摘要：目的 探究CRISPR/Cas9技術(shù)靶向抑制去整合素-金屬蛋白酶8（ADAM8）在小鼠急性酒精性肝損傷中的作用及分子機(jī)制。方法 18只6～8周齡健康雌性昆明小鼠根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、酒精組和質(zhì)粒組，每組6只。正常組不做處理，質(zhì)粒組采用水流動(dòng)力學(xué)注射法尾靜脈注射利用CRISPR/Cas9技術(shù)抑制ADAM8基因的三合一重組質(zhì)粒ADAM8-sgRNA3（3 g/kg），酒精組尾靜脈注射等量生理鹽水。酒精組和質(zhì)粒組采用50%（V/V）分析純乙醇一次性灌胃（14 mL/kg）誘導(dǎo)急性肝損傷。禁食16 h后進(jìn)行眼球取血，檢測(cè)丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）活性；蘇木素-伊紅（HE）和過碘酸-雪夫（PAS）染色檢測(cè)肝臟損傷和糖原變化情況；蛋白免疫印跡法檢測(cè)肝組織中ADAM8、細(xì)胞色素CYP450 2E1（CYP2E1）、熱休克蛋白70（HSP70）及絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路相關(guān)因子的表達(dá)。結(jié)果 與正常組相比，酒精組ALT和AST升高，肝損傷評(píng)分增加，糖原含量減少，ADAM8、CYP2E1、磷酸化的細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（p-ERK1/2）、磷酸化的p38（p-p38）MAPK以及磷酸化的c-Jun氨基未端激酶（p-c-Jun）的表達(dá)升高，而HSP70的表達(dá)降低（P＜0.05）。與酒精組相比，質(zhì)粒組ALT和AST降低，肝損傷評(píng)分降低（P＜0.05），糖原含量增多；ADAM8、CYP2E1、p-ERK1/2、p-p38 MAPK以及p-c-Jun的表達(dá)降低，HSP70的表達(dá)增加（P＜0.05）。結(jié)論 利用CRISPR/Cas9技術(shù)靶向抑制ADAM8的表達(dá)，可以通過MAPK信號(hào)通路改善小鼠急性酒精性肝損傷。

關(guān)鍵詞：ADAM蛋白質(zhì)類；急性酒精性肝損傷；絲裂原激活蛋白激酶類；CRISPR/Cas9

中圖分類號(hào)：R364.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.11958/20231741

The effect of ADAM8 expression on acute alcoholic liver injury in mice

YANG Mengli， LI Sanqiang△， ZHANG Kaijie， CUI Qinyi， FENG Jiayang， LI Yilin， LI Haoyuan， QI Jinghan

College of Basic Medicine and Forensic Medicine， Henan University of Science and Technology， Luoyang 471000， China

