郭 卉 呂春燕 焦琳茜 謝書睿 徐旭英

下肢動脈硬化閉塞癥(arteriosclerosis obliterans,ASO)是常見的周圍血管病之一,該病是由于下肢動脈粥樣硬化斑塊形成導(dǎo)致血管內(nèi)膜增厚、管腔狹窄或閉塞使得肢體供血不足而發(fā)生病變的一種疾病。ASO影響著全球超過2.3億成年人,是一個全球性的公共衛(wèi)生問題[1]。其帶來的各種傷害嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量,尤其是對身體功能的傷害,除此之外ASO高額的醫(yī)療費(fèi)用對于患者來說更是雪上加霜[2]。介入術(shù)破環(huán)了血管原有的結(jié)構(gòu),導(dǎo)致新的理化反應(yīng),造成介入術(shù)后再狹窄的發(fā)生,其成因與內(nèi)膜增生、血管彈力回縮、血栓形成和炎性反應(yīng)息息相關(guān)[3]。其中核因子-κB(nuclear factor-kappa B, NF-κB)是啟動炎性反應(yīng)的關(guān)鍵因子,通過抑制NF-κB的活性來減少白細(xì)胞介素-6(interlenkin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子-α的產(chǎn)生,降低炎性反應(yīng)[4,5]。前期研究表明舒脈膠囊能有效抑制大鼠髂動脈球囊損傷后血管內(nèi)膜的增生,降低介入術(shù)后再狹窄發(fā)生的風(fēng)險,然而其是否通過干預(yù)炎性反應(yīng)以達(dá)到抑制血管內(nèi)膜增生的目的尚未得到驗(yàn)證[6, 7]。本研究采用大鼠髂動脈球囊損傷模型,探討舒脈膠囊干預(yù)大鼠髂動脈球囊損傷后的炎癥作用。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動物:所有動物實(shí)驗(yàn)和程序均經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院動物保護(hù)倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)(BJTCM-R-2021-11-02)。選取SPF級6周齡健康雄性SD大鼠18只,由斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司提供,體質(zhì)量為200±20g,飼養(yǎng)于SPF級動物室,溫度23～26℃,日溫差≤3℃,相對濕度40%～70%,房間空氣壓差梯度20～50Pa,12h明暗交替飼養(yǎng),常規(guī)正常飲食,適應(yīng)性飼養(yǎng)7天。動物生產(chǎn)許可證編號:SCXK(京)2019-0010。

2.藥物與試劑:舒脈膠囊(京藥制字Z20053323; 批號 2141201),主要成分:雞血藤、當(dāng)歸、黃芪、丹參、枸杞子、首烏藤、川芎、山楂、制水蛭、山藥、陳皮、澤瀉、石菖蒲、玄參等,膠囊含原藥材0.4克/粒。肝素鈉購自北京索萊寶科技有限公司,注射用青霉素鈉購自山西省芮城縣紅寶獸藥有限責(zé)任公司,硫酸慶大霉素注射液購自上海全宇生物科技(駐馬店)動物藥業(yè)有限公司,戊巴比妥鈉購自美國Sigma公司,生理氯化鈉溶液購自四川科倫藥業(yè)股份有限公司,4%多聚甲醛購自蘭杰柯科技有限公司。

3.儀器:1.5mm×15.0mm球囊購自廣東博邁醫(yī)療科技股份有限公司,指引導(dǎo)絲購自美國Boston Science公司,8-0非吸收性外科縫線和5-0非吸收性外科縫線均購自揚(yáng)州富達(dá)醫(yī)療器械有限公司。石蠟包埋機(jī)、HistoCore MULTICUT切片機(jī)、全自動染色機(jī)、正置顯微鏡和掃片儀均購自德國Leica公司。

4.大鼠髂動脈球囊損傷模型分組:適應(yīng)性喂養(yǎng)7天后,采用隨機(jī)數(shù)字表法將30只SD大鼠分為5組,分別為假手術(shù)組、模型組、舒脈膠囊低劑量組、舒脈膠囊中劑量組和舒脈膠囊高劑量,每組6只。

