王業(yè)忠,楊明華,曹少鋒,梅璐

(鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科,河南 鄭州 450052)

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一,在全世界所有腫瘤中發(fā)病率位于第5位,病死率位居第4位[1]。胃癌的主要治療方式為手術(shù)、放療、化療和靶向治療。但胃癌患者多數(shù)就診時(shí)已為中晚期,治療效果欠佳[2]。近年來,免疫治療在胃癌中取得了重要進(jìn)展,與常規(guī)治療相比,免疫治療通過增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫功能,產(chǎn)生抗腫瘤作用。免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療是一種最主要的免疫療法。然而,免疫治療并不是對(duì)所有患者都有效果,對(duì)一部分人療效甚微,甚至完全沒有作用[3-4],因此需要進(jìn)一步提高免疫治療的效果。另外,胃癌具有高度的異質(zhì)性,在臨床上表現(xiàn)出不同的組織病理學(xué)類型[5],目前仍缺少有助于選擇個(gè)性化治療方案的生物標(biāo)志物。

7-脫氫膽固醇還原酶(7-dehydrocholesterol reductase,DHCR7)是膽固醇合成中的關(guān)鍵代謝基因,參與體內(nèi)膽固醇合成途徑中的前體物質(zhì)合成,將7-脫氫膽固醇轉(zhuǎn)化為膽固醇[6]。近年來發(fā)現(xiàn)DHCR7在多種腫瘤中呈現(xiàn)異常表達(dá)[7-8],但關(guān)于胃癌的研究相對(duì)較少,因此,本研究通過分析多種數(shù)據(jù)庫(kù)中胃癌的測(cè)序數(shù)據(jù)集,探究DHCR7基因在胃癌中的表達(dá)與免疫相關(guān)基因的關(guān)系,為胃癌的免疫治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)分析

通過Ualcan(http://ualcan.path.uab.edu/analysis.html)、TIMER(http://cistrome.dfci.harvard.edu/TIMER/)數(shù)據(jù)庫(kù)分析DHCR7在不同類型腫瘤中的表達(dá)情況。通過GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/)數(shù)據(jù)庫(kù)[9]、TCGA (https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga)數(shù)據(jù)庫(kù)以及GEO(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)數(shù)據(jù)庫(kù)分析胃癌組織和正常組織中DHCR7的表達(dá)差異。通過Kaplan-Meier Plotter(www.kmplot.com)數(shù)據(jù)庫(kù)分析DHCR7表達(dá)與胃癌患者生存相關(guān)性。利用cBioPortal(http://www.cbioportal.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)[10]找出與DHCR7共表達(dá)的基因,并通過R(Pheatmap)軟件包展示與DHCR7正負(fù)相關(guān)的基因。

1.2 GEO數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)來源

從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中下載GSE79973基因表達(dá)數(shù)據(jù),測(cè)序平臺(tái)為GPL570(HG-U133_Plus_2)Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array;共有10例胃癌組織與配對(duì)的癌旁組織。

1.3 基因功能及通路分析

利用Metascape(https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)基因功能注釋分析工具,對(duì)與DHCR7基因正負(fù)相關(guān)基因進(jìn)行基因本體分析(geneontology,GO)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析。

1.4 DHCR7表達(dá)水平與CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān)性分析

基于TIMER(http://cistrome.dfci.harvard.edu/TIMER/)數(shù)據(jù)庫(kù)分析DHCR7在胃癌組織中與CD8+T免疫細(xì)胞浸潤(rùn)關(guān)系,TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)綜合TIMER、XCELL、MCPCOUNTER、 CIBERSORT等算法對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的樣本進(jìn)行免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分析,并提供了可視化線上工具[11]。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中DHCR7表達(dá)值采用兩獨(dú)立樣本校正t檢驗(yàn)。GEO數(shù)據(jù)庫(kù)使用GEO2R在線分析功能,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)為adj.P<0.05且|log2FC|>2,adj.P為調(diào)整后的P值,FC為差異倍數(shù)。生存分析在Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)中采用log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行。從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)下載DHCR7與免疫相關(guān)基因表達(dá)數(shù)據(jù),并利用GraphPad 8.0軟件中分析繪制相關(guān)性統(tǒng)計(jì)圖,P<0.05代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中DHCR7表達(dá)與臨床病理學(xué)參數(shù)相關(guān)性使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,采取χ2檢驗(yàn)或連續(xù)校正χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 DHCR7在多種類型腫瘤中高表達(dá)

通過分析ULCAN(圖1A)、TIMER(圖1B)數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù),DHCR7在胃癌、膀胱癌、乳腺癌、結(jié)腸腺癌、食管癌、頭頸部癌、肺部鱗狀細(xì)胞癌等大多數(shù)腫瘤類型中的表達(dá)均高于各自的癌旁組織。

