梁穗新 提運(yùn)幸 黃駿榮 李秀紅 周雯嘉

腦白質(zhì)損傷是嬰幼兒手術(shù)后常見(jiàn)的并發(fā)癥,及早產(chǎn)兒出生時(shí)易發(fā)的一類(lèi)腦損傷[1]。先天性心臟病是人類(lèi)最常見(jiàn)的先天性異常,約有25%患兒需要在生命的第1年進(jìn)行密集的外科干預(yù)[2]。然而,對(duì)腦白質(zhì)尚處于發(fā)育過(guò)程的新生兒,心臟外科手術(shù)后極易誘發(fā)腦白質(zhì)損傷[3]。研究顯示,手術(shù)中體外循環(huán)和深低溫停循環(huán)仍是腦白質(zhì)損傷的重要危因[4,5]。在前期研究中,為模擬先天性心臟病患兒大腦在經(jīng)歷心臟手術(shù)中體外循環(huán)/深低溫停循環(huán)的過(guò)程,筆者構(gòu)建了離體新生幼鼠的腦切片灌流及氧糖剝奪(oxygen glucose deprivation, OGD)模型,結(jié)果發(fā)現(xiàn),腦部中的小膠質(zhì)細(xì)胞呈過(guò)度活化狀態(tài)和出現(xiàn)了腦損傷[6]。亞低溫在新生兒缺氧缺血性腦病治療的安全性及遠(yuǎn)期療效已得到證實(shí)[7]。然而,亞低溫在復(fù)溫階段適當(dāng)延遲是否更具有腦損傷保護(hù)效果,目前國(guó)內(nèi)外相關(guān)報(bào)道仍鮮少。基于此,本研究率先探討延遲亞低溫對(duì)OGD-復(fù)氧復(fù)糖誘導(dǎo)新生幼鼠腦白質(zhì)損傷的改善作用及其可能機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下。

材料與方法

1.主要儀器試劑:主要儀器:-80℃冰箱 (Thermo 700 SERIES,美國(guó)Thermo公司)、熒光倒置顯微鏡 (Nikon IX7,日本Nikon公司)、電子分析天平 (Kern770,德國(guó)Kern公司)、pH計(jì) (Satorius PB-10,德國(guó)Satorius公司)、超凈臺(tái)(Thermo d-63415,美國(guó)Thermo公司)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Biorad CFX96 Touch,美國(guó)Biorad公司);主要試劑:Hoechst 33342活細(xì)胞染色液(碧云天 C1028,中國(guó)碧云天公司)、MBP Antibody(Santa Cruz sc-271524,美國(guó)Santa Cruz公司)、O4 Antibody(Merk MAB345,美國(guó)Merk公司)、山羊抗小鼠IgG H&L(Abcam ab175473,英國(guó)Abcam公司);引物序列由上海生工合成,CD32正向引物:5′-AGGCCTGGTTTGCAGCTTT-3′,反向引物:5′-CTGCCTCGCAGGGTCTTG-3′;iNOS正向引物:5′-TCACGCTTGGGTCTTGTTCA-3′,反向引物:5′-CCTTTTCC TCTTTCAGGTCACTT-3′; CD206正向引物:5′-TGTATTCTTTGCCTTTCCCAGTCTC-3′,反向引物:5′-CCTCAAAACAGACTTACCCAATAGCTG-3′;IL-10正向引物:5′-CCCAGAAATCAAGGAGCATTTG-3′,反向引物:5′-CAGCTGTATCCAGAGGGTCTTCA-3′。

2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:7天齡SD大鼠40只,雌雄不拘,選取體質(zhì)量在10～16g之間[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào):SYXK(粵)2022-0002],由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(粵)2022-0002],本研究方案已由該動(dòng)物中心動(dòng)物倫理委員會(huì)審批通過(guò)(審批號(hào):B202008-13)。