5.造模:假手術(shù)組大鼠沿左髂動脈走行逐層切開皮膚及組織并分離髂動脈和股動脈,其余各組均用球囊對大鼠髂動脈進(jìn)行損傷以建立下肢動脈再狹窄模型。球囊損傷模型:術(shù)前無需禁食與禁水,用1%戊巴比妥鈉(50ml/kg)進(jìn)行麻醉,尾靜脈用留置針注射肝素鈉溶液(100U/100g),可根據(jù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)程需要補(bǔ)充注射肝素鈉溶液;沿大鼠左髂動脈走行依次切開皮膚層、筋膜層和肌肉層,分離并充分暴露股動脈,用眼科剪給股動脈做V型切口,導(dǎo)絲穿過球囊做指引進(jìn)入股動脈中,將球囊送至腹主動脈后,用肝素鈉溶液作為擴(kuò)充介質(zhì),給予6個大氣壓使得球囊擴(kuò)張并且牽拉球囊至血管切口處,重復(fù)牽拉5次造成髂動脈內(nèi)膜機(jī)械性損傷;撤出球囊及導(dǎo)絲,用8-0縫線縫合血管切口,5-0縫線逐層縫合肌肉、筋膜和皮膚,慶大霉素溶液沖洗手術(shù)區(qū)域,腹腔注射青霉素40000U預(yù)防感染。

6.給藥:術(shù)后第1天,假手術(shù)組和模型組給予0.9%氯化鈉溶液灌胃,每300g大鼠體質(zhì)量給予1ml藥液,1次/天。根據(jù)《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》將成人每日服用劑量與大鼠劑量進(jìn)行換算,所得劑量為大鼠中等劑量,將其1/2中等劑量定為低劑量,2倍中等劑量定為高劑量[6, 8]。舒脈膠囊低劑量組給予0.0324g/ml舒脈膠囊0.9%氯化鈉溶液灌胃,舒脈膠囊中劑量組給予0.0648g/ml舒脈膠囊0.9%氯化鈉溶液灌胃,舒脈膠囊高劑量組給予0.1296g/ml舒脈膠囊0.9%氯化鈉溶液灌胃。

7.取材:術(shù)后14天,1%戊巴比妥鈉(50ml/kg)進(jìn)行麻醉,打開大鼠腹腔進(jìn)行腹主動脈采血,離心機(jī)4℃下1940×g,離心15min,離心結(jié)束后取血清分裝凍存于-80℃冰箱。采血結(jié)束后,用0.9%氯化鈉溶液沖洗3遍后用4%多聚甲醛沖洗血管腔,穩(wěn)定血管形態(tài)并迅速取出左髂動脈,將血管均勻分成兩份,其中一份血管放入4%多聚甲醛中進(jìn)行固定,另一份放入液氮中保存后移至-80℃冰箱保存。

8.生存狀況及行為學(xué)觀察:實(shí)驗(yàn)期間觀察各組大鼠生存狀況、行為活動、傷口愈合、感染情況及體征,根據(jù)疾病臨床表現(xiàn)以及Fontaine和Rutherford的分級和分類方法對大鼠術(shù)后狀態(tài)進(jìn)行評估。

9.血管組織形態(tài)學(xué)觀察:標(biāo)本石蠟包埋后進(jìn)行彈力纖維染色,觀察血管組織形態(tài)。根據(jù)彈力纖維染色結(jié)果計算內(nèi)膜面積、中膜面積和內(nèi)膜面積/中膜面積。

10.ELISA法檢測血清IL-6水平:取大鼠血清,嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作,檢測IL-6,計算樣本實(shí)際濃度。

11.免疫組化染色:觀察血管壁IL-6和NF-κB水平。每張切片選擇5個高倍視野(×400),分別計算血管內(nèi)膜和中膜的IL-6和NF-κB p65的單位面積陽性平均光密度值。

12.蛋白免疫印跡:觀察血管組織中NF-κB含量。提取血管組織蛋白,進(jìn)行蛋白定量后,完成電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉及孵育抗體等操作,選取β-actin 作為內(nèi)參,孵育一抗(NF-κB,1∶1 000;β -actin,1∶1 000)、二抗(HRP-Goat anti rabbit IgG,1∶10000),曝光后得到條帶,用Image J軟件進(jìn)行分析灰度值。

