劉佳

(鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院 輸血科,河南 鄭州 450052)

一氧化氮是機體細(xì)胞中參與心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)信號傳導(dǎo)的重要物質(zhì)[1-3],但是高濃度的一氧化氮能對機體功能造成損傷,也能對線粒體功能損壞并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[4-5]。亦有研究表明在嚴(yán)重敗血癥中,高濃度的一氧化氮會引起機體細(xì)胞受損[6]。機體一氧化氮由誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)合成產(chǎn)生,其可引起過氧化亞硝基陰離子水平升高,從而引起了許多炎癥疾病的發(fā)生[7],因此,抑制機體一氧化氮水平對減輕一氧化氮毒性影響具有重要作用。匹莫齊特(Pimozide)是用于治療精神分裂癥的一種藥物,亦是一種常用的多巴胺受體拮抗劑。Nelson等[8]指出Pimozide可抑制信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子通路-5信號通路,且同時具有抗白血病的藥理作用。鑒于此,本研究人員推測信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子通路-5信號通路的拮抗劑對巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞株誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶水平表達(dá)也可能具有抑制作用,本實驗用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞株建立炎癥模型[9],以Pimozide作為工具藥,探討信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子通路-5信號通路對iNOS水平表達(dá)潛在的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來源

小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞株來源于鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物實驗室。

1.2 藥品與試劑

Pimozide對照品(中國維克奇公司,標(biāo)準(zhǔn)品:HPLC≥98%)LPS(日本三荔公司,批號:AC11974);四甲基偶氮唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)試劑盒(上海貝萬塔生物科技有限公司);蛋白質(zhì)裂解液試劑盒(上海貝博生物科技公司)、BCA蛋白水平檢測試劑盒(北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司);Griess法試劑盒(中國上海通蔚賽默飛世爾科技公司);巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞株總RNA提取試劑Trizol、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒(上海通蔚生物有限公司)、DMEM培養(yǎng)基(Cell Signaling Technology,美國);雙抗、胎牛血清(南京森貝伽生物科技有限公司)以及SYBR Green實時定量聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒(北京普利萊基因技術(shù)有限公司);總信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子通路-5單抗和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)單抗、磷酸化的信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子通路-5單抗(Bioworld,美國);iNOS單抗(Cell Signaling Technology,美國)。

1.3 主要儀器

酶聯(lián)免疫細(xì)胞儀(Bio-Rad,美國),ABI 7500型實時定量熒光聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)儀(Applied Biosystems,美國)。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

用含10%胎牛血清、100 U·mL-1的青鏈霉素DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞株,培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2。

1.5 MTT法檢測細(xì)胞活性

在96孔板上,收集對數(shù)期巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞株,密度為以1×104每孔。貼壁過夜后,將給予不同濃度(0、2.5、5、10 μmol·L-1)的Pimozide,孵育24 h后,每孔給予濃度為5 g·L-1的MTT溶液,再進(jìn)行孵育,孵育時間為4 h,去除含胎牛血清的培養(yǎng)液后,給予150 μL的二甲基亞砜(dimethyl surfoxide,DMSO)溶液,用混勻器混勻10 min,然后于紫外分光光度計490 nm波長測定吸光度(optical density,OD)值。

1.6 Griess法檢測細(xì)胞中一氧化氮水平

參照文獻(xiàn)[9-10]以巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞株濃度為每孔2×105個鋪板于24孔微量板中。細(xì)胞貼壁過夜,按實驗?zāi)康姆纸M。即空白對照組、Pimozide對照(10 μmol·L-1)組、脂多糖誘導(dǎo)(1 mg·L-1LPS)組。脂多糖誘導(dǎo)組分為1 mg·L-1LPS、1 mg·L-1LPS+2.5 μmol·L-1的Pimozide、1 mg·L-1LPS+5 μmol·L-1的Pimozide、1 mg·L-1LPS+10 μmol·L-1的Pimozide(在脂多糖誘導(dǎo)前25 min給予Pimozide進(jìn)行處理)亞組,每組重復(fù)3次。孵育24 h后測定不同組巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞株培養(yǎng)上清液中一氧化氮的水平。一氧化氮的抑制率按如下公式計算:R=100%-(N1-N2)/(N3-N2)×100%,其中R為一氧化氮抑制率,N1為受試組一氧化氮水平,N2為空白對照組一氧化氮水平,N3為脂多糖誘導(dǎo)組一氧化氮水平。

