許麗娟 吳海雁 喻孟元 高帥帥 王玉梅 吳民熙 王震 吳迎奔

摘要： 干酪乳桿菌LDJ是一株能抑制變形桿菌生長(zhǎng)的優(yōu)良菌株。為了探究干酪乳桿菌LDJ無(wú)細(xì)胞上清液的抑菌效果，采用牛津杯法測(cè)定了不同培養(yǎng)時(shí)間的無(wú)細(xì)胞上清液對(duì)變形桿菌的抑菌能力，發(fā)酵時(shí)間在0～4 h時(shí)無(wú)細(xì)胞上清液無(wú)抑菌能力，發(fā)酵至8 h時(shí)抑菌能力逐步上升，發(fā)酵時(shí)間在24～48 h時(shí)無(wú)細(xì)胞上清液抑菌能力趨于平穩(wěn)；其中，發(fā)酵時(shí)間在36 h時(shí)，抑菌圈直徑最大，為20.48 mm。干酪乳桿菌LDJ無(wú)細(xì)胞上清液中抑菌物質(zhì)的理化特性研究結(jié)果表明：該抑菌物質(zhì)對(duì)大腸桿菌，金黃色葡萄球菌和李斯特菌都有不同程度的抑制作用；無(wú)細(xì)胞上清液經(jīng)40～100℃處理30 min，仍有良好的抑菌活性；pH值在3～6范圍內(nèi)抑菌物質(zhì)有良好的抑菌效果，在中性及堿性條件下則沒(méi)有抑菌作用；不同酶處理對(duì)無(wú)細(xì)胞上清液的抑菌效果有不同程度的影響。因此，推測(cè)其抑菌有效成分可能為肽類及有機(jī)酸。

關(guān)鍵詞： 干酪乳桿菌；變形桿菌；抑菌活性；抑菌物質(zhì)

中圖分類號(hào)：S182文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1006-060X（2024）02-0006-04

Inhibition of Proteusbacillus vulgaris by Main Antibacterial Substances in Lactobacillus casei LDJ

XU Li-juan1，3，WU Hai-yan2，3，YU Meng-yuan1，3，GAO Shuai-shuai1，3，WANG Yu-mei2，3，

WU Min-xi1，3，WANG Zhen1，3，WU Ying-ben1，3

（1. Hunan Institute of Microbiology， Changsha 410009， PRC; 2. Hunan Kemeijie Environmental Science and Technology Co.， Ltd.， Changsha 410000， PRC; 3. Changsha Center for Innovation in Bio-Disinfection and Deodorization Technology， Changsha 410000， PRC）

Abstract： Lactobacillus casei LDJ is an excellent strain that can inhibit the growth of Proteusbacillus vulgaris. To investigate the antibacterial effect of the cell-free supernatant of Lactobacillus casei LDJ， the antibacterial ability of cell-free supernatant with different fermentation time on Proteusbacillus vulgaris was tested by the Oxford cup method. When the fermentation time was 0–4 h， the cell-free supernatant had no antibacterial ability. The antibacterial ability increased gradually after fermentation of 8 h and tended to be stable when fermentation time was 24–48 h. Specifically， when the fermentation time was 36 h， the diameter of the antibacterial zone was the largest （20.48 mm）. The research on physicochemical properties of the antibacterial substances in the cell-free supernatant of Lactobacillus casei LDJ shows that the antibacterial substance has various inhibitory effects on Escherichia coli， Staphylococcus aureus， and Listeria monocytogenes. The cell-free supernatant still has good antibacterial activity after treatment at 40–100℃ for 30 min. The antibacterial substance has a good antibacterial effect in the range of pH value 3–6 but shows no antibacterial effect under neutral and alkaline conditions. Different enzyme treatments have different effects on the antibacterial effect of cell-free supernatant. Therefore， it is speculated that the effective antibacterial components of Lactobacillus casei LDJ may be peptides and organic acids.