3.全腦灌流和OGD模型建立:該模型建立方法參照前期研究,具體操作步驟為:將全部7天齡SD大鼠麻醉,無(wú)菌條件下迅速解剖大腦,并馬上放入人工腦脊液(section artificial cerebrospinal fluid, SaCSF)內(nèi)[6]。以400μm厚沿冠狀將大腦制成腦切片。馬上將腦切片放于氧合SaCSF培養(yǎng)皿中,培養(yǎng)條件為:37℃,95% 濕度,5% CO2,培養(yǎng)時(shí)間不少于1h。然后將腦切片轉(zhuǎn)入有灌流用人工腦脊液(perfusion artificial cerebrospinal fluid, PaCSF)的定制培養(yǎng)皿中。用管道將定制培養(yǎng)皿連接起來(lái),構(gòu)建成一個(gè)灌流系統(tǒng)。整個(gè)定制培養(yǎng)皿放于溫度可調(diào)的培養(yǎng)箱內(nèi),用以模擬體外循環(huán)灌注。通過(guò)改變?nèi)芤?模擬OGD,如用10mmol/L的蔗糖替換PaCSF中的葡萄糖,用95% N2/5% CO2進(jìn)行氣體混合。當(dāng)OGD結(jié)束時(shí),灌流液重新用PaCSF溶液和繼續(xù)行24h灌流。

4.亞低溫干預(yù)及分組:OGD完成后,用灌流溶液換成PaCSF溶液,將40個(gè)腦片隨機(jī)均分為4組,即對(duì)照組、24h組、48h組和72h組,即復(fù)溫至亞低溫(32℃)階段進(jìn)行持續(xù)灌流,維持不同時(shí)長(zhǎng)(0、24、48和72h)。亞低溫維持結(jié)束后再繼續(xù)復(fù)溫至36℃,并繼續(xù)維持灌注24h。對(duì)照組保持在36℃和維持同樣階段繼續(xù)灌流氧合PaCSF。

5.免疫熒光鑒定:灌注流程走完,馬上拿出腦切片,加入4%多聚甲醛(paraformaldehyde, PFA)在室溫下固定1h,用磷酸鹽緩沖生理鹽水(phosphate buffered saline, PBS)洗3遍。再加30%蔗糖溶液,放4℃冰箱一夜。第2天將其完全脫水,用OCT包埋劑將腦切片包埋;再用冰凍切片機(jī)將其制成20μm厚并放于載玻片上。室溫下用含10%山羊血清(goat serum,GS)及5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)的封閉液封閉1h。按說(shuō)明書(shū)稀釋好少突膠質(zhì)前體細(xì)胞(oligodendrocyte precursor cell,O4)、髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein, MBP)的一抗,對(duì)切片進(jìn)行孵育,放濕盒后在4℃冰箱一夜。第2天,用PBS洗玻片3次,再聯(lián)有熒光的二抗,孵育玻片的步驟與一抗相同,室溫避光1.0～1.5h。取出來(lái)用PBS沖洗3遍。再用防淬滅封片劑進(jìn)行封片,鏡下觀察。其中,定性觀察比較MBP蛋白熒光強(qiáng)度;定量分析O4陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量,每張切片隨機(jī)取3個(gè)視野,計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量后求均值。

6.實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定:切取腦切片部分組織,選取出其中的腦白質(zhì),用TRI Reagent提取各組織中的總RNA,用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。按SYBR Green PCR kit說(shuō)明書(shū)建立PCR反應(yīng)體系,實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)在CFX96 Touch實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。內(nèi)參基因選用β-actin,采用2-△△Ct法計(jì)算CD32、一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、CD206和白細(xì)胞介素-10(interleukin-10,IL-10)基因的相對(duì)表達(dá)量。

結(jié) 果

1.延遲亞低溫減輕腦白質(zhì)損傷:用免疫熒光定性分析不同延遲時(shí)間下亞低溫對(duì)MBP表達(dá)的影響,結(jié)果表明在亞低溫32℃延遲24、48和72h組MBP蛋白熒光強(qiáng)度均高于對(duì)照組,并且MBP蛋白熒光強(qiáng)度隨著延遲亞低溫時(shí)長(zhǎng)的增加而呈遞增的趨勢(shì),詳見(jiàn)圖1。