1.7 RT-PCR檢測細(xì)胞中iNOS mRNA表達(dá)

收集巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞株對數(shù)生長期的細(xì)胞,以密度為每孔1×106個鋪于6孔微量板中,細(xì)胞貼壁過夜。按實驗要求分組和給藥,參見“1.6”方法處理。孵育時間為6 h,參照Trizol法對巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞總RNA進(jìn)行獲取。獲取的RNA在紫外分光光度計下檢測后,于RT-PCR分析儀上完成反轉(zhuǎn)錄,獲取cDNA。合成引物序列如下表[愛必信(上海)生物科技有限公司]。作用條件如下:50 ℃ 2 min;95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 34 s,40個循環(huán)。獲得的數(shù)據(jù)采用相對定量的ΔΔCt法進(jìn)行表示,用iNOS mRNA/GAPDH比值進(jìn)行評價,并計算iNOS mRNA的抑制率。序列如下:引物序列上游下游iNOS為5’-TCCATGACTCCCAGCACA-3’,5’-CCATCTCCTG-CATTTCTTCC-3’;GAPDH為5’-GGTGAAGGTCG-GTGTGAACG-3’,5’-CTCGCTCCTGGAAGATG-GTG-3’。

1.8 免疫蛋白印跡測定細(xì)胞中iNOS、信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子通路-5和磷酸化信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子通路-5蛋白表達(dá)

巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞株接種同“1.7”,同方法“1.6”給藥和分組。利用蛋白質(zhì)裂解液試劑盒進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)蛋白提取,提取后的蛋白用BCA法進(jìn)行定量分析。取蛋白25～45 μg加上樣緩沖液進(jìn)行混勻煮沸后,用十二烷基硫酸鈉-聚丙酰胺凝膠進(jìn)行電泳分析。然后轉(zhuǎn)膜,使用5%脫脂奶粉混雜液進(jìn)行室溫封閉1 h,放入相應(yīng)一抗混合液(iNOS、GAPDH、信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子通路-5和磷酸化信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子通路-5單抗)進(jìn)行孵育1 h。洗膜后加入二抗反應(yīng)1 h。洗去多余抗體及稀釋液后開始用試劑盒顯影曝光。Quantify One軟件用于剖析電泳條帶的灰度值。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 Pimozide對巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞株活性的作用

用0、2.5、5、10 μmol·L-1的Pimozide和/或1 mg·L-1LPS對巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞進(jìn)行處理,發(fā)現(xiàn)Pimozide和/或LPS均不影響巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞活性(P>0.05),表明Pimozide和/或LPS對巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞無顯著細(xì)胞毒影響(如圖1)。所以,本研究以下使用的Pimozide對照濃度為10 μmol·L-1,LPS濃度為1 mg·L-1。

A為空白對照組;B為Pimozide對照組;C為1 mg·L-1 LPS誘導(dǎo)組;D為1 mg·L-1 LPS+2.5 μmol·L-1 Pimozide組;E為1 mg·L-1 LPS+5 μmol·L-1 Pimozide組;F為1 mg·L-1 LPS+10 μmol·L-1 Pimozide組。

2.2 Pimozide對巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞中一氧化氮釋放的作用

巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)24 h后,空白對照組、Pimozide對照組、LPS誘導(dǎo)組和Pimozide不同濃度組細(xì)胞中一氧化氮水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=25.69,P<0.05);不同濃度Pimozide對巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞中一氧化氮釋放的抑制率相對比值差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=132.49,P<0.05)。而與空白對照組相比,LPS誘導(dǎo)組RAW264.7細(xì)胞中一氧化氮水平是升高的,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。而與LPS誘導(dǎo)組相比,Pimozide中(5 μmol·L-1)、高(10 μmol·L-1)濃度組巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞中一氧化氮水平下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表1和圖2。

表1 Pimozide對細(xì)胞中一氧化氮釋放的影響

#與空白對照組比較,P<0.05;A為空白對照組;B為Pimozide對照組;C為1 mg·L-1 LPS誘導(dǎo)組;D為1 mg·L-1 LPS+2.5 μmol·L-1 Pimozide組;E為1 mg·L-1 LPS+5 μmol·L-1 Pimozide組;F為1 mg·L-1 LPS+10 μmol·L-1 Pimozide組。

2.3 Pimozide對巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞中iNOS mRNA和蛋白表達(dá)的影響

巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)24 h后,空白對照組、Pimozide對照組、LPS誘導(dǎo)組和Pimozide各濃度組細(xì)胞中iNOS mRNA(F=123.59,P<0.05)和蛋白表達(dá)差異(F=23.37,P<0.05)有統(tǒng)計學(xué)意義。LPS誘導(dǎo)組RAW264.7細(xì)胞中iNOSmRNA和蛋白,與空白對照組比較表達(dá)升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Pimozide中(5 μmol·L-1)、高(10 μmol·L-1)濃度組細(xì)胞中iNOS mRNA和蛋白與LPS誘導(dǎo)組比較,表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2和圖3、4。

