穆巴拉克·亞庫(kù)甫 熱甫開提·阿不都哈力克 孫 娟 艾力曼·馬合木提

缺血性心肌病(ischemic cardiomyopathy,ICM)是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(coronary heart disease,CHD)的晚期階段,近年來其遺傳因素在發(fā)病機(jī)制中備受關(guān)注。細(xì)胞間黏附分子-1 (intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)可能因介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞與白細(xì)胞、血小板間的起始黏附,在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展過程中起著重要的作用,并與CHD和ICM的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[1]。ICAM-1主要通過特異性結(jié)合表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞上的相關(guān)聯(lián)受體,促使炎性細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附作用,從而誘導(dǎo)并增強(qiáng)炎性反應(yīng),促進(jìn)心室重塑,加重心肌缺血,破壞心功能,在ICM發(fā)生及發(fā)展中扮演了重要角色。近年來,ICAM-1單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)與心血管疾病的關(guān)系主要集中在rs5498外顯子上,但I(xiàn)CAM-1基因的其他遺傳變異與ICM之間的相關(guān)性研究匱乏[2～4]。為深入探究ICAM-1基因多態(tài)性與ICM易感性及預(yù)后的關(guān)系,本研究從ICAM-1基因中初步篩選出rs12462944、rs281430、rs281434、rs3093030、rs5491、rs923366共6個(gè)SNP,結(jié)合臨床資料進(jìn)行了預(yù)實(shí)驗(yàn),為后續(xù)進(jìn)行更多基因位點(diǎn)及更大樣本的研究提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

對(duì)象與方法

1.研究對(duì)象:采用病例-對(duì)照方法,選取64例在2017年1月～2019年1月就診于新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心力衰竭科且明確診斷為ICM的患者為ICM組,均符合ICM診斷標(biāo)準(zhǔn)[5,6]。排除標(biāo)準(zhǔn):①除外CHD的特殊并發(fā)癥;②除外因其他因素導(dǎo)致的心臟擴(kuò)大與心功能不全;③除外合并嚴(yán)重感染、其他嚴(yán)重心臟、肺、肝臟、腎臟等疾病以及惡性腫瘤。另外隨機(jī)抽取同期于新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院健康體檢中心進(jìn)行體檢的人群138例作為對(duì)照組,除外CHD、嚴(yán)重感染、嚴(yán)重心臟、肺、肝臟、腎臟等疾病及惡性腫瘤。本實(shí)驗(yàn)在所有研究對(duì)象知情同意的條件下開展,且通過了筆者醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)審批(倫理學(xué)審批號(hào):K202109-22)。

2.資料的收集及相關(guān)定義標(biāo)準(zhǔn):記錄所有研究對(duì)象的一般資料包括年齡、性別、民族、體重指數(shù)(BMI);血清學(xué)指標(biāo)包括總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、N-末端前體腦利納肽(NT-proBNP);影像學(xué)指標(biāo)包括左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction,LVEF);個(gè)人史包括吸煙史;既往史包括是否合并2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)、是否合并髙血壓。吸煙史定義為連續(xù)或累積吸煙≥6個(gè)月者且平均>1支/天。高血壓及T2DM診斷標(biāo)準(zhǔn)參考相關(guān)文獻(xiàn)[7,8]。

3.ICAM-1基因目標(biāo)位點(diǎn)基因型檢測(cè):采取外周靜脈血10ml,利用全血基因組提取試劑盒(廈門凱碩生物科技有限公司)提取基因組DNA。從NCBI HapMap數(shù)據(jù)庫(kù)中查找ICAM-1基因的SNP數(shù)據(jù)信息,用haploview軟件隨機(jī)標(biāo)簽了6個(gè)SNP,分別為rs12462944、rs281430、rs281434、rs3093030、rs5491及rs923366。應(yīng)用在線Primer3 軟件設(shè)計(jì)引物,運(yùn)用多重聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)對(duì)6個(gè)目標(biāo)多態(tài)位點(diǎn)所處區(qū)段進(jìn)行擴(kuò)增。外切核酸酶及蝦堿酶純化擴(kuò)增產(chǎn)物,再運(yùn)用SNaPshot多重SNP分型試劑盒(美國(guó)Applied Biosystems公司)進(jìn)行延伸反應(yīng)。純化后的延伸產(chǎn)物使用ABI3730XL測(cè)序儀(美國(guó)Applied Biosystems公司)進(jìn)行測(cè)序,最后用GeneMapper4.1軟件對(duì)收集的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析后確定6個(gè)目標(biāo)位點(diǎn)基因型。

