徐天華 劉鵬昊 崔德榮

膿毒癥是由宿主對(duì)感染的反應(yīng)失調(diào)引起的危及生命的器官功能障礙,是全球危重癥患者死亡的主要原因之一,院內(nèi)病死率可達(dá)32.8%,當(dāng)存在休克時(shí)甚至接近40%～60%,每年可能有數(shù)十萬(wàn)人死亡[1,2]。膿毒癥誘發(fā)的心臟功能障礙與患者的不良結(jié)局和更高的病死率相關(guān),是膿毒癥的主要并發(fā)癥之一[3,4]。目前關(guān)于膿毒癥心肌損傷的具體發(fā)病機(jī)制仍然存在爭(zhēng)議,其中微循環(huán)障礙被認(rèn)為是膿毒癥心肌損傷的重要環(huán)節(jié),微血管內(nèi)皮損傷可引起心肌灌注減少和組織供氧不足,導(dǎo)致心力衰竭[5,6]。在缺氧、炎癥等條件刺激下,內(nèi)皮細(xì)胞獲得間充質(zhì)細(xì)胞的某些特征并逐漸失去內(nèi)皮性質(zhì),這一過(guò)程被稱為內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(endothelial-to-mesenchymal transition, EndMT),其導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)成分(如膠原蛋白和纖連蛋白)積累,引起內(nèi)膜增生和血管狹窄,進(jìn)而參與了許多疾病的纖維化過(guò)程[7,8]。自噬作為細(xì)胞應(yīng)對(duì)外界刺激的一種重要生理機(jī)制,能夠清除受損的細(xì)胞組分進(jìn)而維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。既往研究表明,自噬可通過(guò)影響EndMT保護(hù)缺氧條件下的人心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞[9]。然而,有關(guān)EndMT在膿毒癥心肌損傷中的作用機(jī)制報(bào)道較少。

SIRT3(sirtuin 3)主要位于線粒體中,通過(guò)對(duì)多種蛋白質(zhì)的去乙酰化修飾維持線粒體正常的生物學(xué)功能,其活性與自噬、氧化應(yīng)激等多種生理通路有關(guān)[10,11]。研究表明,SIRT3可通過(guò)激活Foxo3a、AMPK和SOD2調(diào)節(jié)自噬過(guò)程,進(jìn)而減輕心肌缺血再灌注損傷[12]。然而SIRT3在膿毒癥心肌損傷中的具體調(diào)控機(jī)制尚不明確。因此本研究擬采用野生型(wild type, WT)小鼠與SIRT3基因敲除(SIRT3-/-)小鼠制備膿毒癥心肌損傷模型,觀察SIRT3缺陷對(duì)膿毒癥心肌損傷的影響,探究其作用機(jī)制,為臨床治療膿毒癥心肌病提供新的思路。

材料與方法

1.材料與試劑:兔抗小鼠SIRT3抗體,兔抗小鼠血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子(platelet-endothelial cell adhesion molecule, CD31)抗體,兔抗小鼠微管相關(guān)蛋白1A/1B-輕鏈3(microtubule-associated protein 1A/1B light chain 3,LC3)單克隆抗體,小鼠抗小鼠泛素結(jié)合蛋白p62(sequestosome 1,SQSTM1/p62)抗體,小鼠抗小鼠α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)抗體,Alexa Fluor?546標(biāo)記的山羊抗兔IgG H&L抗體和Alexa Fluor?488標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG H&L抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司,脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司。人心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基購(gòu)自上海中喬新舟公司,SIRT3過(guò)表達(dá)慢病毒及陰性對(duì)照病毒購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因公司,增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光顯影劑(enhanced chemiluminescence, ECL)購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司,RIPA組織蛋白裂解液購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司,蛋白定量試劑盒(BCA protein assay kit)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)股份有限公司。

2.動(dòng)物模型制備及分組:本研究符合《美國(guó)NIH實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物使用指南》的規(guī)定, C57BL/6野生型小鼠購(gòu)自上海雷根生物科技有限公司[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào): SCXK(蘇)2020-0009],SIRT3基因敲除小鼠(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)予)飼養(yǎng)于上海市第六人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào): SYXK(滬)2021-0028]。參照既往研究方法,隨機(jī)選取8～12周雄性小鼠腹腔注射LPS(10mg/kg)或相同體積的0.9%氯化鈉溶液(normal saline, NS),24h之后收集心臟組織用于檢測(cè)[13,14]。動(dòng)物分組設(shè)立為WT-NS組、WT-LPS組、SIRT3-/--LPS組、SIRT3-/--NS組,每組8只小鼠。