Key words： Lactobacillus casei; Proteusbacillus vulgaris; antibacterial activity; antibacterial substance

變形桿菌是革蘭氏陰性菌，形態(tài)多變，有桿狀、球桿狀、絲狀等，無(wú)芽孢、無(wú)莢膜、有鞭毛、好運(yùn)動(dòng)[1]，在自然界分布廣泛，土壤、水、垃圾、腐爛有機(jī)物及人或動(dòng)物的腸道內(nèi)均有分布[2]。變形桿菌是魚(yú)類特定腐敗菌之一[3]，也可寄生于人體腸道，當(dāng)機(jī)體抵抗力下降時(shí)可引起尿路感染、呼吸道感染、腹膜炎、胃腸炎等，對(duì)人類健康造成影響[4]。

乳酸菌是一類可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌的統(tǒng)稱[5]。乳酸菌在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生如乳酸、乙酸等有機(jī)酸[6]、有抑菌作用的蛋白質(zhì)[7]或多肽類[8]等物質(zhì)。有研究人員認(rèn)為，乳酸菌產(chǎn)酸降低了生長(zhǎng)環(huán)境的pH值，從而不利于沙門(mén)氏菌、布氏桿菌等有害菌的生長(zhǎng)[9]；馬歡歡等[10]研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌產(chǎn)生的乙酸和乳酸共同對(duì)黑曲霉起抑菌作用；陸春波等[9]研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌DY6的主要抑菌物質(zhì)為有機(jī)酸和脂肪酸；李宏偉等[11]分析得出，乳桿菌抑制豬霍亂沙門(mén)氏菌的有效成分為小肽類或有機(jī)酸亦或其共同作用。

課題組前期分離純化了一株對(duì)變形桿菌有抑制作用的干酪乳桿菌LDJ，該研究以其發(fā)酵液為研究對(duì)象，將發(fā)酵液制備成無(wú)細(xì)胞上清液，然后研究其對(duì)變形桿菌的抑制作用，并初步分析了干酪乳桿菌LDJ發(fā)酵液中抑菌物質(zhì)的理化特性，為探明干酪乳桿菌LDJ對(duì)變形桿菌的抑菌成分提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 干酪乳桿菌LDJ（Lactobacillus

casei LDJ）由湖南省微生物研究院實(shí)驗(yàn)室分離獲得；變形桿菌1.1651購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院微生物菌種保藏中心；大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和李斯特菌由湖南省微生物研究院菌種保藏中心提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 （1）營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，牛肉膏3.0 g，NaCl 5.0 g，加水至1 L，pH值7.4±0.2，加15.0 g瓊脂為固體培養(yǎng)基，121℃滅菌20 min。（2）MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g、牛肉粉5.0 g、酵母粉4.0 g、葡萄糖2.0 g、吐溫80 1.0 mL、磷酸氫二鉀2.0 g、乙酸鈉5.0 g、檸檬酸二銨2.0 g、硫酸鎂0.2 g、硫酸錳0.05 g，加水至1 L，調(diào)pH值6.5±0.2，加15.0 g瓊脂為固體培養(yǎng)基，121℃滅菌20 min。

1.1.3 主要設(shè)備和儀器 生化培養(yǎng)箱（LRH-400A，廣東泰宏君科學(xué)儀器股份有限公司）；潔凈工作臺(tái)（SW-CJ-2F，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）； 雷磁pH計(jì)（PHS-3E型， 上海儀電科儀）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（KH30R-Ⅱ，湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（DK-S26型，上每森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；美菱冰箱（BCD-249CF，合肥美菱股份有限公司）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（GZX-9240MBE，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；立式壓力蒸汽滅菌器（BXM-30R，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（TU-1810，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 干酪乳桿菌LDJ無(wú)細(xì)胞上清液的制備 將保存于-80℃的干酪乳桿菌LDJ活化后，再將其按3%的接種量接于MRS培養(yǎng)基中，37±2℃培養(yǎng)48 h后，取菌液于無(wú)菌EP管中，10 000 r/min離心30 min，再用0.22 μm的濾膜過(guò)濾，得無(wú)細(xì)胞上清液，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 干酪乳桿菌LDJ無(wú)細(xì)胞上清液的抑菌試驗(yàn) 首先將營(yíng)養(yǎng)肉湯固體培養(yǎng)基倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，待其凝固后，加入100 μL的變形桿菌菌液并涂布均勻，然后用鑷子將無(wú)菌牛津杯置于凝固的培養(yǎng)基上，再往牛津杯中加入干酪乳桿菌無(wú)細(xì)胞上清液200 μL，平行加入卡那毒素于另外的牛津杯中作為陽(yáng)性對(duì)照，加入已滅菌MRS培養(yǎng)基的牛津杯為陰性對(duì)照，于37℃下培養(yǎng)24 h，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑。

