高瑞環(huán) 楊 桂 黎安玲 劉松梅

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)占原發(fā)性肝癌病例的75%～85%,是全球第6位最常見的惡性腫瘤和第四大主要死因[1]。由于肝癌早期表現(xiàn)為無癥狀進(jìn)展,大多數(shù)患者在首次就診時就已經(jīng)進(jìn)展為肝硬化甚至肝癌[2]。現(xiàn)已明確肝細(xì)胞癌的危險因素主要包括乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染、丙型肝炎病毒感染、非酒精性脂肪肝、代謝綜合征、煙草、酗酒、環(huán)境毒素等[3]。

IGFBP1(insulin growth factor binding protein 1, IGFBP1)是胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白超家族的成員,作為主要由肝臟產(chǎn)生的一種分泌性蛋白,廣泛存在于體液和組織細(xì)胞中,可以調(diào)控胰島素樣生長因子(insulin-like growth factors,IGFs)的半衰期和生物利用度,IGFBP1與IGF的高親和力可通過抑制IGF與其受體結(jié)合,進(jìn)而抑制胰島素受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[4,5]。腫瘤細(xì)胞常表現(xiàn)為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和代謝失調(diào),導(dǎo)致糖攝取增多、線粒體功能紊亂以及抗增殖信號逃逸[6]。研究發(fā)現(xiàn),IGFBP1在腫瘤中的作用具有雙面性,既發(fā)揮抑癌作用,又被認(rèn)為是癌基因[7]。作為一種肝臟分泌的血清蛋白,IGFBP1被證實在多種實體瘤中有著一定的臨床價值,例如食管癌、前列腺癌、胃癌等[8～10]。

近年來有研究指出,慢性丙型肝炎患者血清IGFBP1升高,并且在纖維化階段明顯增加[11]。血清IGFBP1可作為非酒精性脂肪肝患者晚期纖維化的生物學(xué)標(biāo)志物,然而肝癌患者血清IGFBP1的臨床意義尚不明確[12]。此外,慢性乙型肝炎是肝癌最常見的危險因素,雖有研究指出HBV感染抑制HepG2細(xì)胞分泌IGFBP1,但尚未見HBV感染與血清IGFBP1關(guān)系的研究報道[13]。本研究通過檢測體檢正常對照、慢性乙型肝炎患者、肝癌患者血清IGFBP1的水平,探究肝癌血清IGFBP1變化特征、診斷價值、風(fēng)險預(yù)測等臨床意義以及血清IGFBP1與HBV感染的關(guān)系。

資料與方法

1.研究對象:本研究為回顧性研究,采用-80℃凍存的血清標(biāo)本128份,來源于在武漢大學(xué)中南醫(yī)院就診的體檢正常對照個體(CTL組,n=32)、慢性乙型肝炎患者(CHB組,n=32)和肝癌患者(HCC組,n=64),并收集相對應(yīng)的臨床信息和實驗室檢查結(jié)果。納入標(biāo)準(zhǔn):①CHB組臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)符合《慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)》,HCC組臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)符合《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2019年版)》,CTL組無乙型肝炎感染史且實驗室檢測查結(jié)果正常[14,15];②有完善的臨床信息和實驗室檢查結(jié)果,至少包括血常規(guī)、血清肝腎功能和腫瘤標(biāo)志物, HBV-DNA或乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitis B surface antigen, HBsAg)。排除標(biāo)準(zhǔn):罹患或合并其他惡性腫瘤。本研究方案經(jīng)由中南醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會審批 (倫理學(xué)審批號:2017058),患者均簽署知情同意書。

2.儀器試劑: 采用貝克曼AU5800全自動生化分析儀檢測肝功能,貝克曼DX1800全自動化學(xué)發(fā)光儀測定甲胎蛋白(alpha fetoprotein, AFP)。血清IGFBP1的檢測采用ELISA試劑盒(購自武漢博士德生物工程有限公司),并在PE Enspire多功能酶標(biāo)分析儀上測定結(jié)果, ABI7300型熒光定量PCR分析儀檢測血清HBV-DNA。