13.統(tǒng)計學(xué)方法:應(yīng)用SPSS 26.0與GraphPad Prism9.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析及做圖,結(jié)果采用單因素方差分析,組間比較選用Tukey法檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.各組生存狀況及行為學(xué)觀察結(jié)果:30只大鼠手術(shù)結(jié)束后,無死亡,無跛行,無紅腫,無滲出,創(chuàng)緣平整。術(shù)后第1天,30只大鼠進(jìn)食量少;行動遲緩;術(shù)側(cè)皮色:各組術(shù)側(cè)下肢與各組健側(cè)下肢比較皮色較白;術(shù)側(cè)皮溫:各組術(shù)側(cè)下肢與各組健側(cè)下肢比較皮色較涼。術(shù)后第2天,活躍程度:假手術(shù)組>模型組=舒脈膠囊低劑量組=舒脈膠囊中劑量組=舒脈膠囊高劑量組;墊料濕潤度:假手術(shù)組>模型組=舒脈膠囊低劑量組=舒脈膠囊中劑量組=舒脈膠囊高劑量組;糞便色深淺:假手術(shù)組=模型組=舒脈膠囊低劑量組=舒脈膠囊中劑量組=舒脈膠囊高劑量組。術(shù)后第7天,各組活動如常;各組瘡面完全愈合;活躍程度:假手術(shù)組>舒脈膠囊高劑量組>舒脈膠囊中劑量組>舒脈膠囊低劑量組=模型組;墊料濕潤度:假手術(shù)組>舒脈膠囊高劑量組>舒脈膠囊中劑量組>舒脈膠囊低劑量組=模型組;糞便色深淺:舒脈膠囊高劑量組>舒脈膠囊中劑量組>舒脈膠囊低劑量組>模型組>假手術(shù)組;術(shù)側(cè)皮色白:模型組>舒脈膠囊低劑量組>舒脈膠囊中劑量組>舒脈膠囊高劑量組,假手術(shù)組皮色正常;術(shù)側(cè)皮溫低:除假手術(shù)組外,其余各組術(shù)側(cè)下肢與健側(cè)下肢相比皮溫較涼,模型組>舒脈膠囊低劑量組>舒脈膠囊中劑量組>舒脈膠囊高劑量組。術(shù)后14天,無跛行、壞疽及紅腫出現(xiàn);活躍程度:假手術(shù)組>舒脈膠囊高劑量組>舒脈膠囊中劑量組>舒脈膠囊低劑量組>模型組;墊料濕潤度:假手術(shù)組>舒脈膠囊高劑量組>舒脈膠囊中劑量組>舒脈膠囊低劑量組>模型組;糞便色深淺:舒脈膠囊高劑量組>舒脈膠囊中劑量組>舒脈膠囊低劑量組>模型組=假手術(shù)組;術(shù)側(cè)皮色白:模型組>舒脈膠囊低劑量組>舒脈膠囊中劑量組=舒脈膠囊高劑量組,假手術(shù)組皮色正常;術(shù)側(cè)皮溫低:假手術(shù)組雙下肢皮溫正常,模型組>舒脈膠囊低劑量組>舒脈膠囊中劑量組=舒脈膠囊高劑量組。術(shù)后14天內(nèi),30只大鼠無明顯情緒變化,性情溫順。

2．血管形態(tài)學(xué)觀察:彈力纖維染色結(jié)果可見假手術(shù)組內(nèi)膜光滑,無增厚現(xiàn)象;與假手術(shù)組比較,模型組血管內(nèi)膜明顯增厚,管腔狹窄,舒脈膠囊低劑量組、舒脈膠囊中劑量組和舒脈膠囊高劑量組的血管內(nèi)膜都有不同程度的增厚,詳見圖1。

圖1 各組大鼠左髂動脈橫斷面切片圖(彈力纖維染色)

術(shù)后第14天,與假手術(shù)組比較,模型組內(nèi)膜面積明顯增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.0001),舒脈膠囊低劑量組內(nèi)膜面積明顯增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),舒脈膠囊中、高劑量組內(nèi)膜面積明顯增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);模型組內(nèi)膜面積/中膜面積明顯增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.0001),舒脈膠囊低劑量組內(nèi)膜面積/中膜面積明顯增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。術(shù)后第14天,與模型組比較,舒脈膠囊低、中和高劑量組內(nèi)膜面積增加減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05);舒脈膠囊低劑量組內(nèi)膜面積/中膜面積明顯減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);舒脈膠囊中、高劑量組內(nèi)膜面積/中膜面積減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.001),詳見表1。

表1 各組彈力纖維染色內(nèi)膜面積、中膜面積和內(nèi)膜面積/中膜面積的比較

3.各組大鼠血清中IL-6水平比較:術(shù)后14天,與假手術(shù)組(20.22±4.75pg/ml)比較,模型組IL-6含量(692.56±130.28pg/ml)顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.0001),舒脈膠囊低劑量組IL-6含量(217.60±4.70pg/ml)升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,舒脈膠囊低劑量組、舒脈膠囊中劑量組(48.97±17.13pg/ml)和舒脈膠囊高劑量組(18.73±7.95pg/ml)IL-6含量降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.0001);與舒脈膠囊低劑量組比較,舒脈膠囊中、高劑量組IL-6含量降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