A為ULCAN數(shù)據(jù)庫(kù);B為TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)。

2.2 DHCR7基因在胃癌的表達(dá)以及與胃癌患者預(yù)后相關(guān)性分析

通過不同的數(shù)據(jù)庫(kù)分析DHCR7在胃癌患者中的表達(dá)情況。首先分析GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)408例胃癌患者和211例正常人的基因表達(dá)數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)DHCR7的表達(dá)高于正常組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2A)。TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中384例胃癌患者和37例健康人DHCR7的表達(dá)數(shù)據(jù)也顯示DHCR7在胃癌患者中高表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2B)。GSE79973芯片數(shù)據(jù)集的10例胃癌患者和10例健康人DHCR7基因表達(dá)數(shù)據(jù)同樣提示DHCR7在胃癌患者中高表達(dá)(P<0.05)(圖2C)。其次分析DHCR7在胃癌患者中高表達(dá)是否會(huì)影響患者預(yù)后,Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)基因芯片數(shù)據(jù)(Affy ID:201790-s-at)顯示DHCR7高表達(dá)組患者遠(yuǎn)期生存率下降(P<0.05)(圖2D)。以上結(jié)果說明DHCR7在胃癌患者中高表達(dá),并且高表達(dá)DHCR7與胃癌患者不良預(yù)后相關(guān)。

A為GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)(*P<0.05)、B為TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)、C為GEO數(shù)據(jù)庫(kù),3種數(shù)據(jù)庫(kù)分析DHCR7基因在胃癌組織與正常組織的表達(dá)情況;D為DHCR7基因的高低表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的生存曲線。

2.3 在胃癌中與DHCR7共表達(dá)基因分析

進(jìn)一步分析胃癌中與DHCR7表達(dá)相關(guān)的基因,使用cBioPortal數(shù)據(jù)庫(kù)得出與DHCR7表達(dá)正負(fù)相關(guān)的基因,并通過R軟件包對(duì)相關(guān)系數(shù)高的基因進(jìn)行聚類圖分析,在熱圖中可視化了前25個(gè)正相關(guān)基因(圖3A)和前25個(gè)負(fù)相關(guān)基因(圖3B)。

A為與DHCR7正相關(guān)基因聚類分析;B為與DHCR7負(fù)相關(guān)基因聚類分析。

2.4 DHCR7功能富集分析

為了探究DHCR7在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮的功能,對(duì)胃癌中與DHCR7共表達(dá)基因中正負(fù)相關(guān)基因進(jìn)行功能富集分析,正相關(guān)基因的GO分析主要富集在類固醇生物合成過程、線粒體膜、有機(jī)磷酸代謝、線粒體組織等相關(guān)功能上(圖4A);正相關(guān)基因的KEGG通路富集分析主要富集在類固醇生物合成、萜類骨架的生物合成、碳代謝、脂肪酸代謝、氨基酸的生物合成等通路(圖4B),負(fù)相關(guān)基因的GO分析富集在白細(xì)胞激活、免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)、調(diào)控細(xì)胞因子、T細(xì)胞激活等免疫功能上(圖5A);負(fù)相關(guān)基因的KEGG通路富集分析富集在參與調(diào)節(jié)IgA產(chǎn)生的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)、Toll樣受體信號(hào)通路、病毒蛋白與細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體的相互作用等免疫相關(guān)信號(hào)通路(圖5B)。

A為GO分析;B為KEGG分析。

A為GO分析;B為KEGG分析。

2.5 DHCR7與CD8+T細(xì)胞以及招募CD8+T細(xì)胞相關(guān)趨化因子的相關(guān)性分析

上述功能富集分析結(jié)果提示,DHCR7基因表達(dá)可能在胃癌免疫微環(huán)境發(fā)揮免疫抑制作用,進(jìn)一步分析DHCR7與免疫系統(tǒng)中重要的抗腫瘤免疫細(xì)胞CD8+T細(xì)胞之間的相關(guān)性, XCELL(圖6A,r=-0.346,P<0.05)、CIBERSORT(圖6B,r=-0.195,P<0.05)、 MCPCOUNTER(圖6C,r=-0.113,P<0.05)、TIMER(圖6D,r=-0.241,P<0.05)4種分析方法均顯示DHCR7基因與CD8+T細(xì)胞具有較高的負(fù)相關(guān)性,并且DHCR7基因與招募CD8+T細(xì)胞相關(guān)的趨化因子CCL5(圖6E,r=-0.42,P<0.05)、CXCL9(圖6F,r=-0.20,P<0.05)、CXCL10(圖6G,r=-0.13,P<0.05)、CXCL13(圖6H,r=-0.41,P<0.05)也具有很高的負(fù)相關(guān)性,提示DHCR7可能是通過調(diào)控CCL5、CXCL9、CXCL10、CXCL13的表達(dá)進(jìn)而影響CD8+T細(xì)胞的浸潤(rùn)。