3.檢測方法:按照試劑盒的說明書要求,經(jīng)預(yù)實驗確定,使用樣品稀釋液將血清稀釋40倍后,每孔加入100μl稀釋樣品,同時設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)品孔和空白對照孔。利用酶標(biāo)儀在450nm讀取吸光度A值。所有的標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品的A值減去空白對照孔的A值后,以吸光值作為縱坐標(biāo),以濃度作為橫坐標(biāo),制訂標(biāo)準(zhǔn)曲線。待測樣品IGFBP1濃度由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到。

結(jié) 果

1.一般資料和臨床資料:共納入32例正常對照(平均年齡為56.28±12.97歲,男性占81.25%),32例CHB患者(平均年齡為53.06±10.23歲,男性占81.25%),64例HCC患者平均年齡為55.95±11.07歲,其中男性占89.06%。如表1所示,3組間年齡和性別比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義,肝功能指標(biāo)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase, ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase, AST)、AST/ALT、總膽紅素、直接膽紅素、間接膽紅素、總蛋白、白蛋白(albumin,A)、球蛋白(globulin,G)、A/G、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶、堿性磷酸酶比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 納入研究對象的一般資料和臨床資料

2.組間血清IGFBP1水平的比較:3組間(CTL組、CHB組和HCC組)的血清IGFBP1水平存在差異(H=29.427,P<0.001,圖1A),其中HCC組的IGFBP1水平明顯高于CTL組和CHB組(P<0.05)。然而,CTL組和CHB組的IGFBP1水平比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。根據(jù)HBV-DNA和HBsAg將HCC患者分為HBV陽性患者(HBV-HCC)和HBV陰性患者(HBV+HCC)兩組,HBV-DNA≥20 IU/ml或HBsAg≥0.05IU/ml被認(rèn)為是HBV陽性,否則為HBV陰性,兩組HCC患者的血清IGFBP1水平比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05圖1B),提示HBV感染可能不影響肝癌患者血清IGFBP1的水平。

圖1 組間血清IGFBP1水平的比較

3.血清IGFBP1與AFP的相關(guān)性:經(jīng)典指標(biāo)AFP由于其較好的肝癌診斷效能,常被用于評價肝癌。經(jīng)檢驗,3組間(CTL組、CHB組和HCC組)的血清AFP水平比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(H=61.758,P<0.001,圖2A),其中HCC組的AFP水平明顯高于CTL組和CHB組(P<0.001)。然而,CTL組和CHB組的AFP水平比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。Spearman分析顯示,血清IGFBP1與AFP呈正相關(guān)(r=0.484,P<0.001,圖2B)。這些結(jié)果說明血清IGFBP1與血清AFP有較好的一致性,可能與肝癌有關(guān)。

圖2 血清IGFBP1與AFP的相關(guān)性

圖3 血清IGFBP1的ROC曲線

4.血清IGFBP1與肝功能指標(biāo)的相關(guān)性:為了進(jìn)一步探究血清IGFBP1是否與肝功能有關(guān),使用Spearman分析IGFBP1與肝功能指標(biāo)的相關(guān)性。如表2所示,血清與肝功能指標(biāo)ALT、AST、AST/ALT、總膽紅素、直接膽紅素、間接膽紅素、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶、堿性磷酸酶呈正相關(guān),與總蛋白、白蛋白、A/G呈負(fù)相關(guān),提示高水平的血清IGFBP1的水平與較差的肝功能相關(guān)。

表2 血清IGFBP1與肝功能指標(biāo)的相關(guān)性

5.血清IGFBP1的診斷效能:為了進(jìn)一步探究IGFBP1是否對肝癌具有診斷價值,進(jìn)行ROC曲線的分析與繪制,由于CTL組和CHB組的血清IGFBP1水平并無差異,因此將其合并為非HCC組,結(jié)果顯示, ROC曲線的曲線下面積為0.773,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(AUC=0.773, 95%CI: 0.693～0.852,P<0.001)。血清IGFBP1的診斷正確率為77.3%,最佳診斷界值為39.71,此時的敏感度為56.3%,特異性為85.9%。說明血清IGFBP1具有較好的診斷價值。