Corresponding Author E-mail： sanqiangli2001@163.com

Abstract： Objective To investigate the role and molecular mechanism of CRISPR/Cas9 technology targeting the inhibition of disintegrin and metalloprotease 8 （ADAM8） in acute alcoholic liver injury in mice. Methods Eighteen healthy Kunming female mice aged 6-8 weeks were randomly divided into the normal group， the alcohol group and the plasmid group， with 6 mice in each group. The normal group was given no treatment， and the plasmid group was injected with three-in-one recombinant plasmid ADAM8-sgRNA3 （3 g/kg） by CRISPR/Cas9 technology to inhibit the ADAM8 gene using hydrodynamic injection tail vein method. The alcohol group was injected with an equal amount of physiological saline through tail vein. After 3 days of regular feeding， the alcohol group and the plasmid group were subjected with 50% （V/V） alcohol analytical grade ethanol by a one-time gavage （14 mL/kg） to induce acute liver injury. After fasting for 16 hours， eyeball blood sample was taken to detect activities of alanine aminotransferase （ALT） and aspartate aminotransferase （AST）. Mice were euthanized and liver tissue was separated and extracted. Hematoxylin-Eosin staining （HE staining） and Periodic Acid-Schiff staining （PAS staining） were used to detect liver injury and glycogen changes in each group of mice. The expression levels of ADAM8， cytochrome CYP450 2E1 （CYP2E1）， heat shock protein 70 （HSP70） and mitogen-activated protein kinase （MAPK） pathway related factors were detected by Western blot assay. Results Compared with the normal group， ALT and AST were increased， liver injury score was increased， glycogen content was decreased， ADAM8， CYP2E1， phosphorylated extracellular regulated kinase 1/2 （p-ERK1/2）， phosphorylated p38 （p-p38） MAPK and phosphorylated c-Jun aminoterminal kinase （p-c-Jun） were increased in the alcohol group. The expression of HSP70 was decreased （P＜0.05）. Compared with alcohol group， ALT and AST were decreased， liver injury score was decreased in the plasmid group （P＜0.05）. Glycogen content was increased. ADAM8， CYP2E1， p-ERK1/2， p-P38 MAPK and p-c-Jun expression levels were decreased， while HSP70 expression was increased （P＜0.05）. Conclusion Targeted inhibition of ADAM8 expression by CRISPR/Cas9 technology can improve acute alcoholic liver injury in mice through MAPK signaling pathway.

Key words： ADAM proteins; acute alcoholic liver injury; mitogen-activated protein kinases; CRISPR/Cas9

近年來，隨著飲酒人群比例的增加，全球超過7 500萬人面臨與酒精有關(guān)的肝病風(fēng)險(xiǎn)［1］，每年有約200萬人死于酒精性肝病［2］。而急性酒精性肝損傷是酒精性肝病的前期過程，是指在短期內(nèi)攝入過量酒精，超過肝臟的代謝能力，誘發(fā)肝組織結(jié)構(gòu)紊亂和肝細(xì)胞受損等一系列病理變化，從而導(dǎo)致肝功能異常，同時(shí)觸發(fā)機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)［3］。去整合素-金屬蛋白酶（a disintegrin and metalloprotease，ADAM）8是ADAMs家族中的重要一員，具有金屬內(nèi)切酶活性和去整合素的功能，廣泛參與細(xì)胞黏附，信號(hào)傳導(dǎo)及炎癥反應(yīng)等調(diào)控過程。研究表明，ADAM8的高表達(dá)在胃癌、胰腺癌和結(jié)直腸癌等多種疾病中發(fā)揮著重要作用［4-5］。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于ADAM8與肝臟關(guān)系的研究逐漸增多［6-7］。本課題組前期研究結(jié)果表明，ADAM8可加重四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷［8］。但缺乏ADAM8在急性酒精性肝損傷中的作用和分子機(jī)制的研究。筆者利用CRISPR/Cas9技術(shù)靶向抑制ADAM8的表達(dá)來研究其在小鼠急性酒精性肝損傷中的作用及調(diào)控機(jī)制，以期為臨床防治提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、細(xì)胞和質(zhì)粒 健康SPF級(jí)雌性昆明小鼠18只，6～8周齡，體質(zhì)量（35±5）g，購(gòu)自河南斯克貝斯生物科技股份有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（豫）2020-0005。小鼠飼養(yǎng)于鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院［動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（豫）2020-0016］，通風(fēng)良好，溫度（25±2）℃，相對(duì)濕度40%～60%，晝夜節(jié)律（12 h/12 h）相對(duì)恒定，提供標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由進(jìn)食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)１周后開始建模。小鼠成肌細(xì)胞C2C12購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。重組質(zhì)粒和菌株購(gòu)自南京堯舜禹生物科技有限公司。