3.細(xì)胞處理及分組:人心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)于含5%胎牛血清及1%內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基中,放置在正常細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞以90000/孔的密度接種在6孔板中,培養(yǎng)16～24h后加入SIRT3過(guò)表達(dá)慢病毒及陰性對(duì)照病毒,感染12h之后換新鮮培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)至72h后于熒光顯微鏡下觀察病毒轉(zhuǎn)染效率。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的人心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞,經(jīng)LPS(10μg/ml)刺激24h之后收集細(xì)胞蛋白進(jìn)行檢測(cè)。細(xì)胞分組設(shè)立為對(duì)照組、LPS組、LPS+SIRT3過(guò)表達(dá)組、陰性對(duì)照病毒組。

4.心臟超聲:小鼠LPS腹腔注射24h后,經(jīng)異氟烷吸入麻醉誘導(dǎo)并固定于恒溫板上。超聲探頭放置于胸骨旁左心室切面, 探頭頻率為30MHz,探測(cè)深度為13mm,待小鼠心率與呼吸穩(wěn)定后,記錄并分析M模式下小鼠收縮末期及舒張末期左心室后壁厚度、左心室舒張末期容積。

5.天狼星紅染色:4%多聚甲醛固定心臟組織,常規(guī)石蠟包埋及切片。石蠟切片脫蠟至水,放入天狼星紅染液中染色8min,用無(wú)水乙醇脫水后放入干凈的二甲苯中透明5min,中性樹膠封片。染色后在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察,正常心肌組織呈黃色,而膠原組織呈紅色。使用膠原組織面積占該視野中總面積的百分比進(jìn)行統(tǒng)計(jì),分析心臟纖維化水平和膠原蛋白的空間分布情況。

6.Western blot法檢測(cè):動(dòng)物模型制備成功后,取部分心肌組織于冰上裂解,采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。樣品經(jīng)常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜之后,使用脫脂牛奶室溫封閉1h。將PVDF膜放入按照1∶1000稀釋的 CD31、α-SMA、LC3、p62、SIRT3和1∶5000稀釋的α-tubulin和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體中,置于搖床上4℃孵育過(guò)夜,清洗之后加入稀釋的二抗,室溫下孵育1h。ECL顯影,凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。GAPDH和α-tubulin作為內(nèi)參蛋白,目標(biāo)蛋白與內(nèi)參的比值作為蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

7.免疫熒光:石蠟切片脫蠟至水,置于盛滿EDTA抗原修復(fù)緩沖液(pH值為8.0)的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)。用含10%胎牛血清及0.3% Triton X-100的封閉液室溫封閉1h,隨后加入一抗稀釋液,兔抗小鼠CD31抗體(1∶200),小鼠抗小鼠α-SMA抗體(1∶400),放于濕盒中4℃孵育過(guò)夜。加入Alexa Fluor?546標(biāo)記的山羊抗兔IgG H&L抗體(1∶500)和Alexa Fluor?488標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG H&L抗體(1∶500),室溫避光孵育1h, 加入含核酸染料4′, 6-二脒基吲哚(4′, 6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)的封片劑進(jìn)行封片,共聚焦顯微鏡下采集圖像并分析。

結(jié) 果

1.SIRT3缺陷對(duì)LPS刺激下小鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能的影響:如圖1所示,心臟超聲觀察結(jié)果表明,相對(duì)于WT-NS組和WT-LPS組,SIRT3-/--LPS組的左室后壁厚度明顯增加,且左心室舒張末期容積顯著降低(P<0.001)。而WT-LPS組與WT-NS組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 SIRT3缺陷對(duì)LPS刺激下小鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能的影響(n=5)

2.SIRT3缺陷對(duì)LPS刺激下小鼠心臟纖維化的影響:天狼星紅染色結(jié)果顯示(圖2),與WT-NS組比較,WT-LPS組的膠原蛋白含量明顯增多,且主要沉積于血管周圍(P<0.01)。而SIRT3-/--LPS組膠原蛋白沉積程度進(jìn)一步加深(P<0.001)。

圖2 SIRT3缺陷對(duì)LPS刺激下小鼠心臟纖維化的影響(n=4)