1.2.3 不同培養(yǎng)時(shí)間無(wú)細(xì)胞上清液的抑菌活性研究 將活化后的干酪乳桿菌按3%的接種量接到200 mL的MRS培養(yǎng)基中，37±2℃培養(yǎng)，分別在0、4、8、12、16、20、24、30、36、48 h取5 mL發(fā)酵液，測(cè)定其OD600值； 然后參照1.2.1的方法制成無(wú)細(xì)胞上清液，再參照1.2.2的方法測(cè)定每個(gè)時(shí)間段對(duì)變形桿菌的抑菌活性。

1.2.4 干酪乳桿菌LDJ抑菌物質(zhì)的理化特性研究 （1）抑菌物質(zhì)穩(wěn)定性研究：將干酪乳桿菌無(wú)細(xì)胞上清液分別在40、60、80、100℃條件下處理30 min[8]，測(cè)定不同處理后的樣品對(duì)變形桿菌的抑制作用。用1.0 mol/L的HCl和NaOH將無(wú)細(xì)胞上清液調(diào)至pH值為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0并保持1 h，比較經(jīng)過(guò)不同處理的樣品對(duì)變形桿菌的抑制情況。（2）酶處理對(duì)抑菌物質(zhì)的影響：將無(wú)細(xì)胞上清液pH值調(diào)至各酶的最適pH值，胃蛋白酶pH 2.0、胰蛋白酶pH 7.0和蛋白酶K pH 7.5，分別加入胃蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K，使其終質(zhì)量濃度均為1.0 g/L，在各自最適的溫度下反應(yīng)1 h后，沸水浴3 min滅酶，冷卻后將pH值調(diào)回至無(wú)細(xì)胞上清液初始pH值，以未經(jīng)酶處理的無(wú)細(xì)胞上清液為對(duì)照，采用牛津杯法測(cè)定其抑菌圈直徑[9]。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.5 抑菌物質(zhì)的抑菌活性 （1）抑菌物質(zhì)稀釋倍數(shù)試驗(yàn)：將干酪乳桿菌LDJ無(wú)細(xì)胞上清液用紫外分光光度計(jì)在600 nm處測(cè)定其吸光度值，并調(diào)整OD值為1，然后采用倍數(shù)稀釋法將無(wú)細(xì)胞上清液分別稀釋為2、4、8倍，用牛津杯法，將上述稀釋液分別對(duì)變形桿菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，考察抑菌物質(zhì)的最大稀釋倍數(shù)。每個(gè)處理重復(fù)3次。（2）抑菌廣譜性分析：將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和李斯特菌按1%的接種量分別接于100 mL的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37±2℃培養(yǎng)24 h后，再參照1.2.2進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。每個(gè)處理重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)時(shí)間的抑菌情況

從圖1可知，無(wú)細(xì)胞上清液的抑菌效果與其菌體的生長(zhǎng)情況呈正相關(guān)。干酪乳桿菌LDJ接種8 h后開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)期，到24 h后生長(zhǎng)趨于平穩(wěn)。發(fā)酵0～4 h的無(wú)細(xì)胞上清液對(duì)變形桿菌沒(méi)有抑制作用，發(fā)酵8 h后抑菌效果明顯提高，抑菌直徑為10.33 mm；發(fā)酵24 h時(shí)，抑菌圈直徑達(dá)20.11 mm，發(fā)酵36 h時(shí)抑菌圈直徑最大，為20.48 mm。從圖1中還可看出，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，抑菌圈直徑也隨之增加。這是因?yàn)殡S著菌體的增加，發(fā)酵液中抑菌物質(zhì)的種類和含量也隨之增加，因此抑菌作用增強(qiáng)，抑菌圈直徑增大；但當(dāng)菌體數(shù)量達(dá)到平衡狀態(tài)時(shí)，抑菌物質(zhì)的含量也保持穩(wěn)定，因此抑菌作用不再增強(qiáng)，抑菌圈直徑也不再增加。