表2 各組巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞中iNOS mRNA和蛋白表達(dá)

#與空白對照組比較,P<0.05;A為空白對照組;B為Pimozide對照組;C為1 mg·L-1 LPS誘導(dǎo)組;D為1 mg·L-1 LPS+2.5 μmol·L-1 Pimozide組;E為1 mg·L-1 LPS+5 μmol·L-1 Pimozide組;F為1 mg·L-1 LPS+10 μmol·L-1 Pimozide組。

#與空白對照組比較,P<0.05;A為空白對照組;B為Pimozide對照組;C為1 mg·L-1 LPS誘導(dǎo)組;D為1 mg·L-1 LPS+2.5 μmol·L-1 Pimozide組;E為1 mg·L-1 LPS+5 μmol·L-1 Pimozide組;F為1 mg·L-1 LPS+10 μmol·L-1 Pimozide組。

2.4 Pimozide對巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞磷酸化的信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子通路-5/信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子通路-5比值的影響

巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞對數(shù)期培養(yǎng)24 h后,空白對照組、Pimozide對照組、LPS誘導(dǎo)組和Pimozide各濃度組細(xì)胞中磷酸化的信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子通路-5/信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子通路-5表達(dá)水平,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=12.07,P<0.05)(如圖5)。LPS誘導(dǎo)組細(xì)胞與空白對照組相較磷酸化的信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子通路-5/信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子通路-5比值數(shù)增大,而與LPS誘導(dǎo)組相比較,Pimozide中(5 μmol·L-1)、高(10 μmol·L-1)濃度組細(xì)胞中磷酸化的信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子通路-5/信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子通路-5比值數(shù)減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3和圖5。

表3 Pimozide對磷酸化的信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子通路-5/信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子通路-5比值

#與空白對照組比較,P<0.05;A為空白對照組;B為Pimozide對照組;C為1 mg·L-1 LPS誘導(dǎo)組;D為1 mg·L-1 LPS+2.5 μmol·L-1 Pimozide組;E為1 mg·L-1 LPS+5 μmol·L-1 Pimozide組;F為1 mg·L-1 LPS+10 μmol·L-1 Pimozide組。

3 討論

炎癥是機體面對損傷的自我保護(hù)機制。巨噬細(xì)胞是炎癥反應(yīng)中的明星成員,巨噬細(xì)胞屬免疫細(xì)胞,有多種功能:可參與抗原識別和抗原呈遞,有效激活免疫細(xì)胞應(yīng)答,分泌炎癥遞質(zhì),形成級聯(lián)反應(yīng)。一氧化氮亦是炎癥中的關(guān)鍵角色。有研究表明,通過藥物干預(yù)或者基因敲除等技術(shù)能夠阻滯一氧化氮的生成,可有效緩解患者或?qū)嶒瀯游锏难装Y反應(yīng)[11-12]。轉(zhuǎn)錄因子活化進(jìn)程中1個或數(shù)個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子被阻斷將導(dǎo)致細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄受抑[13-14]。為了研究信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子通路-5信號通路是否對iNOS的表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用,需探索信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子通路-5阻滯劑Pimozide對iNOS表達(dá)以及一氧化氮合成過程中發(fā)揮的具體作用。本實驗結(jié)果表明,于2.5～10 μmol·L-1之間內(nèi)的Pimozide,可有效阻滯脂多糖誘導(dǎo)的iNOS蛋白、iNOS mRNA表達(dá)以及一氧化氮的釋放。

本實驗也探討了Pimozide對磷酸化信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子通路-5蛋白表達(dá)水平的影響。有資料結(jié)果顯示,磷酸化信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子通路-5蛋白在脂多糖誘導(dǎo)3 h后到達(dá)峰值[15],本實驗中Pimozide對LPS誘導(dǎo)的磷酸化信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子通路-5蛋白水平表達(dá)具有阻滯效果。MTT實驗結(jié)果顯示,這種阻滯作用與藥物自身的活性相關(guān),而不是通過對巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞的毒性作用。鑒于氟哌啶醇和利培酮等其他多巴胺受體阻滯劑對iNOS的表達(dá)無影響[16],故推測Pimozide對信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子通路-5通路的阻滯作用的機制,可能是減少一氧化氮釋放。

4 結(jié)論

STAT5抑制劑Pimozide可從蛋白和mRNA層面抑制巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞中脂多糖誘導(dǎo)的iNOS表達(dá),從而減少一氧化氮的釋放。阻滯磷酸化信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子通路-5蛋白水平的表達(dá),有望成為治療一氧化氮引起的炎癥疾病的新手段,因此為更深入的分子生物學(xué)研究,還需要做大量工作。