4.隨訪:在患者明確診斷為ICM后的3、6、12、24、36個(gè)月分別進(jìn)行電話隨訪,隨訪內(nèi)容包括終點(diǎn)事件發(fā)生及其時(shí)間,隨訪的終點(diǎn)事件為心源性死亡。如果未發(fā)生終點(diǎn)事件,隨訪至3年并終止隨訪。

結(jié) 果

1.研究對(duì)象的一般情況:ICM組和對(duì)照組TC、TG、HDL-C、NT-proBNP、LVEF、吸煙、2型糖尿病比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05);年齡、性別、BMI、LDL-C、高血壓比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05),詳見表1。

表1 ICM組和對(duì)照組的一般資料比較

2.ICAM-1基因型、等位基因分布及相對(duì)危險(xiǎn)度:ICAM-1基因6個(gè)SNP位點(diǎn)rs12462944、rs281430、rs281434、rs3093030、rs5491及rs923366基因型頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡,提示人群選擇無偏倚。rs12462944、rs281430、rs3093030、rs923366位點(diǎn)基因型和等位基因分布在ICM組與對(duì)照組中比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。ICM組rs5491位點(diǎn)AT基因型及等位基因T頻數(shù)均高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),變異型雜合子AT攜帶者較野生型AA攜帶者ICM的風(fēng)險(xiǎn)是3.219倍(95%CI:1.524～6.800)。兩組rs281434位點(diǎn)AA、AG、GG基因型和A、G等位基因分布比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05),但在顯性遺傳模型中,ICM組變異基因型(AG+GG)頻率高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。變異型AG和GG攜帶者較野生型AA攜帶者ICM的風(fēng)險(xiǎn)是2.685倍(95%CI:1.057～6.825),詳見表2。

表2 兩組人群SNP基因型分布及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估[n(%)]

3.多因素Logistic回歸分析:以ICM發(fā)生與否作為因變量,以年齡、性別、BMI、TC、TG、HDL-C、LDL-C、吸煙、T2DM、高血壓及ICAM-1 6個(gè)位點(diǎn)基因型為自變量進(jìn)行多因素Logistic回歸分析。因自變量較多,多因素Logistic回歸分析逐步向前回歸,結(jié)果顯示,2型糖尿病、rs5941位點(diǎn)AT基因型是發(fā)生ICM的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(OR=5.433、3.428,P<0.05),HDL-C高水平是ICM的保護(hù)因素(OR=0.192,P<0.05),其中AT型攜帶者ICM風(fēng)險(xiǎn)是AA型的3.428倍(95%CI:1.517～7.747),詳見表3。

表3 影響 ICM的多因素 Logistic回歸分析

4.ICM患者心源性死亡多因素COX回歸分析:將ICM組年齡、性別、BMI、TC、TG、HDL-C、LDL-C、NT-proBNP、LVEF、吸煙、T2DM、高血壓及ICAM-1 6個(gè)位點(diǎn)基因型作為協(xié)變量,以心源性死亡作為因變量,進(jìn)行COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析,結(jié)果顯示,NT-proBNP水平增高、LVEF水平下降、rs5491位點(diǎn)AT基因型是心源性死亡的危險(xiǎn)因素(HR分別為1.861、0.917、5.075,P<0.05),詳見表4。

表4 ICM組心源性死亡多因素COX回歸分析

5.rs5491位點(diǎn)AA、AT基因型預(yù)后差異:繪制Kaplan-Meier生存曲線,并采用Log-Rank檢驗(yàn)用于比較兩組終點(diǎn)事件發(fā)生率的差異。從患者確診為ICM后開始隨訪,3年內(nèi)rs5491位點(diǎn)AT基因型ICM患者較AA基因型心源性死亡風(fēng)險(xiǎn)更高(P<0.05),詳見圖1。