2.2 抑菌物質(zhì)的理化特性

2.2.1 熱穩(wěn)定性 從圖2可知，無(wú)細(xì)胞上清液經(jīng)40、60、80、100℃處理30 min后，與CK相比，抑菌活性未發(fā)生顯著變化，表明無(wú)細(xì)胞上清液中的抑菌物質(zhì)有良好的熱穩(wěn)定性。

2.2.2 pH值穩(wěn)定性 由表1可知，隨著pH值的升高，發(fā)酵液中抑菌物質(zhì)的抑菌活性逐漸降低，當(dāng)pH值為7及以上時(shí)，抑菌活性完全消失。因此，干酪乳桿菌LDJ無(wú)細(xì)胞上清液中的抑菌物質(zhì)在pH值3.0～5.0范圍內(nèi)抑菌活性較強(qiáng)，而在中性和堿性條件下沒(méi)有抑菌活性?？赡苁且?yàn)樵趬A性條件下，蛋白質(zhì)在分子間靜電相互作用下誘導(dǎo)氨基和羧基的解離，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性丟失了抑菌活性。這與呂欣然[12]的研究結(jié)果一致。

2.3 酶處理對(duì)抑菌物質(zhì)的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，CK和胃蛋白酶的抑菌圈直徑分別為20.58±0.05 和8.05±0.63 mm，說(shuō)明經(jīng)胃蛋白酶處理后，抑菌活性部分喪失，而經(jīng)胰蛋白酶、蛋白酶K處理后，抑菌活性完全消失。這說(shuō)明干酪乳桿菌無(wú)細(xì)胞上清液中的抑菌活性物質(zhì)有蛋白類或肽類物質(zhì)。

2.4 抑菌物質(zhì)的抑菌活性

2.4.1 抑菌物質(zhì)的稀釋倍數(shù)對(duì)抑菌活性的影響 試驗(yàn)結(jié)果表明，抑菌物質(zhì)的稀釋倍數(shù)為0、2、4倍時(shí)，抑菌圈直徑分別為20.49±0.18、18.22±0.17、11.38±0.15 mm，說(shuō)明干酪乳桿菌LDJ無(wú)細(xì)胞上清液的抑菌能力隨著稀釋倍數(shù)的增大而降低，無(wú)細(xì)胞上清液稀釋4倍時(shí)，抑菌圈直徑與原液抑菌圈直徑相比小了近一半。而稀釋8倍時(shí)，抑菌圈直徑為0，抑菌活性完全消失。

2.4.2 抑菌譜 干酪乳桿菌LDJ無(wú)細(xì)胞上清液除了對(duì)變形桿菌有抑制作用外，還對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和李斯特菌進(jìn)行了抑菌試驗(yàn)，結(jié)果如表2、圖3所示，干酪乳桿菌LDJ無(wú)細(xì)胞上清液對(duì)革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌都有不同程度的抑制作用。這表明干酪乳桿菌LDJ產(chǎn)生的是一類具有廣譜抑菌活性的抑菌物質(zhì)。

3 結(jié)論

變形桿菌是一種人畜共患病原體，為條件致病菌，變形桿菌中毒是最常見(jiàn)的食物中毒類型[13]，而且它還是垃圾中主要的致腐微生物之一，能分解垃圾中的含氮有機(jī)物產(chǎn)生氨氣散發(fā)至周圍空氣

中[14-15]。因此，變形桿菌具有危害人體健康和污染環(huán)境等多重風(fēng)險(xiǎn)。

干酪乳桿菌LDJ是從環(huán)境中分離得到的一株土著安全高效的降氨微生物，其無(wú)細(xì)胞上清液能抑制變形桿菌的生長(zhǎng)，除此之外，還對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和李斯特菌均有很好的抑制作用，而且上清液中的抑菌物質(zhì)有良好的熱穩(wěn)定性，在酸性條件下抑菌效果好。經(jīng)不同酶處理后，抑菌活性部分喪失或完全消失。綜合試驗(yàn)結(jié)果，說(shuō)明干酪乳桿菌無(wú)細(xì)胞上清液中的抑菌活性物質(zhì)可能為有機(jī)酸類和蛋白類或肽類物質(zhì)。

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（責(zé)任編輯：張煥裕）