1.2 主要試劑與儀器 無水乙醇購(gòu)自天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司；去內(nèi)毒素質(zhì)粒中提試劑盒購(gòu)自O(shè)mega科技有限公司；丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所有限公司；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒和ECL超敏化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自白鯊生物科技公司；過碘酸-雪夫（PAS）糖原染色試劑盒購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司；鼠源抗ADAM8單克隆抗體購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；兔源抗細(xì)胞色素CYP450 2E1（cytochrome P4502E1，CYP2E1）單克隆抗體購(gòu)自華安生物科技有限公司；鼠源抗熱休克蛋白70（heat shock 70，HSP70）、鼠源抗磷酸化的細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（phosphorylated extracellular regulated kinase 1/2，p-ERK1/2）、鼠源抗磷酸化的c-Jun氨基未端激酶（phosphorylated c-Jun N-terminal kinase，p-c-Jun）以及鼠源抗磷酸化的p38絲裂原活化蛋白激酶（phosphorylated p38 mitogen activated protein kinase，p-p38 MAPK）單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；兔源抗β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）單克隆抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記山羊抗小鼠或抗兔IgG二抗購(gòu)自北京安必維抗體技術(shù)有限公司。Leica半自動(dòng)組織切片機(jī)（RM2128）購(gòu)自德國(guó)徠卡有限公司；CX31RBSF光學(xué)顯微鏡購(gòu)自?shī)W林巴斯（中國(guó)）有限公司；JY300c電泳儀購(gòu)自北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析購(gòu)自上海天能科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 有效質(zhì)粒ADAM8-單鏈向?qū)NA（single-guide RNA，sgRNA）的篩選 根據(jù)ADAM8的基因信息設(shè)計(jì)3條sgRNA，利用CRISPR/Cas9最新RNP基因敲除技術(shù)，即Cas9與sgRNA形成復(fù)合物，配合自動(dòng)移液工作站和高效電轉(zhuǎn)化平臺(tái)在小鼠成肌細(xì)胞C2C12中構(gòu)建ADAM8基因KO pool，通過對(duì)其進(jìn)行Sanger測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果與野生型細(xì)胞的序列進(jìn)行比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)sgRNA3為有效sgRNA。本課題組前期通過蛋白免疫印跡法進(jìn)一步驗(yàn)證sgRNA3為有效sgRNA，其序列為5′?ATGGGGCAAAGGAGGTCCAGGGG-3′。采用CRISPR/Cas9技術(shù)設(shè)計(jì)構(gòu)建靶向突變小鼠ADAM8基因的三合一重組質(zhì)?！皃YSY-CMV-Cas9-U6-ADAM8-sgRNA3-EFla-puro”。

1.3.2 動(dòng)物分組及模型制備 18只小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、酒精組和質(zhì)粒組，每組6只。正常組小鼠不做處理，質(zhì)粒組小鼠采用水流動(dòng)力學(xué)注射法尾靜脈注射篩選出的有效質(zhì)粒ADAM8-sgRNA3（3 g/kg）［9-10］，酒精組小鼠尾靜脈注射等量的生理鹽水。常規(guī)喂養(yǎng)3 d后，酒精組和質(zhì)粒組小鼠采用50%（V/V）分析純乙醇一次性灌胃（14 mL/kg）誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷［11］。灌胃結(jié)束后，各組小鼠禁食禁水16 h，眼球取血后頸椎脫臼處死小鼠并取其新鮮肝臟組織。

1.3.3 HE和PAS染色觀察肝組織病理損傷和糖原含量變化 每只小鼠取肝大葉放入4%多聚甲醛中固定24 h，流水沖洗24 h，然后依次經(jīng)過乙醇梯度脫水、透明、石蠟包埋、切片（4 μm），隨后進(jìn)行60 ℃烤片1 h，常規(guī)脫蠟至水后按試劑盒說明書進(jìn)行HE和PAS染色，200倍顯微鏡下觀察肝組織病理損傷和糖原含量變化并拍片保存。肝損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：脂肪變性，＜5%（0分）、5%～33%（1分）、34%～67%（2分）、gt;67%（3分）；小葉炎癥，無病灶（0分）、＜2個(gè)病灶/視野（1分）、2～4個(gè)病灶/視野（2分）、gt;4個(gè)病灶/視野（3分）；氣泡樣變，無（0分）、少見（1分）、多見（2分）。糖原含量變化定量采用Image J軟件檢測(cè)各組肝臟切片的光密度值，并進(jìn)行歸一化處理。