圖1 rs5491位點(diǎn)AA和AT基因型的ICM患者的生存曲線

討 論

ICAM-1是目前為止研究最多的與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的黏附分子,近年來關(guān)于其多態(tài)性與冠狀動(dòng)脈疾病易感性的關(guān)聯(lián)研究多集中在rs5498位點(diǎn)[2,9,10],ICAM-1基因的其他遺傳變異與ICM之間的相關(guān)性研究甚少,且因遺傳背景和種族差異,研究結(jié)果并不一致。為明確ICAM-1基因其他位點(diǎn)多態(tài)性與ICM的關(guān)系,本研究對(duì)隨機(jī)標(biāo)簽出的分別位于外顯子區(qū)、內(nèi)含子區(qū)及3′非編碼區(qū)的6個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行了研究,結(jié)果顯示rs5491基因型的變異提高了ICM的患病風(fēng)險(xiǎn)。rs5491位于第2外顯子區(qū),近年來有研究證明,外顯子錯(cuò)義突變可導(dǎo)致心腦血管疾病的發(fā)生[11,12]。Craig等[13]研究發(fā)現(xiàn),rs5491基因變異可導(dǎo)致ICAM-1N-末端區(qū)域的結(jié)構(gòu)變化,從而改變其蛋白與淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1及纖維蛋白原的結(jié)合能力,目前也有報(bào)道證實(shí)了該位點(diǎn)基因突變與其他疾病的相關(guān)性[14]。由此推測(cè)rs5491與外顯子區(qū)其他SNP有相似功能特點(diǎn),可能通過改變ICAM-1的結(jié)構(gòu)甚至結(jié)合能力,從而對(duì)促進(jìn)ICM的發(fā)生產(chǎn)生一定作用,最終增加ICM的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

ICAM-1基因多態(tài)性還可能通過觸發(fā)動(dòng)脈粥樣斑塊不穩(wěn)定性,影響冠狀動(dòng)脈疾病患者預(yù)后。有研究顯示ICAM-1基因rs5498多態(tài)性與急性冠脈綜合征復(fù)發(fā)和心血管病死率相關(guān)聯(lián)[15]。本研究也發(fā)現(xiàn)攜帶rs5491AT基因型的ICM患者較攜帶AA基因型的患者3年內(nèi)心源性死亡風(fēng)險(xiǎn)高。然而ICAM-1基因多態(tài)性與冠狀動(dòng)脈疾病預(yù)后的關(guān)聯(lián)性文獻(xiàn)仍然有限,需要更多的證據(jù)來明確其機(jī)制。

rs281434與冠狀動(dòng)脈疾病的相關(guān)性尚未得到證實(shí)。本研究結(jié)果顯示,ICAM-1rs281434的多態(tài)可能與ICM易感性有關(guān)聯(lián),但會(huì)受其他影響因素的干擾。通常情況下,內(nèi)含子并不像其他遺傳結(jié)構(gòu)那樣重要,然而近年來研究表明,內(nèi)含子在基因轉(zhuǎn)錄、基因加工和RNA穩(wěn)定性中起著至關(guān)重要的作用[2]。因此內(nèi)含子區(qū)rs281434多態(tài)性可能影響mRNA的加工和穩(wěn)定性,引起剪接位點(diǎn)的中斷從而導(dǎo)致異常剪接的發(fā)生,在ICM的發(fā)生中起到一定作用。然而本研究中位于內(nèi)含子區(qū)的其他兩個(gè)SNP的基因型分布在兩組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,可能是本實(shí)驗(yàn)納入的樣本量較小,因而無法準(zhǔn)確反映其多態(tài)性對(duì)疾病易感性的作用,也有可能該位點(diǎn)在蛋白的功能改變上不起主要作用。3′非編碼區(qū)可以在不同水平上調(diào)節(jié)基因的表達(dá)并介導(dǎo)mRNA的穩(wěn)定性、降解和亞細(xì)胞定位,該區(qū)基因表達(dá)特征可代表疾病發(fā)生的基因組機(jī)制,有助于發(fā)現(xiàn)新的診斷和治療方法[16,17]。但本研究中未發(fā)現(xiàn)位于3′非編碼區(qū)的rs3093032和rs923366的多態(tài)性與ICM發(fā)生相關(guān)。

本預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示,T2DM是發(fā)生ICM的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,HDL-C是其保護(hù)因素,NT-proBNP高、LVEF低是ICM患者發(fā)生心源性死亡的危險(xiǎn)因素,與既往研究結(jié)果一致[18～21]。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn),ICAM-1基因rs5491多態(tài)性與ICM易感性和預(yù)后相關(guān),rs5491基因型的變異提高ICM的患病風(fēng)險(xiǎn),AT型ICM患者較AA型預(yù)后較差。rs281434多態(tài)性可能與ICM易感性相關(guān)。然而本研究沒有發(fā)現(xiàn)其他ICAM-1基因位點(diǎn)與ICM相關(guān),原因可能為預(yù)實(shí)驗(yàn)納入的樣本量小,故有必要后續(xù)篩選更多的基因位點(diǎn)、擴(kuò)大樣本量以及延長(zhǎng)隨訪時(shí)間對(duì)本次研究結(jié)果給予驗(yàn)證及補(bǔ)充,并進(jìn)一步揭示ICAM-1基因多態(tài)性增加ICM發(fā)病及死亡風(fēng)險(xiǎn)的作用機(jī)制,為ICM的預(yù)防和治療提供新依據(jù)。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。