王有恒 王學(xué)惠

高血壓是心血管疾病的誘因之一,且高血壓發(fā)生率逐年升高[1]。多項研究表明,長期高血壓可通過心肌細胞氧化應(yīng)激、心肌纖維化引起心肌肥大,最終導(dǎo)致心力衰竭[2]。血管緊張素Ⅱ (angiotensin-Ⅱ, Ang-Ⅱ) 是哺乳動物體內(nèi)重要的血壓及體液調(diào)節(jié)激素,是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosterone,RAAS)的關(guān)鍵效應(yīng)分子[3]。長期的Ang-Ⅱ水平升高導(dǎo)致心肌肥大、氧化應(yīng)激、纖維化等,促進心力衰竭發(fā)生,并激活多種參與心肌肥大的信號分子,包括沉默信息調(diào)節(jié)因子(silent information regulator,SIRT1)通路、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK) 信號通路等[2,4,5]。過量的Ang-Ⅱ可導(dǎo)致心肌細胞中活性氧(reactive oxygen species,ROS)的產(chǎn)生同時增加心肌細胞氧化應(yīng)激水平,抑制SIRT1通路[6]。

神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1(neuregulin 1,NRG-1)是一種從內(nèi)皮細胞釋放的心臟活性因子,對心臟發(fā)育、結(jié)構(gòu)和心臟功能完整性是不可或缺的[7]。研究表明,NRG-1通過促進擴張型心肌病心肌血管生成來緩解糖尿病或冠狀動脈疾病血管生成反應(yīng)受損[8]。但是,目前NRG-1對Ang-Ⅱ所誘導(dǎo)的心肌肥大研究較少,且具體機制尚未完全闡明?；谝陨媳尘?本研究通過Ang-Ⅱ誘導(dǎo)H9C2細胞肥大模型,觀察NRG-1處理后對心肌肥大的影響,并探索其作用機制,為NRG-1的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

材料與方法

1.藥物、試劑與儀器:NRG-1購自以色列ProSpec-Tany TechnoGene公司(貨號:CYT-407),用高壓滅菌后的純水稀釋成濃度為10μmol/L的母液,分裝至EP管中,-80℃冰箱凍存?zhèn)溆?。Ang-Ⅱ購自鄭州遠東生物科技有限公司,使用純水稀釋成10mmol/L母液,分裝至EP管中,-80℃冰箱凍存?zhèn)溆?。GAPDH蛋白抗體購自美國Proteintech 公司;心房鈉尿肽(atrial natriuretic peptide,ANP)、腦鈉肽(brain natriuretic peptide,BNP)、超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1,SOD1)、SIRT1、NADPH氧化酶2(NADPH oxidase isoform,NOX2)蛋白抗體購自萬類生物公司;線粒體膜電位試劑盒、鬼筆環(huán)肽染色試劑盒、活性氧檢測試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒均購自上海碧云天生物有限公司;1%青霉素/鏈霉素、10%胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購自美國Science Cell公司。CO2培養(yǎng)箱購自美國 Thermo 公司;低速離心機購自美國Thermo 公司;酶標儀購自美谷分子儀器有限公司;光學(xué)相差顯微鏡購自日本Nikon 公司;恒溫孵育箱購自中國常州國華有限公司、電子天平、-80℃冰箱購自美國Thermo Forma公司;電泳系統(tǒng)(BIO-RAD)、搖床購自中國其林貝爾儀器制造公司;超凈工作臺購自中國蘇州凈化公司;化學(xué)發(fā)光熒光成像系統(tǒng) Amersham Imager 600購自美國 GE 公司。

2.細胞系和細胞培養(yǎng):大鼠心肌細胞系H9C2購自中國科學(xué)院細胞庫(上海)(ATCC編號: CRL-1446)。細胞用10%胎牛血清及1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)條件,37℃、5%的CO2。使用胰蛋白酶進行消化傳代,細胞傳代3次后進行實驗,接種于細胞培養(yǎng)板中,當(dāng)細胞密度長至70%左右加入1μmol/L Ang-Ⅱ繼續(xù)培養(yǎng)24h來誘導(dǎo)細胞肥大。

3.CCK-8 試劑盒檢測 H9C2 細胞活力:將H9C2細胞接種于96孔板中,每孔接種7000個細胞,孵育24h,加入不同濃度的Ang-Ⅱ(0、0.25、0.5、0.75、1、1.25μmol/L)及NRG-1(0、5、10、15、20、25nmol/L)進行處理,每個濃度設(shè)置6個復(fù)孔,繼續(xù)培養(yǎng)24h,隨后加入100μl培養(yǎng)基洗滌2～3遍,加入10μl的CCK-8試劑,繼續(xù)孵育4h,用酶標儀檢測450nm處的吸光度并進行統(tǒng)計學(xué)分析,實驗重復(fù)3次。