6.血清IGFBP1對肝癌的風(fēng)險評估:為了探究血清IGFBP1是否是肝癌發(fā)生的風(fēng)險因子,將CTL組和CHB組合并為非HCC組,使用二元Logistic回歸分析后,發(fā)現(xiàn)在排除了年齡、性別和AFP影響后,血清IGFBP1仍是肝癌的風(fēng)險因子(OR=1.049,95%CI:1.014～1.084,P=0.005),詳見表3。

表3 血清IGFBP1影響肝癌的二元Logistic回歸分析

討 論

肝癌糖過度消耗、代謝異常以及惡性改變的狀態(tài),部分原因可能是IGF-1、胰島素和葡萄糖的減少,以及IGFBP1表達(dá)上升和酮體增加[6]。IGFBP1主要來源于肝臟,因此其與肝臟疾病也密切相關(guān),研究證實,肝癌組織IGFBP1低于正常人和肝硬化患者,IGFBP1可以作為肝癌選擇性治療的反應(yīng)標(biāo)志物[16～18]。HMGA2可驅(qū)動IGFBP1/Akt途徑從而抑制肝癌細(xì)胞的惡性表現(xiàn)[19]。這些研究提示IGFBP1在肝癌中發(fā)揮作用。本研究發(fā)現(xiàn),肝癌患者血清IGFBP1的水平較高,并且與較差的肝功能相關(guān),同時血清IGFBP1對肝癌有較好的診斷效能。此外,血清IGFBP1還是肝癌的風(fēng)險因子,提示血清IGFBP1或許可以作為肝癌患者的血清生物學(xué)標(biāo)志物。值得注意的是,IGFBP1的變化趨勢在肝癌患者血清與肝癌組織中是不一致的,這種現(xiàn)象還出現(xiàn)于肝癌和胰腺癌組織和血清中klotho蛋白的表達(dá),這或許與IGFBP1的分泌過程和腫瘤微環(huán)境有關(guān),其中的原因還需要進(jìn)一步研究[20,21]。

AFP是早期肝癌診斷的主要血清標(biāo)志物,AFP的診斷敏感度、特異性分別為61.54%和81.73%,此時的診斷正確率為75.00%[22],然而AFP在多種實體腫瘤中均有高表達(dá),敏感度和特異性受到臨床需求的挑戰(zhàn)[23]。目前臨床上已經(jīng)將血清甲胎蛋白異質(zhì)體、異常凝血酶原、和血漿游離微小核糖核酸等指標(biāo)作為肝癌早期診斷的補(bǔ)充指標(biāo)[15]。本研究發(fā)現(xiàn),血清IGFBP1對肝癌有較好的診斷效能,特異性達(dá)到85.9%,而診斷正確率為77.3%,或許可以作為原發(fā)性肝癌的補(bǔ)充診斷指標(biāo)。

眾所周知,HBV感染是肝細(xì)胞癌變的重要危險因素,有研究指出,HBV感染患者AFP水平與HBV DNA濃度之間呈正相關(guān),乙肝相關(guān)性肝癌患者的血清AFP和PIVKA-Ⅱ升高,并且具有診斷價值,表明AFP和PIVKA-Ⅱ與HBV感染所致肝癌有關(guān)[24,25]。而本研究發(fā)現(xiàn),慢性乙肝感染者血清IGFBP1未改變,而且HBV相關(guān)肝癌患者的血清IGFBP1的水平與單純肝癌相當(dāng),因此HBV感染似乎不影響血清IGFBP1的水平,但仍需更大的樣本量進(jìn)行驗證。本研究結(jié)果有待于擴(kuò)大樣本量做進(jìn)一步臨床數(shù)據(jù)分析或進(jìn)行深入性實驗研究探究機(jī)制。此外,由于本研究主要是為了探究IGFBP1在肝癌中的臨床意義,所以并沒有設(shè)置肝硬化組,但這并不影響本研究結(jié)論。

綜上所述,IGFBP1在肝癌中的作用及機(jī)制可能是復(fù)雜的,但對于血清IGFBP1來說,肝癌患者血清中 IGFBP1水平升高對于肝癌的診斷和預(yù)測是有重要的臨床意義的。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。