章 睿 鄭螢螢 朱悅紅

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)一般是指無其他明顯病因的糖尿病相關(guān)心肌功能障礙[1]。DCM是糖尿病最常見的心血管并發(fā)癥之一[2]。自噬功能異常是導(dǎo)致DCM心功能異常和心肌重構(gòu)的重要機制之一[3]。研究表明,自噬與DCM的發(fā)生及進展密切相關(guān)[4]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs,lncRNAs)是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200nt的不具備蛋白質(zhì)編碼功能的RNA分子,它在表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等層面調(diào)控基因的表達(dá)及功能[5]。lncRNA MEG3其定位于人類染色體14q32.3,由10個外顯子組成,通過可變剪切形成多種lncRNA亞型[6]。研究表明,MEG3可能是抑制自噬水平的重要因素。MEG3可以抑制成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和自噬[7]。在肺癌細(xì)胞中,MEG3上調(diào)顯著抑制肺癌細(xì)胞的自噬水平,并與化療抵抗密切相關(guān)[8]。但是,MEG3與心肌細(xì)胞自噬的關(guān)系目前仍不明確。因此,本研究將探討 lncRNA MEG3調(diào)控自噬在DCM中發(fā)揮的作用。

材料與方法

1.實驗材料:鏈脲佐菌素(STZ)購自美國Sigma公司;RT-qPCR試劑盒購自日本TaKaRa公司;ECL試劑盒購自美國Protech公司;PVDF 膜購自美國Millipore公司;RIPA裂解液、BCA 蛋白質(zhì)定量試劑盒、Western blot法一抗、二抗購自英國Abcam公司;ROS試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)股份有限公司;CCK-8試劑盒購自上海信裕生物科技有限公司;乳酸脫氫酶試劑盒購自美國Beckman公司;谷胱甘肽-過氧化物酶試劑盒購自南京建成生物工程研究所;DMEM培養(yǎng)基、葡萄糖購自美國Gibco公司;甘露醇購自上海源葉生物科技有限公司。

2.實驗動物:6周齡鼠,18～22g的雄性C57BL/6 小鼠由杭州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供,實驗動物許可證號:SYXK(浙)2019-0011,飼養(yǎng)于溫度約25℃,濕度 55% 的環(huán)境下,自由進食、進水。本動物實驗方案經(jīng)過筆者醫(yī)院實驗動物福利倫理委員會審核,符合動物保護、動物福利和倫理原則(倫理學(xué)審批號:ZJCLA-IACUC-20120014),符合國家實驗動物福利倫理的相關(guān)規(guī)定。

圖2 lncRNA MEG3在DCM小鼠心肌細(xì)胞表達(dá)上調(diào),抑制細(xì)胞自噬,激活mTOR信號通路

圖3 lncRNA MEG3在高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中上調(diào),抑制細(xì)胞自噬

圖4 下調(diào)lncRNA MEG3恢復(fù)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬,進而緩解心肌細(xì)胞損傷

3.DCM小鼠造模與分組:選取40只C57BL/6小鼠,使用普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機分為正常組(10只)和DCM組(30只)。正常組小鼠喂食普通飼料,DCM組喂食高脂飼料,喂食4周后禁食12h,DCM組小鼠采用 100mg/kg劑量的STZ腹腔注射,正常組小鼠腹腔注射等體積檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。5天后尾靜脈取血,血糖≥16.7mmol/L則2型糖尿病小鼠造模成功。

4.細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組:分離C57BL/6小鼠乳鼠心肌細(xì)胞,分為正常組、高糖組、滲透壓對照組。正常組和高糖組細(xì)胞分別加入低糖(5.5mmol/L)和高糖(33.3mmol/L)DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48h。為排除滲透壓影響,設(shè)置滲透壓對照組,加入27.5mmol/L甘露醇的5.5mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基。此外,在心肌細(xì)胞生長至對數(shù)生長期時, 按Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑說明書,將濃度為100nmol/L的 si-NC、si-MEG3分別轉(zhuǎn)染至細(xì)胞,轉(zhuǎn)染培養(yǎng)48h后,收集心肌細(xì)胞進行高糖處理,分別為高糖+si-NC組和高糖+si-MEG3組。

5.心臟超聲檢測:用超聲儀探頭在小鼠乳頭肌水平位置用 M 型取樣線檢測,記錄并分析小鼠左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction,LVEF)、左心室短軸縮短率(fractional shortening,FS)、左心室舒張末期容積(left ventricular end-diastolic volume,LVEDV)、左心室收縮末期容積(left ventricular end-systolic volume,LVESV)、左心室舒張期前壁厚度(left ventricular anterior wall thickness at diastole,LVAWd)數(shù)據(jù)值。

