劉翠翠 吳亞星 張淑婷 李向鑫 張 靜

牙周組織長期處于慢性、持續(xù)性炎性狀態(tài)將造成牙槽骨的病理性吸收,最終導(dǎo)致牙齒松動甚至脫落,應(yīng)用干細胞修復(fù)缺損牙槽骨打破了以往治療的瓶頸[1～3]。然而,在炎性環(huán)境下如何利用干細胞的定向分化特性提高其骨向分化效率,最終獲得牙槽骨的完全性再生,穩(wěn)固牙齒,恢復(fù)天然牙齒的生理功能是當(dāng)前研究的重點。

間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的分化受其周圍環(huán)境的影響,涉及很多細胞因子和信號分子,彼此相互作用共同調(diào)控干細胞的定向分化。近年研究證實,MSCs除直接參與組織修復(fù)外,更重要的機制在于分泌可溶性因子,這些因子使MSCs與免疫細胞相互作用,從而發(fā)揮抗炎和免疫抑制作用[1,4]。筆者團隊前期研究顯示,炎性環(huán)境下骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)可分泌IL-6、IL-8、轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)等細胞因子,其中TGF-β1的表達最為顯著[5]。然而在炎性微環(huán)境下,TGF-β1在BMSCs骨向分化中的作用目前尚不清楚。因此,本研究應(yīng)用腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)刺激模擬炎性微環(huán)境,明確TGF-β1在BMSCs成骨分化中的作用,初步探討其作用機制。

材料與方法

1.材料與試劑:TNF-α、TGF-β1、SB431542購自美國PeproTech公司;p-Smad3抗體購自美國Bioss公司;RNA提取試劑盒、cDNA 鏈合成試劑盒、熒光定量檢測試劑盒、骨橋蛋白(osteopontin,OPN)、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runt-related transcription factor 2, RUNX2)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、Smad3抗體購自武漢塞維爾生物科技有限公司。

2.BMSCs分離培養(yǎng)及鑒定:選取4周齡SD雄性大鼠(購自徐州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心),依據(jù)以往描述方法采用全骨髓培養(yǎng)法分離純化培養(yǎng)BMSCs。骨向、脂向分化能力鑒定:分別在礦化誘導(dǎo)條件下及成脂誘導(dǎo)液中培養(yǎng),14天后甲醛固定油紅O染色、21天茜素紅染色,鏡下觀察礦化結(jié)節(jié)及脂滴的形成情況。

3.細胞增殖能力測試:將BMSCs以1 × 106個/孔的密度接種于 96 孔板內(nèi),24h后PBS洗3遍,更換包含100ng/ml TNF-α的礦化誘導(dǎo)液,同時加入不同濃度 (2.5ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml) TGF-β1連續(xù)培養(yǎng),每組6孔。待細胞生長接近融合后,加入50μl的1×MTT液,恒溫孵育箱培養(yǎng)4h后,每孔加入150μl DMSO,振蕩10min,于490nm波長處檢測每個孔的吸光度(A)值。

4.分組方法:樣本隨機分為3組,對照組為BMSCs+含100ng/ml TNF-α的礦化誘導(dǎo)液(osteogenic medium,OM),實驗組為BMSCs+100ng/ml TNF-α的OM+TGF-β1,抑制組為BMSCs+100ng/ml TNF-α的OM+SB431542(TGF-β1拮抗劑)。

5.ALP和茜素紅染色:每組細胞連續(xù)培養(yǎng)至第7、10天時分別進行染色。ALP染色:4%多聚甲醛固定20min,每孔加入BCIP/NBT工作液1ml,避光孵育3h,洗滌后于鏡下拍照,使用Image-Pro Plus 6.0軟件計算染色面積百分比;茜素紅染色:4%多聚甲醛室溫固定30min,PBS清洗后,加入0.1%茜素紅染液,室溫孵育30min,洗滌后,觀察茜素紅染色。

6.成骨相關(guān)基因及TGF-β1通路關(guān)鍵因子的檢測:于24h、7天分別提取各組細胞總RNA,RT-qPCR檢測OPN、RUNX2、ALP、Smad2和Smad3mRNA表達變化。GAPDH作為內(nèi)參基因,引物序列如表1。

表1 引物序列

7.成骨相關(guān)蛋白及Smad3、p-Smad3蛋白的表達:用RAPI裂解液提取各組細胞總蛋白,進行蛋白定量、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉,室溫孵育一抗1h、二抗1h,化學(xué)成像發(fā)光儀進行成像。Image J軟件進行灰度分析。