3.SIRT3缺陷對(duì)LPS刺激下小鼠心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響:使用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)心臟CD31、α-SMA蛋白表達(dá)情況(圖3),結(jié)果顯示,與WT-NS組比較,WT-LPS組血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白CD31熒光強(qiáng)度降低(P<0.01),間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白α-SMA熒光強(qiáng)度升高(P<0.05),表明EndMT的發(fā)生;而SIRT3-/--LPS組較WT-LPS組CD31熒光強(qiáng)度更低(P<0.05),α-SMA熒光強(qiáng)度更高(P<0.001),說(shuō)明SIRT3-/--LPS組的內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化程度更重。

圖3 SIRT3缺陷對(duì)LPS刺激下小鼠心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響(n=4)

4.SIRT3缺陷對(duì)LPS刺激下小鼠心臟組織自噬水平的影響:使用Western blot法檢測(cè)心臟LC3、p62、SIRT3的蛋白表達(dá)情況(圖4),結(jié)果顯示,與WT-NS組比較,WT-LPS組自噬水平明顯增加,LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平升高(P<0.001),p62蛋白表達(dá)水平降低(P<0.01),且WT-LPS組SIRT3蛋白表達(dá)明顯下降(P<0.05)。而SIRT3-/--LPS組較WT-LPS組自噬水平明顯下降:LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05),p62蛋白表達(dá)升高(P<0.001)。

圖4 SIRT3缺陷對(duì)LPS刺激下小鼠心臟組織自噬水平的影響(n=4)

5.SIRT3過(guò)表達(dá)對(duì)LPS誘導(dǎo)的人心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化及自噬水平的影響:使用Western blot法檢測(cè)人心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞LC3、p62、SIRT3、CD31、α-SMA的蛋白表達(dá)情況(圖5),結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,LPS組自噬應(yīng)激性增強(qiáng),LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平升高(P<0.001),SIRT3蛋白表達(dá)明顯下降(P<0.001),并伴隨EndMT的發(fā)生,CD31蛋白表達(dá)量下降(P<0.01),α-SMA蛋白表達(dá)量增加(P<0.05)。而SIRT3過(guò)表達(dá)導(dǎo)致人心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬水平進(jìn)一步升高:LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05),p62蛋白表達(dá)降低(P<0.01),且抑制了LPS誘導(dǎo)的EndMT水平,CD31蛋白表達(dá)量升高(P<0.001),α-SMA蛋白表達(dá)量下降(P<0.001)。

圖5 SIRT3過(guò)表達(dá)對(duì)LPS誘導(dǎo)的人心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化及自噬水平的影響(n=4)

討 論

心臟功能障礙是膿毒癥相關(guān)心血管衰竭的關(guān)鍵特征,與臨床預(yù)后密切相關(guān),然而膿毒癥誘發(fā)心肌損傷的治療手段有限,其病理生理機(jī)制仍不明確[15]。研究表明,膿毒癥可導(dǎo)致心臟纖維化并影響患者的長(zhǎng)期生存[3,16]。以膠原纖維過(guò)度沉積為特征的心臟纖維化會(huì)改變心肌結(jié)構(gòu),損害收縮和舒張功能并逐漸進(jìn)展為心力衰竭,心臟纖維化的嚴(yán)重程度與心臟病患者較高的長(zhǎng)期病死率有關(guān)[17]。本研究發(fā)現(xiàn),LPS可誘導(dǎo)野生型小鼠心臟SIRT3蛋白表達(dá)量下降,且心臟超聲和天狼星紅染色的結(jié)果表明,與WT-NS組比較,LPS刺激可導(dǎo)致心臟膠原蛋白含量增加,且SIRT3-/--LPS組增加更顯著。相較于WT-NS組,SIRT3-/--LPS組左心室舒張末期容積降低、左心室室壁厚度增加,但WT-LPS組的相關(guān)心超指標(biāo)差異不顯著,這可能與SIRT3在LPS誘導(dǎo)的心肌損傷中的保護(hù)作用有關(guān),而SIRT3的缺陷加重了LPS誘導(dǎo)的小鼠心臟結(jié)構(gòu)及功能損傷,說(shuō)明SIRT3的表達(dá)量與LPS誘導(dǎo)的心臟功能障礙及纖維化水平有關(guān)。