4.大鼠左髂動脈血管組織的免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果:術(shù)后14天,與假手術(shù)組比較,模型組IL-6含量顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.0001),舒脈膠囊低劑量組IL-6含量升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.01),舒脈膠囊中劑量組IL-6含量升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05);與模型組比較,舒脈膠囊低劑、中和高劑量組IL-6含量降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.0001);與舒脈膠囊低劑量組比較,舒脈膠囊高劑量組IL-6含量降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05)。術(shù)后14天,與假手術(shù)組比較,模型組NF-κB含量顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.0001),舒脈膠囊低劑量組IL-6含量升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05);與模型組比較,舒脈膠囊低、中和高劑量組IL-6含量降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.0001),詳見圖2。

圖2 各組大鼠左髂動脈血管組織中的IL-6和NF-κB的免疫組織化學(xué)分析

5.大鼠左髂動脈血管組織中NF-κB蛋白表達(dá)比較:術(shù)后14天,與假手術(shù)組比較,模型組NF-κB蛋白含量顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.001),舒脈膠囊低劑量組NF-κB蛋白含量升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05);與模型組比較,舒脈膠囊中劑量組和舒脈膠囊高劑量組NF-κB蛋白含量降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05),舒脈膠囊高劑量組NF-κB蛋白含量降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.01),詳見圖3。

圖3 各組大鼠左髂動脈血管組織中NF-κB比較

討 論

血管腔內(nèi)手術(shù)治療能啟動炎性反應(yīng),炎性反應(yīng)是介入術(shù)后再狹窄形成的重要原因之一。球囊擴(kuò)張或支架置入導(dǎo)致斑塊破裂、內(nèi)皮剝脫、中層撕裂,激活了循環(huán)中血小板和白細(xì)胞,從而激活了炎性反應(yīng)。NF-κB是參與先天免疫和炎癥的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子家族,也參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[9, 10]。細(xì)胞因子是炎性細(xì)胞釋放的主要信號分子,參與多種功能。促炎性細(xì)胞因子IL-6參與炎性分子的合成,與IL-6受體結(jié)合,導(dǎo)致NF-κB和JAKs-STAT途徑的激活[11]。NF-κB 的活化導(dǎo)致 NF-κB抑制劑的磷酸化和降解,隨后 NF-κB 的核易位和許多促炎趨化因子和細(xì)胞因子(如 IL-1、IL-6、IL-8和前列腺素E)的上調(diào),進(jìn)一步促進(jìn)炎性反應(yīng)[12]。NF-κB通路可加速細(xì)胞增殖,抑制細(xì)胞凋亡,促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲,誘導(dǎo)血管內(nèi)膜增生,加速管腔再次狹窄[13,14]。

研究發(fā)現(xiàn),舒脈膠囊能有效降低了血液中甘油三酯含量,增加下肢血液灌注量,建立側(cè)支循環(huán),明顯改善肢體血流情況,抑制機(jī)體炎性反應(yīng)的發(fā)生,降低再狹窄的風(fēng)險,能有效緩解患肢寒涼、酸麻脹痛和間接性跛行等臨床癥狀[15～17]。舒脈膠囊的誕生離不開名老中醫(yī)房芝萱和王玉章在臨床上的辛勤耕耘,它是中醫(yī)智慧的結(jié)晶。舒脈膠囊由生黃芪、丹參、當(dāng)歸、雞血藤、首烏藤、川芎、水蛭、桂枝、陳皮、山藥和元參等組成,組方以黃芪為君,取其補(bǔ)氣生血之效;當(dāng)歸配元參為臣藥助力補(bǔ)益氣血;雞血藤、水蛭和首烏藤三藥相配為佐藥,疏通血脈。其組方之精妙是“補(bǔ)、生、通和活”四效皆有之,諸藥合用發(fā)揮健脾益腎、活血通絡(luò)之效,臨床治療下肢動脈硬化閉塞癥、下肢動脈介入術(shù)后再狹窄和下肢靜脈曲張都有著不錯的療效。

本研究發(fā)現(xiàn),舒脈膠囊能有效減輕患者炎性反應(yīng),減低介入術(shù)后再狹窄發(fā)生的風(fēng)險[17]。本研究結(jié)果顯示,舒脈膠囊能有效改善球囊損傷大鼠的肢體血運(yùn)狀況,模型組的NF-κB p65表達(dá)與其余各組比較明顯增加,NF-κB p65活化后表達(dá)明顯增加。IL-6是NF-κB p65下游炎性細(xì)胞因子,在模型組的表達(dá)中也明顯增加,二者存在一致性。NF-κB p65和IL-6在舒脈膠囊低、中和高劑量組的表達(dá)明顯減少,各組間存在差異性。本研究結(jié)果顯示,舒脈膠囊抑制介入術(shù)后再狹窄炎性反應(yīng),其機(jī)制可能與干預(yù)NF-κB p65通路的活化有關(guān),但相關(guān)靶點(diǎn)和具體機(jī)制需要更深入的研究。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。