A為XCELL;B為CIBERSORT;C為MCPCOUNTER;D為TIMER。4種算法進(jìn)行免疫浸潤(rùn)評(píng)估,分析DHCR7基因與CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)關(guān)系;DHCR7與招募CD8+T細(xì)胞相關(guān)趨化因子(E為CCL5;F為CXCL9;G為CXCL10;H為CXCL13)的相關(guān)性分析。

2.6 DHCR7與免疫激活相關(guān)基因的相關(guān)性分析

為了進(jìn)一步探討DHCR7是否參與免疫相關(guān)調(diào)節(jié)機(jī)制,本研究分析了DHCR7與免疫激活相關(guān)基因(IFN-γ、GZMB、GZMH、GZMK、PRF1、IL2)的相關(guān)性(圖7A～F),結(jié)果發(fā)現(xiàn)DHCR7與這些免疫分子均呈負(fù)相關(guān)性,其中IFN-γ(r=-0.20,P<0.05);GZMB(r=-0.16,P<0.05);GZMH(r=-0.28,P<0.05);GZMK(r=-0.49,P<0.05);PRF1(r=-0.21,P<0.05);IL2(r=-0.27,P<0.05)。

分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)胃癌中DHCR7與免疫激活相關(guān)基因(A為IFN-γ;B為GZMB;C為GZMH;D為GZMK;E為PRF1;F為IL2)的相關(guān)性。

2.7 胃癌組織中DHCR7的表達(dá)與患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

最后,本研究對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中DHCR7表達(dá)與胃癌患者臨床特征進(jìn)行了分析(表1),結(jié)果發(fā)現(xiàn)DHCR7表達(dá)與胃癌患者年齡呈正相關(guān)(P<0.001),而與患者性別(P=0.068)、腫瘤浸潤(rùn)深度(P=0.333)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.912)、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移(P=0.655)以及分期(P=0.462)無相關(guān)性。

表1 TCGA數(shù)據(jù)分析DHCR7表達(dá)與胃癌患者臨床 病理學(xué)特征的關(guān)聯(lián)(n)

3 討論

腫瘤的代謝重編程是維持腫瘤惡性生物學(xué)行為的重要方式,腫瘤的代謝異常能夠使腫瘤在缺氧和營(yíng)養(yǎng)缺乏的環(huán)境中獲得生存,并且代謝產(chǎn)物更能夠抑制免疫反應(yīng),有助于腫瘤逃避宿主的免疫殺傷[12]。例如,磷酸甘油酸脫氫酶(phosphoglycerate dehydrogenase,PHGDH)是絲氨酸代謝的關(guān)鍵基因,該基因能夠調(diào)控巨噬細(xì)胞的極化,抑制PHGDH基因表達(dá),可以增強(qiáng)干擾素-β(interferon-β,IFN-β)介導(dǎo)的抗病毒先天免疫[13]。在腫瘤微環(huán)境中吲哚胺2,3-雙加氧酶可以催化色氨酸分解代謝為犬尿氨酸,進(jìn)而激活CD4+T細(xì)胞中的芳烴受體,使其分化為免疫抑制調(diào)節(jié)T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)[14]。一些免疫抑制細(xì)胞如Treg細(xì)胞、M2型巨噬細(xì)胞表達(dá)的精氨酸酶1通過降解精氨酸抑制免疫反應(yīng),在腫瘤微環(huán)境中通過補(bǔ)充精氨酸或抑制其降解,同時(shí)聯(lián)合細(xì)胞程序性死亡-配體1免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療,可以顯著提高免疫療效[14]。因此,研究腫瘤微環(huán)境中能夠產(chǎn)生免疫抑制性的關(guān)鍵代謝基因以及如何調(diào)控腫瘤微環(huán)境是提高腫瘤免疫治療的有效策略。