1.3.4 血清ALT與AST檢測(cè) 各組小鼠眼球取血后，室溫自然靜置凝固20 min，4 000 r/min離心20 min后分離出血清，按試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測(cè)ALT與AST的酶活性變化。

1.3.5 免疫印跡法檢測(cè)肝組織中ADAM8、CYP2E1、HSP70、p-ERK1/2、p-p38以及p-c-Jun的表達(dá)量 先稱量并標(biāo)記好肝組織，以1 g肝組織加1 mL裂解液的比例用超聲破碎儀破碎，于4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液分裝，進(jìn)行BCA蛋白濃度測(cè)定，使蛋白濃度歸一化。然后蛋白印跡按常規(guī)方法配制聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗（β-actin稀釋比例為1∶5 000，ADAM8與CYP2E1為1∶2 000，HSP70、p-ERK1/2、p-p38及p-c-Jun為1∶1 000）和二抗。以β-actin作為內(nèi)參。用Image J軟件檢測(cè)目的蛋白與內(nèi)參β?actin蛋白條帶灰度值并計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Prism GraphPad 9.5.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用[x] ±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Tukey檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠肝臟組織病理學(xué)變化 HE和PAS染色結(jié)果顯示，正常組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞形態(tài)完整，以中央靜脈為中心向四周呈放射狀排列，肝索排列比較均勻，無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，糖原含量十分豐富；與正常組相比，酒精組小鼠灌胃后肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝索排列紊亂，出現(xiàn)肝細(xì)胞腫大破裂伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肝損傷評(píng)分升高，糖原含量減少（P＜0.05）；質(zhì)粒組小鼠肝細(xì)胞破壞較酒精組明顯減輕，肝索排列較整齊，肝損傷評(píng)分降低（P＜0.05），糖原含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1、圖1。

2.2 血清ALT和AST酶活性變化 與正常組相比，酒精組小鼠血清ALT、AST活性升高（P＜0.01）；與酒精組相比，質(zhì)粒組血清ALT、AST活性降低（P＜0.01），見表2。

2.3 各組小鼠肝組織中ADAM8、CYP2E1、HSP70、p-ERK1/2、p-p38及p-c-Jun的表達(dá)變化 與正常組小鼠相比，酒精組小鼠肝組織中ADAM8、CYP2E1、p-ERK1/2、p-p38及p-c-Jun的蛋白表達(dá)量升高，而HSP70的表達(dá)量降低（P＜0.05）；與酒精組相比，質(zhì)粒組ADAM8、CYP2E1、p-ERK1/2、p-p38及p-c-Jun的蛋白表達(dá)量降低，而HSP70的表達(dá)量增加（P＜0.05），見表3、圖2。

3 討論

急性酒精性肝損傷是短期內(nèi)大量飲酒導(dǎo)致肝臟損傷的疾病，是世界性的公共衛(wèi)生問題，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。酒精性肝病發(fā)病原因單一，但發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其中最關(guān)鍵的原因?yàn)檠趸瘧?yīng)激與炎癥反應(yīng)。近年來，對(duì)酒精性肝病發(fā)病機(jī)制和治療方法的研究雖然取得了一定進(jìn)步，但是迄今為止尚無特效治療方法。ADAM8參與一系列膜結(jié)合受體、細(xì)胞因子等蛋白的水解過程，也可參與調(diào)節(jié)細(xì)胞形態(tài)和運(yùn)動(dòng)，且有多種配體，涉及不同的信號(hào)通路及信號(hào)分子，共同調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的傳導(dǎo)和生理性調(diào)控［4］。