結(jié) 果

1.BMSCs培養(yǎng)與鑒定:鏡下見細胞貼壁伸展后呈梭形。成脂誘導(dǎo)14天后油紅O染色,鏡下可見紅色脂滴形成;成骨誘導(dǎo)21天茜素紅染色可見較多的礦化結(jié)節(jié),證實BMSCs具有多向分化能力(圖1)。

圖1 BMSCs 的形態(tài)及多向分化能力鑒定(×40)

2.炎性環(huán)境下TGF-β1對BMSCs增殖能力的影響:結(jié)果顯示24h時,TGF-β1在低濃度時(2.5～10.0ng/ml),BMSCs增殖能力隨濃度增高逐漸增高,10.0ng/ml時BMSCs增殖能力最高,其后隨TGF-β1濃度增高(10～50ng/ml),BMSCs增殖呈現(xiàn)降低趨勢,在最大濃度(50ng/ml)增殖活性最低;在48h和72h時,BMSCs增殖趨勢與24h一致,即TGF-β1在最大濃度50ng/ml時,BMSCs增殖活性最低(圖2,P<0.05)。因此后續(xù)實驗選取50ng/ml 的TGF-β1來研究BMSCs骨向分化能力的影響。

圖2 炎性環(huán)境下不同時間段、不同濃度TGF-β1作用下對BMSCs增殖能力的影響

3.ALP染色:在7天和10天時,與對照組及抑制組比較,實驗組內(nèi)ALP染色最深、面積最大(圖3),實驗組與對照組比較,抑制組與對照組比較染色面積均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01,圖4)。

圖3 各組BMSCs ALP圖染色(×40)

圖4 各組BMSCs ALP染色面積百分比

4.茜素紅染色結(jié)果:7天和10天時,與對照組比較,實驗組內(nèi)礦化結(jié)節(jié)形成較多,而抑制組內(nèi)礦化結(jié)節(jié)明顯減少(圖5)。

圖5 各組BMSCs茜素紅染色圖(×40)

5.基因檢測:成骨誘導(dǎo)7天時提取細胞內(nèi)總RNA,結(jié)果顯示,實驗組內(nèi)OPN、RUNX2和ALP基因表達水平均增高,與對照組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),而抑制組內(nèi)基因表達水平均降低,其中RUNX2與OPN的表達與對照組較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,圖6)。Smad2的表達在實驗組內(nèi)較其他兩組高,但3組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);Smad3的表達在實驗組最高、抑制組最低,兩組與對照組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01,圖7)。

圖6 骨向分化基因OPN、RUNX2、ALP的表達

圖7 TGF-β信號通路中Smad2、Smad3的表達

6.蛋白表達測試: OPN、RUNX2、ALP蛋白表達水平(圖8)在實驗組內(nèi)均明顯增加,抑制組內(nèi)表達明顯降低;兩組與對照組比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(圖9,P<0.05); Smad3的表達在3組中差異不明顯,而p-Smad3在實驗組中表達明顯增高、抑制組中明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01,圖10、圖11)。

圖8 OPN、RUNX2、ALP蛋白表達水平

圖9 OPN、RUNX2、ALP蛋白相對表達水平

圖10 Smad3及p-Smad3蛋白表達水平

圖11 p-Smad3蛋白相對表達水平

討 論

微環(huán)境是決定細胞行為的重要因素,微環(huán)境中的MSCs、生長因子和細胞外基質(zhì)之間的相互作用共同影響周圍骨的動態(tài)平衡[6,7]。研究證實,細胞因子TGF-β1不僅在骨組織的發(fā)育和免疫穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用,而且其濃度的高低可影響細胞的增殖活性[8～10]。筆者團隊前期研究表明,炎性環(huán)境下TGF-β1參與了BMSCs成骨分化過程[5]。為進一步明確TGF-β1在BMSCs骨向分化中的作用,本研究首先檢測了不同時間段、不同濃度TGF-β1作用下對BMSCs增殖能力的影響,結(jié)果顯示,炎性微環(huán)境下,低濃度的TGF-β1促進BMSCs增殖,高濃度(50ng/ml)抑制BMSCs增殖。這一結(jié)果與姜力銘等[11]研究一致:低濃度的TGF-β1(10ng/ml)作用下促進干細胞的增殖。Zhang 等[12]研究也證實了低濃度的TGF-β1可以誘導(dǎo)BMSCs增殖并促進Mdm2、Akt1、Wnt3和β-連環(huán)蛋白等的表達。Xu等[13]研究也顯示,隨時間的延長,低濃度的TGF-β1(1ng/ml)促進BMSCs骨向分化、上調(diào)ALP和Osterix的表達,而高濃度TGF-β1(50ng/ml)顯著抑制BMSCs成骨分化,該結(jié)果與本研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果顯示,不同時間段BMSCs的增殖能力均在TGF-β1最大濃度(50ng/ml)時最低。對多種細胞類型的研究表明增殖和分化是負(fù)相關(guān)的過程,因此筆者后續(xù)實驗選取50ng/ml 的TGF-β1來研究其對BMSCs骨向分化能力的影響。