4.H9C2 細胞骨架染色:將細胞接種于6孔板中,待使用不用藥物處理后,使用PBS配制3.7%甲醛(避免使用含有甲醇的甲醛)溶液室溫固定細胞約10～20min。使用1% Triton X-100的PBS洗滌2～4次,每次5min。然后使用含有5%BSA和0.1% Triton X-100的PBS按照1∶100的比例稀釋鬼筆環(huán)肽母液即為工作液,每孔中加入1ml工作液,室溫避光孵育30～60min,使用0.1% Triton X-100的PBS洗滌2～4次,每次5min,隨后熒光顯微鏡進行觀察并拍照。使用Image-J軟件進行分析并計算細胞表面積。每組測量30個細胞進行測量取平均值。

5.檢測ROS含量:使用無血清培養(yǎng)基稀釋DCFH-DA母液(10mmol/L)至終濃度(10μmol/L)作為工作液。PBS洗滌分別使用不同藥物處理過的細胞,加入DCFH-DA工作液1ml,放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育20min,然后使用無血清養(yǎng)基洗滌細胞3遍,使用熒光顯微鏡觀察并拍照,使用Image-J軟件進行熒光強度測定。

6.JC-1檢測細胞線粒體膜電位:將細胞接種于6孔板中,配置JC-1工作液:將母液(×200)加入JC-1緩沖液中稀釋200倍配置成為工作液待用。PBS洗滌分別使用不同藥物處理過的細胞,加入JC-1工作液1ml,放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育20min,然后使用無血清養(yǎng)基進行洗滌,用熒光顯微鏡觀察并拍照,使用Image-J軟件進行熒光強度測定。

7.Western blot法檢測細胞中ANP、BNP、SOD1、SIRT1、NOX2蛋白表達:將接種于6孔板中給予相應(yīng)處理后的細胞,使用PBS沖洗2遍,加入裂解液,使用超聲裂解儀裂解4次,100℃煮蛋白10min使蛋白變性后,冷卻至室溫,離心2min,置于-80℃冰箱中備用。BCA 法測定蛋白濃度。根據(jù)蛋白濃度調(diào)整上樣量后進行電泳。電泳結(jié)束后行濕法轉(zhuǎn)膜,按照1∶1000比例配置相應(yīng)抗體后,一抗孵育過夜后,使用TBST洗膜3遍,孵育二抗1.0～1.5h,再次用 TBST 洗滌 3 次,配置顯色液曝光。Image-J 軟件分析其灰度值,以目標蛋白條帶灰度值/內(nèi)參(GAPDH)灰度值表示相應(yīng)目的蛋白。

結(jié) 果

1.Ang-Ⅱ及NRG-1對H9C2細胞活力的影響:將H9C2細胞接種于96孔板中,加入不同濃度的Ang-Ⅱ進行處理24h,檢測H9C2細胞活性。結(jié)果顯示,與空白組比較,隨著Ang-Ⅱ濃度升高,細胞活力先升高后降低。在1μmol/L Ang-Ⅱ處理細胞時活力接近正常水平,選取1μmol/L為實驗濃度,并驗證其對細胞表面積的影響。同時測定不同濃度NRG-1對細胞活力的影響,發(fā)現(xiàn)25nmol/L NRG-1對細胞具有損傷作用,選取20nmol/L為實驗濃度進行后續(xù)實驗(圖1)。

圖1 Ang-Ⅱ與NRG-1處理H9C2細胞后檢測其細胞活力

2.NRG-1對H9C2細胞表面積的影響:經(jīng)Ang-Ⅱ(1μmol/L)處理24h后,檢測H9C2細胞面積。與空白組比較,模型組細胞表面積明顯增加(P<0.05),使用濃度為20nmol/L的NRG-1預(yù)處理后,可改善Ang-Ⅱ引起的心肌細胞表面積增加, 經(jīng)過NRG-1處理的Ang-Ⅱ+NRG-1組vs模型組細胞面積為(860.0±101.4μm2vs 1335.6±165.5μm2,圖2)。

圖2 NRG-1對Ang-Ⅱ處理后的H9C2細胞表面積的影響(×400)