本研究結(jié)果顯示，酒精組小鼠血清ALT和AST明顯升高，肝小葉的結(jié)構(gòu)不清晰，肝索排列出現(xiàn)紊亂，部分細(xì)胞出現(xiàn)水腫現(xiàn)象，且糖原含量明顯減少，HSP70表達(dá)降低，表明酒精誘導(dǎo)急性肝損傷小鼠模型構(gòu)建成功。酒精破壞肝細(xì)胞內(nèi)多種酶系導(dǎo)致肝糖原合成受阻，可能與氧化應(yīng)激有關(guān)。當(dāng)損傷超出一定限度，肝細(xì)胞可變性壞死導(dǎo)致應(yīng)激蛋白HSP70合成障礙，失去對(duì)外來刺激的抵抗作用，從而造成細(xì)胞損傷程度加重。本研究蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，酒精組小鼠ADAM8高表達(dá)，表明ADAM8在小鼠急性肝損傷中表達(dá)增加，可能發(fā)揮著促進(jìn)肝損傷的作用，通過尾靜脈注射有效質(zhì)粒ADAM8-sgRNA3抑制ADAM8的表達(dá)后，質(zhì)粒組小鼠血清ALT和AST明顯下降，肝損傷病理情況改善，糖原含量增多，HSP70的表達(dá)增加，ADAM8的表達(dá)減少，表明有效抑制ADAM8的表達(dá)可以減輕小鼠急性酒精性肝臟的損傷程度。

MAPK信號(hào)主要參與氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，而酒精誘導(dǎo)引起的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)是酒精肝發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。肝臟微粒體CYP2E1主要參與脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，進(jìn)一步放大酒精的肝臟毒性作用。乙醇可促進(jìn)CYP2E1的表達(dá)，進(jìn)而產(chǎn)生活性氧（ROS）造成機(jī)體損害。肝細(xì)胞接受到ROS信號(hào)后，MAPK信號(hào)通路迅速激活，細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38 MAPK是其主要的調(diào)控方式。有研究通過構(gòu)建針對(duì)ADAM8的小干擾寡核苷酸RNA（siRNA）和過表達(dá)質(zhì)粒，沉默和上調(diào)ADAM8的表達(dá)，可以下調(diào)或激活p-ERK信號(hào)通路，從而抑制或促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲［12-14］。本研究結(jié)果顯示，酒精刺激誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷時(shí)，酒精組CYP2E1、p-ERK、p-p38和p-c-Jun表達(dá)增加，而利用CRISPR/Cas9技術(shù)靶向抑制ADAM8的表達(dá)，質(zhì)粒組CYP2E1、p-ERK、p-p38和p-c-Jun表達(dá)減少，表明ADAM8可能通過激活MAPK信號(hào)通路促進(jìn)急性酒精性肝損傷。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)利用CRISPR/Cas9技術(shù)靶向抑制ADAM8的表達(dá)可以改善小鼠急性酒精性肝損傷，這可能與MAPK信號(hào)通路有關(guān)，為臨床治療急性酒精性肝損傷提供了新的可能。但本研究也存在一定不足，急性酒精性肝損傷致病機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，本研究?jī)H從MAPK信號(hào)通路的關(guān)鍵因子入手研究，有關(guān)ADAM8對(duì)急性酒精性肝損傷促進(jìn)作用的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（82170606）；河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目計(jì)劃基礎(chǔ)研究專項(xiàng)（23ZX006）

作者單位：河南科技大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院（郵編471000）

作者簡(jiǎn)介：楊孟利（1999），女，碩士在讀，主要從事肝損傷與修復(fù)分子機(jī)制研究。E-mail：2186374936@qq.com

通信作者 E-mail：sanqiangli2001@163.com

（本文編輯 李志蕓）