6.Masson染色:取小鼠心臟組織,4%多聚甲醛溶液固定,固定后制做石蠟病理切片,進行Masson染色,顯微鏡下觀察組織纖維化程度。

7.Western blot法檢測蛋白表達(dá):RIPA 裂解液提取心肌細(xì)胞總蛋白,每孔加入40μg 蛋白樣品后進行 SDS-PAGE。采用常規(guī)濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜,PVDF膜用5% 的脫脂牛奶4℃ 封閉過夜。將PVDF膜置于稀釋的一抗p62、LC3-Ⅱ、Beclin 1、p-mTOR、mTOR溶液(1∶500)室溫孵育 2h,GAPDH蛋白為內(nèi)參。PBST 洗膜;再將PVDF膜置于稀釋的二抗溶液(1∶1000)室溫孵育1.5h,PBST 洗膜,ECL化學(xué)發(fā)光顯色劑顯色并曝光成像。

8.RT-qPCR檢測lncRNA MEG3相對表達(dá)量:TRIzol法提取心肌細(xì)胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA進行RT-qPCR檢測。以β-actin為內(nèi)參,使用2-ΔΔCt法計算lncRNA MEG3相對表達(dá)水平。反應(yīng)參數(shù): 95℃ 5min,96℃ 變性30s,55℃ 退火30s,72℃ 延伸20s,35個循環(huán)。lncRNA MEG3 上游引物:5′-AGGGAAGCAGAGGTCGCCAAG-3′,下游引物:5′-AGCACAGTGGAGCCAGGAGTC-3′。β-actin上游引物:5′-TATGCTCTCCCTCACGCCATCC-3′,下游引物:5′-GTCACGCACGATTTCCCTCTCAG-3′。

9.CCK-8檢測細(xì)胞活力:1× 104個/毫升的細(xì)胞懸液,按每孔100μl接種于96 孔板中測定細(xì)胞活力并設(shè)置5個復(fù)孔。每孔加入10μl CCK-8試劑,37℃孵育1.5h。在450nm處酶標(biāo)儀測定吸光度。

10.ELISA檢測細(xì)胞LDH、ROS及GSH-Px 活性:1×104個/毫升的細(xì)胞懸液,按每孔 2ml 接種于 6 孔板中,收集細(xì)胞,離心后取上清液,按LDH、ROS、GSH-Px試劑盒說明書進行操作。

結(jié) 果

1.DCM小鼠心功能異常:正常組和DCM組小鼠進行心臟超聲檢測。與正常組比較,DCM 組小鼠左心室功能明顯減退,心臟收縮和舒張功能顯著下降,LVEF、FS、LVEDV、LVESV 顯著降低,LVAWd 顯著升高(P均<0.05,圖1A和表1)。Masson 染色結(jié)果表明,DCM組小鼠左心室膠原沉積增多,心肌纖維化程度增加(圖1B)。

表1 小鼠超聲測量結(jié)果

2.DCM小鼠心肌細(xì)胞中l(wèi)ncRNA MEG3上調(diào),細(xì)胞自噬減弱,mTOR信號通路被激活:與正常組比較,lncRNA MEG3在DCM組小鼠心肌組織中表達(dá)水平顯著上調(diào)(圖2A)。與正常組比較, DCM組小鼠心肌細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白p62表達(dá)量顯著升高,LC3-Ⅱ,Beclin 1蛋白表達(dá)量顯著降低,DCM組小鼠心肌細(xì)胞自噬受到抑制(圖2B)。同時,p-mTOR蛋白表達(dá)水平升高,表明mTOR通路被激活(圖2C)。

3.lncRNA MEG3在高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中上調(diào),抑制細(xì)胞自噬:相較正常組,高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞活力降低,滲透壓對照組無顯著變化(圖3A)。與正常組比較,高糖組LDH、ROS活性顯著升高,滲透壓對照組無顯著變化;與正常組比較,高糖組GSH-Px活性顯著降低,滲透壓對照組無顯著變化(表2)。與正常組比較,高糖組lncRNA MEG3表達(dá)水平顯著上調(diào),滲透壓對照組lncRNA MEG3表達(dá)水平無顯著變化(圖3B)。與正常組比較,高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白p62表達(dá)量顯著升高,LC3-Ⅱ、Beclin 1蛋白表達(dá)量顯著降低,滲透壓對照組無顯著變化(圖3C),表明高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬減弱。后續(xù)實驗采用正常組作為對照。

表2 各組細(xì)胞LDH、ROS、GSH-Px 活性比較

4.下調(diào)lncRNA MEG3恢復(fù)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬,進而緩解心肌細(xì)胞損傷:敲低lncRNA MEG3表達(dá),其表達(dá)水平顯著降低(圖4A)。與正常組比較,高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞p62表達(dá)量顯著升高,LC3-Ⅱ降低,Beclin 1蛋白表達(dá)量也顯著降低;與高糖+si-NC組比較,高糖+si-MEG3組p62表達(dá)量顯著降低,LC3-Ⅱ和Beclin 1蛋白表達(dá)量顯著升高(圖4B)。與正常組比較,高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞活力顯著降低;與高糖+si-NC組比較,高糖+si-MEG3組細(xì)胞活力顯著上調(diào)(圖4C)。與正常組比較,高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞LDH,ROS活性顯著升高;與高糖+si-NC組比較,高糖+si-MEG3組LDH,ROS活性顯著降低。與正常組比較,高糖組GSH-Px活性顯著降低;與高糖+si-NC組比較,高糖+si-MEG3組GSH-Px活性顯著升高(表3)。表明下調(diào)lncRNA MEG3后,高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬得以恢復(fù),心肌細(xì)胞損傷被緩解。