3.NRG-1對Ang-Ⅱ誘導(dǎo)的H9C2細胞肥大標志物的影響:經(jīng)Ang-Ⅱ(1μmol/L)處理24h后,檢測ANP、BNP肥大相關(guān)蛋白表達。與空白組比較,模型組ANP、BNP表達增加(P<0.05)。NRG-1(20nmol/L)可以抑制Ang-Ⅱ誘導(dǎo)的ANP、BNP蛋白表達(P<0.05),NRG-1能夠有效地抑制Ang-Ⅱ誘發(fā)的心肌肥大(圖3)。

圖3 NRG-1對Ang-Ⅱ誘導(dǎo)的H9C2細胞肥大標志物表達的影響

4.NRG-1對Ang-Ⅱ誘導(dǎo)的H9C2細胞線粒體膜電位的影響:經(jīng)Ang-Ⅱ(1μmol/L)處理24h后,檢測H9C2細胞線粒體膜電位水平。與空白組比較,

模型組可檢測到線粒體膜電位的下降(P<0.05),而使用NRG-1(20nmol/L)處理后,Ang-Ⅱ所誘導(dǎo)的線粒體膜電位下降明顯逆轉(zhuǎn)(P<0.05,圖4)。

圖4 NRG-1對Ang-Ⅱ誘導(dǎo)的H9C2細胞線粒體膜電位的影響(×40)

5.NRG-1對Ang-Ⅱ誘導(dǎo)的H9C2細胞ROS的影響:經(jīng)Ang-Ⅱ(1μmol/L)處理24h后,檢測H9C2細胞內(nèi)ROS水平。模型組較空白組ROS含量增加(P<0.05),與模型組比較,NRG-1(20nmol/L)組ROS含量較Ang-Ⅱ組明顯下降(P<0.05,圖5)。

圖5 NRG-1對Ang-Ⅱ誘導(dǎo)的心肌細胞內(nèi)ROS表達的影響(×10)

6.NRG-1對Ang-Ⅱ誘導(dǎo)的H9C2細胞氧化應(yīng)激的影響:經(jīng)Ang-Ⅱ(1μmol/L)處理24h后,檢測NOX2和SOD1氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達水平。NOX2是常見的產(chǎn)生ROS的蛋白,而SOD1是常見的抗氧化蛋白。與對照組比較,模型組NOX2明顯增加,SOD1顯著降低,而使用NRG-1預(yù)處理后可顯著抑制NOX2的表達,同時促進抗氧化蛋白SOD1的表達(圖6)。

圖6 NRG-1對Ang-Ⅱ誘導(dǎo)的H9C2細胞氧化應(yīng)激水平的影響

7.NRG-1對H9C2細胞SIRT1蛋白表達的影響:經(jīng)Ang-Ⅱ不同濃度(1μmol/L和2μmol/L)處理后,SIRT1表達顯著下降(P<0.05),但不同濃度Ang-Ⅱ之間處理后SIRT1水平比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。同時經(jīng)Ang-Ⅱ(1μmol/L)處理24h后,檢測SIRT1蛋白表達水平,顯示在Ang-Ⅱ處理后,SIRT1蛋白表達下降(P<0.05),然而NRG-1(20nmol/L)預(yù)處理后, SIRT1蛋白表達較模型組增加(P<0.05,圖7)。

圖7 NRG-1對Ang-Ⅱ誘導(dǎo)的H9C2細胞SIRT1蛋白水平的影響

8.SIRT1抑制劑對H9C2細胞NOX2蛋白表達的影響:為進一步驗證NRG-1的保護機制,使用SIRT1抑制劑(EX527)處理H9C2細胞24h,監(jiān)測H9C2細胞中SIRT1表達顯著下調(diào)(P<0.05)。同時驗證了通路相關(guān)蛋白NOX2表達,在EX527存在的情況下,NOX2蛋白表達顯著增加(P<0.05,圖8)。

圖8 SIRT1抑制劑EX527對SIRT1及NOX2蛋白表達的影響

討 論

多種心臟疾病如高血壓、冠心病、心臟瓣膜病等都可引起心肌肥大,最終導(dǎo)致心力衰竭。病理性心肌肥大是心力衰竭的機制之一[2]。因此,研究心肌肥大的潛在機制對預(yù)防心力衰竭具有重要意義。Ang-Ⅱ?qū)儆赗AAS系統(tǒng),是心臟重塑和心血管疾病的關(guān)鍵介質(zhì)。生理濃度的Ang-Ⅱ?qū)π难芟到y(tǒng)是有益的,但是Ang-Ⅱ過度分泌引起的心肌纖維化和肥大是導(dǎo)致心臟重構(gòu)的主要因素[9]。Ang-Ⅱ可以作用于心肌細胞,導(dǎo)致ANP、BNP水平增加。該指標已被認為可以反映心肌肥大程度及心室收縮和舒張功能情況。本研究使用Ang-Ⅱ處理H9C2細胞,構(gòu)建心肌細胞肥大模型,探究NRG-1是否改善心肌肥大并探討其潛在機制。