ALP屬于分化早期指標(biāo),其表達與細胞分化狀態(tài)密切相關(guān),在組織鈣化中起著重要作用[14]。礦化結(jié)節(jié)形成是成骨分化晚期的標(biāo)志之一。OPN是一種由成骨細胞分泌產(chǎn)生的調(diào)節(jié)蛋白,可參與骨組織的改建[15,16]。而RUNX2的表達是成骨分化早期所必須的,它可調(diào)節(jié)骨向分化基因如ALP、Col-1和OCN的表達[17]。本研究結(jié)果顯示,炎性環(huán)境下,加入TGF-β1的實驗組與其他兩組比較,ALP染色較深、面積最大;礦化結(jié)節(jié)形成能力也高于其他兩組,而加入TGF-β1拮抗劑SB431542的抑制組內(nèi)礦化結(jié)節(jié)形成明顯較少。本研究結(jié)果顯示,炎性微環(huán)境中,TGF-β1作用下BMSCs內(nèi)成骨分化基因OPN、RUNX2和ALP表達均增高,而加入TGF-β1拮抗劑的抑制組內(nèi)成骨分化基因表達均明顯降低,兩組結(jié)果與對照組比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。這些結(jié)果表明,炎性微環(huán)境下TGF-β1能促進BMSC的成骨分化。然而有研究報道,TGF-β1在骨形成早期能促進成骨,而晚期則產(chǎn)生抑制的雙重作用[13]。因此,TGF-β1在MSCs骨向分化中的作用結(jié)論并不一致,依據(jù)微環(huán)境、分化時期等因素有所不同。

牙周骨組織改建通過多種細胞因子共同協(xié)調(diào)作用、經(jīng)由不同的信號通路完成,其中最重要的是TGF-β信號通路[18]。TGF-β1通過Ⅰ型和Ⅱ型受體復(fù)合物在表面轉(zhuǎn)導(dǎo),隨后SMAD蛋白被磷酸化,磷酸化的Smad2/Smad3與Smad4結(jié)合后轉(zhuǎn)移細胞核中,最終激活或抑制下游靶基因的表達[19]。而SB431542是TβRI受體拮抗劑,通過抑制Smad3的體外磷酸化,阻斷TGF-β信號通路,最終影響骨的代謝[20,21]。本研究結(jié)果顯示,TGF-β1作用下,實驗組內(nèi)骨向分化蛋白OPN、RUNX2、ALP表達水平增高,而抑制組內(nèi)蛋白表達均降低,與對照組比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。進一步對TGF-β信號通路中關(guān)鍵因子表達進行檢測,結(jié)果顯示,實驗組內(nèi)Smad3基因表達最高,抑制組表達最低,與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);對蛋白表達檢測結(jié)果顯示,實驗組內(nèi)p-Smad3蛋白表達顯著增高,而抑制組內(nèi)p-Smad3蛋白表達明顯降低,與對照組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。因此,本研究證實炎性微環(huán)境中TGF-β1激活TGF-β/Smad信號通路,經(jīng)由p-Smad3最終促進了BMSCs內(nèi)成骨分化基因及蛋白的表達。

因此,本研究證實炎性微環(huán)境下,TGF-β1通過Smad3調(diào)控BMSCs的成骨分化。然而炎性環(huán)境下TGF-β1激活Smad3信號通路后如何與局部免疫細胞相互作用,調(diào)節(jié)損傷微環(huán)境、從而促進BMSCs成骨分化尚需開展深入研究。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。