢測(cè)(吸收放散實(shí)驗(yàn))等,同時(shí)對(duì)其實(shí)施基因分型檢測(cè)(熒光定量PCR試驗(yàn)),以基因測(cè)序結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清學(xué)檢測(cè)所得結(jié)果與基因測(cè)序結(jié)果一致性為重度,基因分型檢測(cè)所得結(jié)果與基因測(cè)序結(jié)果一致性較好。這說明二者都能夠提供準(zhǔn)確的鑒定結(jié)果,這與陳萍等[11]的研究結(jié)果相符。這是由于基因分型檢測(cè)是通過對(duì)樣本DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,然后使用特異性探針或特異性引物擴(kuò)增位點(diǎn)來確定基因的亞型[12]。在ABO血型系統(tǒng)中,人體有A、B、O 3種亞型,其中A和 B亞型均由一種轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)控制,而O亞型則沒有轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)。因此,基因分型檢測(cè)可以通過擴(kuò)增ABO基因的關(guān)鍵位點(diǎn)來判斷患者所屬的血型[13]。血清學(xué)檢測(cè)則是通過將患者的血清和已知血型的紅細(xì)胞混合反應(yīng),觀察是否出現(xiàn)凝集或溶解等現(xiàn)象來確定其所屬的血型。這種方法利用患者體內(nèi)產(chǎn)生的抗體與被試血液中表面抗原的結(jié)合反應(yīng)來完成[14]。在ABO血型系統(tǒng)中,如果患者血清中存在對(duì)應(yīng)于紅細(xì)胞表面A抗原或B抗原的抗體,則當(dāng)這些抗體分別與被試血液中的A抗原或B抗原相遇時(shí)會(huì)出現(xiàn)凝集現(xiàn)象,從而確定其血型。因此,二者均可以提供準(zhǔn)確的鑒定結(jié)果。

通過比較血清學(xué)檢測(cè)和基因分型靈敏度、特異度可知,兩種檢查方式所得特異度、靈敏度存在較大差異,基因分型靈敏度、特異度更高。這是由于基因分型檢測(cè)技術(shù)對(duì)于一些罕見的ABO亞型和變異型的檢測(cè)能力更強(qiáng)。這些亞型和變異型一般無法通過血清學(xué)方法檢測(cè)出來,但是熒光定量PCR試驗(yàn)可以檢測(cè)出其特定基因序列,從而進(jìn)行精確定位和鑒定。

基因分型檢測(cè)和血清學(xué)檢測(cè)是兩種常用的血型鑒定方法,各自具有一些優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。首先,基因分型檢測(cè)技術(shù)具有高度的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性?；蚍中蜋z測(cè)是直接檢測(cè)基因序列來確定血型的,結(jié)果不受樣本中抗體的影響,并且能夠準(zhǔn)確地檢測(cè)出一些罕見的ABO亞型和變異型[15-16]。此外,基因分型檢測(cè)技術(shù)還具有較高的標(biāo)準(zhǔn)化和自動(dòng)化程度,能夠大大降低人為因素和實(shí)驗(yàn)誤差的干擾。其次,基因分型檢測(cè)技術(shù)更加快速、高效和節(jié)約成本。相對(duì)于血清學(xué)檢測(cè)需要多次反應(yīng)和操作,基因分型檢測(cè)只需要進(jìn)行1次PCR反應(yīng)即可獲得鑒定結(jié)果[17]。并且,基因分型檢測(cè)的樣本準(zhǔn)備簡(jiǎn)單,不需要進(jìn)行特別處理,相對(duì)更加快捷和節(jié)省成本。與此相比,血清學(xué)檢測(cè)也有一些優(yōu)點(diǎn)。例如,在某些情況下,血清學(xué)檢測(cè)能夠提供更詳細(xì)的信息,例如同時(shí)檢測(cè)多種抗體、檢測(cè)Rh因子等[18-19]。此外,部分醫(yī)院和實(shí)驗(yàn)室可能沒有配備基因分型檢測(cè)設(shè)備,而血清學(xué)檢測(cè)設(shè)備則普及度更高,更加便于使用。但對(duì)于一些疑難血型,由于基因變異、突變等原因,可能導(dǎo)致血清學(xué)檢測(cè)無法準(zhǔn)確鑒定血型,此時(shí)需要進(jìn)行基因分型檢測(cè)。相比于血清學(xué)檢測(cè),基因分型檢測(cè)有更高的準(zhǔn)確性和可靠性,可以檢測(cè)出較為罕見的ABO亞型和變異型,并且能夠避免人為誤差的干擾。

4 結(jié)論

雖然基因分型檢測(cè)和血清學(xué)檢測(cè)有各自的優(yōu)缺點(diǎn),但總體上來說,基因分型檢測(cè)具有更高的準(zhǔn)確性和可靠性,更快速、高效且更加節(jié)約成本,因此在臨床診斷和疾病預(yù)防控制中具有廣泛的應(yīng)用前景。