研究表明,氧化應(yīng)激是心肌肥大病理過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[10]。氧化應(yīng)激是氧化與抗氧化系統(tǒng)之間失衡的結(jié)果[11]。心血管系統(tǒng)中,ROS主要來源于線粒體,線粒體功能下降會導(dǎo)致ROS 產(chǎn)生過多,增加氧化應(yīng)激水平[12]。NADPH氧化酶與ROS生成密切相關(guān)[13]。NOX2在ROS的生成中起到電子供體的作用[14]。Ang-Ⅱ可以增加NOX2表達,損傷線粒體功能[15]。研究表明,NOX2可加重高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠心肌肥厚,其機制是通過增加ROS的產(chǎn)生,降低氧化應(yīng)激水平,然而在NOX2基因敲除小鼠中,高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠心肌肥厚顯著減輕[16]。

SOD1可以與鋅和銅離子結(jié)合,是體內(nèi)負責(zé)破壞自由基的三種超氧化物歧化酶之一。作為體內(nèi)一種重要的抗氧化物質(zhì),其可以清除體內(nèi)的ROS[17]。研究表明,在Ang-Ⅱ所誘導(dǎo)的心肌肥大過程中,SOD1被逐漸消耗,導(dǎo)致ROS 水平增加,引起心肌細胞損傷[18]。炎癥在心肌肥大中同樣起著至關(guān)重要的作用。NLRP3是炎癥通路中的關(guān)鍵介質(zhì)之一。ROS在整個NLRP3炎性小體激活過程中是不可或缺的。ROS可以調(diào)節(jié)NLRP3的啟動環(huán)節(jié),進而減少白細胞介素(interleukin,IL)-1β和IL-18的產(chǎn)生,減少炎性反應(yīng)[4]。因此,抑制ROS水平,可以從多方面抑制心肌肥大。

sirtuins是Ⅲ類組蛋白去乙?；?已在人類中發(fā)現(xiàn)了7種Sirtuins亞型,即SIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6和SIRT7。其中SIRT1研究得最多,它也被稱為核蛋白[19]。SIRT1參與ROS的產(chǎn)生與消耗,其機制是通過調(diào)節(jié)NOX2、SOD1在內(nèi)產(chǎn)生和消耗ROS有關(guān)的酶[20,21]。因此,調(diào)節(jié)SIRT1的水平可能成為治療心肌肥大的新靶點[22]。

NRG-1是一種內(nèi)皮細胞釋放的心臟活性因子,對心臟發(fā)育、結(jié)構(gòu)和功能是不可或缺的[23],但其改善心肌重構(gòu)的具體分子機制尚未完全闡明。本實驗中應(yīng)用Ang-Ⅱ誘導(dǎo)心肌細胞肥大,設(shè)置空白組、模型組、治療組測定心肌細胞表面積、線粒體膜電位水平、ROS水平及ANP、BNP、SIRT1、SOD1、NOX2蛋白表達,進而探討NRG-1抑制心肌肥大的作用機制。Ang-Ⅱ誘導(dǎo)的心肌肥大模型中,可以觀察到細胞表面積增加,線粒體膜電位下降,ANP、BNP、NOX2表達增加,SIRT1、SOD1表達下降,而NRG-1能夠有效緩解Ang-Ⅱ引起的變化,表明NRG-1對Ang-Ⅱ誘導(dǎo)的心肌肥大具有明顯的保護作用。而使用EX527處理后,NRG-1改善氧化應(yīng)激的能力下降,因此,NRG-1抑制Ang-Ⅱ所致的心肌肥大可能部分是通過SIRT1-NOX2通路所實現(xiàn)的。

綜上所述,本實驗驗證了NRG-1抗心肌細胞肥大的作用,同時了發(fā)現(xiàn)了SIRT1-NOX2通路可能是NRG-1抗心肌肥大潛在機制之一,但是不能排除NRG-1通過其他非特異性機制改善心肌重構(gòu),需要開展進一步研究。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。