圖1 各組離體腦切片MBP免疫熒光鑒定

2.延遲亞低溫增加O4陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量:用免疫熒光分析不同延遲時(shí)間下亞低溫對(duì)O4陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量的影響,結(jié)果表明在亞低溫32℃延遲24、48和72h組O4陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量均高于對(duì)照組(F=314.907,P<0.001),且發(fā)現(xiàn)O4陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量的增加與延遲亞低溫時(shí)長(zhǎng)呈顯著正相關(guān)(r=0.968,P<0.001),詳見(jiàn)圖2和表1。

表1 各組離體腦切片O4陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量、M1和M2型小膠質(zhì)細(xì)胞的變化比較

圖2 各組離體腦切片O4陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量

3.延遲亞低溫降低M1型小膠質(zhì)細(xì)胞的極化并促進(jìn)M2型的極化:用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析不同延遲時(shí)間下亞低溫對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞極化的影響,結(jié)果表明在亞低溫32℃延遲24、48和72h組M1型小膠質(zhì)細(xì)胞的CD32、iNOS表達(dá)均低于對(duì)照組(F分別為41.451、92.912,P均<0.001),且CD32、iNOS表達(dá)均與延遲亞低溫時(shí)長(zhǎng)呈顯著負(fù)相關(guān)(r分別為-0.868、-0.916,P均<0.001);M2型小膠質(zhì)細(xì)胞的CD206、IL-10表達(dá)均高于對(duì)照組(F分別為79.699、63.839,P均<0.001),且CD206、IL-10表達(dá)均與延遲亞低溫時(shí)長(zhǎng)呈顯著負(fù)相關(guān)(r分別為0.862、0.910,P均<0.001),詳見(jiàn)表1。

討 論

先天性心臟病是一類(lèi)十分常見(jiàn)的出生缺陷性疾病[8]。在英國(guó),嬰兒先天性心臟病的發(fā)生率為0.9%;而我國(guó)則高達(dá)2.4%～10.4%[9]。隨著醫(yī)學(xué)外科技術(shù)、體外循環(huán)和重癥監(jiān)護(hù)技術(shù)等發(fā)展,先天性心臟病的致死率也隨之降低[10]。然而,據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示,高達(dá)67%的患兒術(shù)后發(fā)生腦損傷[11]。目前,對(duì)手術(shù)中體外循環(huán)和深低溫停循環(huán)誘發(fā)的腦白質(zhì)損傷的研究主要集中于改進(jìn)體外循環(huán)和主動(dòng)脈阻斷方式,對(duì)于術(shù)后復(fù)溫至亞低溫的研究仍為空白。

MBP是中樞神經(jīng)的髓鞘膜蛋白,是少突膠質(zhì)髓鞘最豐富的結(jié)構(gòu)蛋白。當(dāng)缺血缺氧性腦病發(fā)生后,腦白質(zhì)脫髓鞘致使神經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)受累,損害機(jī)體行為認(rèn)知功能[12]。當(dāng)腦損傷發(fā)生時(shí),MBP水平會(huì)明顯變高[13]。MBP表達(dá)的改變可作為腦白質(zhì)損傷程度的指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)在亞低溫32℃延遲24、48和72h組MBP蛋白熒光強(qiáng)度均高于對(duì)照組,且MBP蛋白熒光強(qiáng)度隨著延遲亞低溫時(shí)長(zhǎng)的增加而呈遞增的趨勢(shì),提示延遲亞低溫能有效減輕腦白質(zhì)損傷。亞低溫治療在缺血缺氧神經(jīng)元中的積極作用已經(jīng)得到證實(shí)[14]。據(jù)研究表明,適當(dāng)?shù)捏w溫下降有助于維持腦皮質(zhì)的正常生理功能、降低腦部氧的代謝、保障血-腦脊液屏障功能、控制神經(jīng)遞質(zhì)大量分泌、減輕炎性反應(yīng)、加快神經(jīng)干的增殖和增加神經(jīng)元數(shù)量,從而起到保護(hù)中樞神經(jīng)的作用,以上研究結(jié)論與本研究基本一致[15]。