內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化是內(nèi)皮細(xì)胞的表型向間充質(zhì)細(xì)胞變化的過(guò)程,包括緊密連接的喪失,運(yùn)動(dòng)性增強(qiáng)和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白分泌增加,以內(nèi)皮基因/蛋白質(zhì)表達(dá)減少和(或)間充質(zhì)基因/蛋白質(zhì)的表達(dá)增加為特征[18]。心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化可引起心臟纖維化并通過(guò)分泌TGF-β1誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡[19]。本研究結(jié)果顯示,LPS可誘導(dǎo)野生型小鼠心臟組織中血管旁膠原蛋白沉積增多,血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白CD31表達(dá)水平下降而間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白α-SMA表達(dá)水平升高,且SIRT3-/--LPS組這一變化更加顯著。人心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)LPS刺激后亦會(huì)發(fā)生EndMT并伴隨SIRT3蛋白表達(dá)下降,而SIRT3過(guò)表達(dá)減輕了LPS誘導(dǎo)的EndMT水平。提示LPS誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠中SIRT3缺陷可促進(jìn)心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生EndMT,并且EndMT的程度與心臟膠原蛋白的含量有關(guān),而增加SIRT3的表達(dá)可以抑制LPS誘導(dǎo)的心臟微血管內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。

自噬可通過(guò)清除受損的細(xì)胞器及錯(cuò)誤折疊或聚集的蛋白質(zhì)維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。既往研究表明,自噬通量的恢復(fù)可抑制活性氧積累導(dǎo)致的內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化,從而改善阿霉素誘導(dǎo)的心臟纖維化[20]。LC3有Ⅰ型和Ⅱ型兩種形式,其中LC3-Ⅱ的含量與自噬體形成的程度呈正比[21,22]。p62蛋白與自噬降解水平相關(guān)[23]。本研究發(fā)現(xiàn),WT-LPS組小鼠心臟組織LC3-Ⅱ的表達(dá)水平升高且p62的表達(dá)水平下降,提示LPS可誘導(dǎo)小鼠心臟組織自噬水平應(yīng)激性升高。而與WT-LPS組比較,SIRT3-/--LPS組小鼠心臟組織自噬水平下降,說(shuō)明LPS誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠中SIRT3缺陷可抑制自噬激活。同時(shí)人心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)LPS刺激后自噬應(yīng)激性增強(qiáng),而 SIRT3過(guò)表達(dá)導(dǎo)致自噬水平進(jìn)一步增加。提示LPS誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠中EndMT的程度可能與自噬水平相關(guān),且 SIRT3參與自噬水平的調(diào)控。

SIRT3在治療心血管疾病領(lǐng)域具有很大潛力,從中藥中提取的一些成分,如白藜蘆醇、和厚樸酚等,可通過(guò)激活SIRT3發(fā)揮對(duì)心血管疾病的保護(hù)作用[24]。既往關(guān)于SIRT3的研究聚焦于其介導(dǎo)的膿毒癥心肌細(xì)胞損傷,機(jī)制主要涉及三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)合成障礙等,而關(guān)于SIRT3調(diào)控膿毒癥心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的機(jī)制研究較少[25～27]。本研究從膿毒癥心臟微循環(huán)障礙這一角度出發(fā),發(fā)現(xiàn)SIRT3缺陷可抑制LPS誘導(dǎo)的自噬激活,參與調(diào)控EndMT,進(jìn)而影響膿毒癥心臟功能及其纖維化。因此,筆者推測(cè)SIRT3可能作為膿毒癥心肌損傷的有效治療靶點(diǎn)。

本研究存在的不足:①缺乏特異性敲除心臟內(nèi)皮細(xì)胞SIRT3基因的小鼠,有關(guān)SIRT3調(diào)控內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的直接證據(jù)尚不充分;②動(dòng)物模型未設(shè)置多個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè),且未干擾自噬相關(guān)蛋白進(jìn)行分子之間上下游關(guān)系的驗(yàn)證,關(guān)于SIRT3的調(diào)控靶點(diǎn)有待進(jìn)一步明確,SIRT3與自噬及心肌纖維化之間的因果關(guān)系需要更深入的研究加以闡述。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn),LPS誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠中SIRT3缺陷可降低心臟組織自噬水平,促使心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化,進(jìn)而加重心臟舒張功能障礙及纖維化程度。SIRT3與膿毒癥心臟纖維化存在聯(lián)系,其中的機(jī)制有待于進(jìn)一步探究。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。