表3 各組細(xì)胞LDH、ROS、GSH-Px 活性比較

5.下調(diào)lncRNA MEG3通過抑制ERK/mTOR信號通路的激活,恢復(fù)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬:ERK/mTOR信號通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬的通路之一[9]。與正常組比較,高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞p-mTOR和p-ERK表達(dá)量顯著升高;與高糖+si-NC組比較,高糖+si-MEG3組p-mTOR和p-ERK表達(dá)量顯著降低,表明下調(diào)lncRNA MEG3,抑制ERK/mTOR信號通路的激活(圖5)。

圖5 Western blot法檢測p-mTOR、mTOR、p-ERK、ERK、GAPDH表達(dá)量

討 論

近年來,lncRNA在DCM中起到重要的調(diào)控作用。在STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠動物模型中,上調(diào)lncRNA AK081284通過TGF-β信號通路促進糖尿病心臟組織纖維化[10]。特異性過表達(dá)lncRNA H19顯著抑制糖尿病小鼠心臟組織氧化應(yīng)激、炎癥及凋亡,改善心臟功能[11]。lncRNA DCFR則通過抑制心肌細(xì)胞自噬加劇了DCM的進展[12]。本研究探討了lncRNA MEG3 對DCM細(xì)胞自噬的影響。與之前的研究結(jié)果一致,DCM組小鼠心臟舒張收縮功能減弱,膠原沉積增加,心肌細(xì)胞自噬減弱[3,13]。同時lncRNA MEG3 在DCM組小鼠心肌組織和高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào),表明lncRNA MEG3可能參與糖尿病心肌細(xì)胞自噬調(diào)控。

有研究報道,高脂喂食通過激活mTOR1抑制糖尿病小鼠心臟自噬,表現(xiàn)為LC3-Ⅱ表達(dá)下調(diào)和p62表達(dá)上調(diào)。心臟組織自噬抑制,加劇了糖尿病小鼠心肌梗死后缺血性損傷[14]。高脂喂食小鼠心臟功能受損,心臟組織中 LC3-Ⅱ和p62表達(dá)增高,自噬體數(shù)量增加及降解受阻。自噬在2型糖尿病心臟損傷中扮演了重要的角色[15]。Beclin 1調(diào)節(jié)自噬過程,是自噬體形成增加的重要指標(biāo)[16, 17]。mTOR信號通路可以調(diào)控LC3-Ⅱ/Ⅰ及p62表達(dá)變化,抑制自噬[18]。本研究發(fā)現(xiàn)在高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中下調(diào)lncRNA MEG3表達(dá)后,p62表達(dá)降低,LC3-Ⅱ和Beclin 1表達(dá)升高,mTOR激活受到抑制,細(xì)胞自噬增強。mTOR是很多上游信號的關(guān)鍵靶基因,可抑制自噬過程。Cao等報道MEG3可直接靶向miR-7-5p調(diào)控下游mTOR信號激活,從而調(diào)控心臟自噬[19]。

但在已有研究中,lncRNA MEG3對自噬的調(diào)控主要為正調(diào)控,這種作用已在多種疾病和多種途徑中得到驗證。下調(diào)MEG3可導(dǎo)致高糖誘導(dǎo)的INS-1細(xì)胞自噬減少[20]。肺纖維化過程中,下調(diào)MEG3激活Hedgehog信號通路,抑制A549細(xì)胞的自噬活性[21]。

lncRNA MEG3在心血管疾病中發(fā)揮重要作用。Wu等[22]報道在缺氧的心肌細(xì)胞中,p53通過直接結(jié)合MEG3上游基因來影響其表達(dá)。此外,p53可上調(diào)MEG3表達(dá)促進心肌細(xì)胞凋亡。lncRNA MEG3在心肌成纖維細(xì)胞中明顯富集。MEG3沉默抑制轉(zhuǎn)化生長因子表達(dá),抑制MMP-2的活性,從而降低纖維化標(biāo)志物的表達(dá)[23]。lncRNA MEG3還可正向調(diào)節(jié)心肌肥厚[24]。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)lncRNA MEG3可能通過抑制ERK/mTOR信號通路的激活促進了心肌細(xì)胞自噬的發(fā)生,進而緩解了高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。本研究將為DCM的防治提供重要的理論基礎(chǔ)。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。