少突膠質(zhì)細(xì)胞是腦部白質(zhì)膠質(zhì)細(xì)胞群中最為重要的成員[16]。O4是少突膠質(zhì)細(xì)胞的前體,在胚胎成長(zhǎng)和嬰幼兒期的中樞神經(jīng)系統(tǒng)完善進(jìn)程中起著重要作用[17]。本研究發(fā)現(xiàn),在亞低溫32℃延遲24、48和72h組O4陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量均高于對(duì)照組,且發(fā)現(xiàn)O4陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量的增加與延遲亞低溫時(shí)長(zhǎng)呈顯著正相關(guān),提示延遲亞低溫發(fā)揮腦白質(zhì)損傷的作用,其機(jī)制可能與增加O4陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量有關(guān)。未發(fā)育完善的少突膠質(zhì)細(xì)胞易損性特征如下:30周胎齡中的腦白質(zhì)最主要細(xì)胞是O4,一旦發(fā)生缺氧缺血時(shí),炎性細(xì)胞因子、興奮性氨基酸和氧自由基等將對(duì)O4造成嚴(yán)重?fù)p傷。早期MBP的表達(dá)減少是少突膠質(zhì)細(xì)胞功能障礙所致,持續(xù)的MBP表達(dá)受抑制則是反映了少突膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量的損傷。有研究表明,新生大鼠腦白質(zhì)損傷的改善與O4細(xì)胞存活量呈相關(guān)性,通過(guò)移植O4細(xì)胞能有效發(fā)揮腦白質(zhì)損傷的保護(hù)作用,該發(fā)現(xiàn)與本研究結(jié)果基本一致[18]。

腦白質(zhì)損傷后一般可激活小膠質(zhì)細(xì)胞,而活化態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞主要分為兩類(lèi),即促炎M1型和抗炎M2型[18]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),在亞低溫32℃延遲24、48和72h組M1型小膠質(zhì)細(xì)胞的CD32、iNOS表達(dá)均低于對(duì)照組,且CD32、iNOS表達(dá)均與延遲亞低溫時(shí)長(zhǎng)呈顯著負(fù)相關(guān);M2型小膠質(zhì)細(xì)胞的CD206、IL-10表達(dá)均高于對(duì)照組,且CD206、IL-10表達(dá)均與延遲亞低溫時(shí)長(zhǎng)呈顯著負(fù)相關(guān),提示延遲亞低溫發(fā)揮腦白質(zhì)損傷的作用,其機(jī)制可能也與降低小膠質(zhì)細(xì)胞M1型的極化和促進(jìn)M2型極化有關(guān)。其可能的原因是延遲亞低溫促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞的M2型極化,進(jìn)而減緩了炎性反應(yīng)的加劇和改善神經(jīng)功能修復(fù),從而保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)[19]。在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中均發(fā)現(xiàn),低溫可明顯抑制小膠質(zhì)細(xì)胞OGD-復(fù)糖復(fù)氧時(shí)向M1型極化,并促進(jìn)M2型極化[20]。從而誘導(dǎo)少突膠質(zhì)細(xì)胞的分化成熟,抑制炎性反應(yīng),發(fā)揮對(duì)腦缺血后腦白質(zhì)損傷的保護(hù)作用。以上結(jié)論與本研究基本一致。故在腦部早期抗炎防治過(guò)程中,除控制小膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度活化外,平衡小膠質(zhì)細(xì)胞M1/M2活化的比例,也是一種神經(jīng)炎癥的治療策略。然而,本研究并無(wú)使用干預(yù)手段,少突膠質(zhì)前體細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞是否確切參與治療作用,仍有待于進(jìn)一步探究。

綜上所述,延遲亞低溫能有效改善OGD-復(fù)氧復(fù)糖誘導(dǎo)的新生幼鼠腦白質(zhì)損傷,其機(jī)制可能與增加O4數(shù)量和促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型極化有關(guān)。該研究有望為制訂新生兒和嬰幼兒心臟外科術(shù)后腦保護(hù)策略提供重要線索和思路。然而,本研究仍存在一定的局限性,目前只用離體新生幼鼠的腦切片灌流及OGD模型體外模擬大腦在經(jīng)歷手術(shù)中體外循環(huán)/深低溫停循環(huán)的過(guò)程,仍需進(jìn)一步開(kāi)展體內(nèi)研究予以證實(shí)。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。