DHCR7作為膽固醇合成的關(guān)鍵代謝基因,可以將7-脫氫膽固醇轉(zhuǎn)化為膽固醇,參與調(diào)控膽固醇與維生素D3的動(dòng)態(tài)平衡[15]。研究結(jié)果顯示,DHCR7在宮頸癌中高表達(dá),高表達(dá)DHCR7可能是宮頸癌預(yù)后不良的生物標(biāo)志物[7]。在膀胱癌中,DHCR7可以通過調(diào)控PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤發(fā)生[8]。另有研究結(jié)果顯示,抑制膽固醇代謝通路中的DHCR7能引起7-脫氫膽固醇積累,進(jìn)而激活絲氨酸/蘇氨酸激酶3和干擾素調(diào)節(jié)因子3,導(dǎo)致病毒感染后IFN-β的提高和抗病毒反應(yīng),為膽固醇代謝重編程調(diào)控天然免疫提供了新的研究思路[16]。本研究通過分析多種數(shù)據(jù)庫(kù)中胃癌的測(cè)序數(shù)據(jù)集,探究DHCR7基因在胃癌中的表達(dá)及其在胃癌免疫微環(huán)境中的作用,GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)、TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)以及GEO數(shù)據(jù)庫(kù)3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的結(jié)果均發(fā)現(xiàn)DHCR7在胃癌患者中高表達(dá),接下來分析DHCR7在胃癌的高表達(dá)是否可作為胃癌預(yù)后的潛在生物學(xué)分子標(biāo)志物,結(jié)果發(fā)現(xiàn)DHCR7高表達(dá)胃癌患者遠(yuǎn)期生存率低,提示其可作為胃癌患者手術(shù)后轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等不良預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物,為評(píng)估胃癌患者的生存期提供基礎(chǔ)。以上結(jié)果說明DHCR7在胃癌的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮了重要作用,進(jìn)一步探究DHCR7是通過何種機(jī)制影響胃癌進(jìn)展,從cBioPortal數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得了與DHCR7的共表達(dá)基因,并在熱圖中可視化了前50個(gè)正相關(guān)基因和前50個(gè)負(fù)相關(guān)基因。使用Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)分析了正負(fù)相關(guān)基因的GO和KEGG通路。負(fù)相關(guān)基因的GO分析富集在白細(xì)胞激活、免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)、調(diào)控細(xì)胞因子、T細(xì)胞激活等免疫功能上;負(fù)相關(guān)基因的KEGG通路富集分析富集在參與調(diào)節(jié)IgA產(chǎn)生的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)、Toll樣受體信號(hào)通路、病毒蛋白與細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體的相互作用等免疫相關(guān)信號(hào)通路。其中Toll樣受體被視為連接固有免疫和先天免疫的橋梁,通過識(shí)別相應(yīng)的模式識(shí)別受體,可以上調(diào)細(xì)胞因子、趨化因子等激活先天性免疫[17]。這些結(jié)果提示胃癌中DHCR7基因表達(dá)可能對(duì)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生一定抑制作用,進(jìn)而影響免疫系統(tǒng)發(fā)揮抗腫瘤作用。由于CD8+T細(xì)胞是重要的抗腫瘤免疫細(xì)胞,若患者缺乏CD8+T細(xì)胞的浸潤(rùn),則無法響應(yīng)免疫檢查點(diǎn)抑制劑的治療。因此,進(jìn)一步分析了DHCR7與CD8+T細(xì)胞之間的相關(guān)性,多種免疫評(píng)估方法得到的結(jié)果均顯示DHCR7基因與CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)呈負(fù)相關(guān)性,并且與招募CD8+T細(xì)胞相關(guān)的趨化因子CCL5、CXCL9、CXCL10、CXCL13也與DHCR7具有負(fù)相關(guān)性。鑒于CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答的激活與某些上調(diào)的信號(hào)有關(guān)[18],接下來分析了DHCR7與免疫激活相關(guān)基因(IFN-γ、GZMB、GZMH、GZMK、PRF1、IL2)的相關(guān)性,同樣發(fā)現(xiàn)DHCR7與這些免疫分子均呈負(fù)相關(guān)性。最后回歸臨床,分析胃癌組織中DHCR7的表達(dá)與患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系,從而為胃癌的臨床治療提供依據(jù)。

綜上所述,DHCR7在胃癌組織中高表達(dá),腫瘤中高表達(dá)的DHCR7在胃癌患者中表現(xiàn)出較差的生存率。DHCR7在抑制CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫中發(fā)揮重要作用,其機(jī)制可能是通過調(diào)控CCL5、CXCL9、CXCL10、CXCL13趨化因子的表達(dá)進(jìn)而抑制CD8+T細(xì)胞的浸潤(rùn)。同時(shí),DHCR7能夠抑制多種胃癌免疫激活相關(guān)基因的表達(dá),提示DHCR7可能通過在腫瘤微環(huán)境中誘導(dǎo)免疫抑制機(jī)制促進(jìn)胃癌的發(fā)生發(fā)展。但此研究?jī)H限于生物學(xué)信息分析,后續(xù)仍需通過大量的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證,從而明確DHCR7在胃癌中的調(diào)控機(jī)制。

4 結(jié)論

本研究通過多種數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù)挖掘,探討了DHCR7在胃癌中的表達(dá)及其在胃癌免疫微環(huán)境中的作用,結(jié)果表明DHCR7在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮了免疫抑制作用,并參與了胃癌的進(jìn)展,后續(xù)通過基因沉默或抑制DHCR7的藥物來阻斷DHCR7表達(dá),可能會(huì)提高胃癌免疫治療的效果。靶向DHCR7在胃癌免疫治療中具有良好的治療前景。