曾強(qiáng) 周偉 郭歡樂(lè) 曹鐘洋 彭明 周虹 湯彬 陳志輝

摘要：以轉(zhuǎn)Cry1C基因的轉(zhuǎn)基因玉米C492為供體，通過(guò)回交轉(zhuǎn)育的方式將目標(biāo)基因分別導(dǎo)入不同遺傳背景的玉米自交系，獲得轉(zhuǎn)基因玉米自交系C492/N-76、C492/N202、C492/S273、C492/DH1901和C492/DH1904，采用室內(nèi)離體組織生測(cè)的方法研究各品系對(duì)玉米螟和草地貪夜蛾的抗蟲性。結(jié)果表明：轉(zhuǎn)基因玉米C492和5個(gè)不同遺傳背景自交系均表現(xiàn)出高抗玉米螟，雖對(duì)草地貪夜蛾的抗性有一定差異，但接蟲6 d后幼蟲死亡率均達(dá)到80%以上。這說(shuō)明轉(zhuǎn)基因玉米C492和5個(gè)不同遺傳背景自交系可用于抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米新品種培育，具有較好的商業(yè)化應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因玉米；亞洲玉米螟；草地貪夜蛾；回交轉(zhuǎn)育；室內(nèi)生測(cè)

中圖分類號(hào)：S513.034.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1006-060X（2024）02-0001-05

Insect Resistance Identification of Transgenic Maize with Cry1C Gene from

Different Genetic Backgrounds in Laboratory

ZENG Qiang1，ZHOU Wei2，GUO Huan-le1，CAO Zhong-yang1，PENG Ming1，

ZHOU Hong1，TANG Bin1，CHEN Zhi-hui1

（1. Hunan Crop Research Institute， Changsha 410125， PRC; 2. Agriculture and Rural Bureau of Wangcheng District，?Changsha 410203， PRC）

Abstract： The transgenic maize C492 carrying the Cry1C gene was used as the donor， and the target gene was introduced into inbred lines of maize with different genetic backgrounds by backcross breeding. The inbred lines of transgenic maize， namely C492/N-76， C492/N202， C492/S273， C492/DH1901， and C492/DH1904 were obtained. The insect resistance of the inbred lines to Ostrinia furnacalis and Spodoptera frugiperda was studied through in vitro tissue bioassay in the laboratory. The results show that transgenic maize C492 and the five inbred lines with different genetic backgrounds are highly resistant to O. furnacalis. Although there is a difference in their resistance to S. frugiperda， a larval mortality rate of over 80% can be achieved after insect infestation for six days. This indicates that transgenic maize C492 and the five inbred lines with different genetic backgrounds can be used for the breeding of new insect-resistant transgenic maize varieties and have good prospects for commercial application.

Key words： transgenic maize; Ostrinia furnacalis; Spodoptera frugiperda; backcross breeding; bioassay in laboratory

玉米作為我國(guó)三大糧食作物之一，是當(dāng)今世界重要的糧食作物，也是飼料工業(yè)和畜牧業(yè)的重要原料，玉米產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展對(duì)于保障我國(guó)糧食安全以及農(nóng)產(chǎn)品有效供給意義重大[1]。蟲害是影響玉米產(chǎn)量和品質(zhì)的主要因素，有效防治害蟲取食是實(shí)現(xiàn)玉米穩(wěn)產(chǎn)增產(chǎn)的重要環(huán)節(jié)。玉米螟是玉米生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的主要害蟲，在心葉期和穗期的危害較大，初孵幼蟲爬入心葉為害，葉片展開后，形成排孔，造成“花葉”，而穗期的初孵幼蟲主要蛀食莖稈、穗軸、雄穗，形成“隧道”，破壞植株養(yǎng)分和水分的運(yùn)輸，使莖稈容易折斷或倒伏[2]。草地貪夜蛾作為世界性的重大農(nóng)業(yè)害蟲，具有食性雜、食量大、暴發(fā)性和遷飛性等特點(diǎn)，其低齡幼蟲啃食玉米葉片可造成“窗孔”形癥狀，高齡幼蟲還可為害葉片、雄穗和果穗等部位，甚至造成玉米植株死亡。草地貪夜蛾2019年1月首次入侵我國(guó)，隨后迅速擴(kuò)散至20多個(gè)省份[3]，2022年我國(guó)草地貪夜蛾的發(fā)生面積達(dá)到4 000萬(wàn)hm2。

利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育具有抗蟲性狀的玉米被認(rèn)為是控制害蟲的有效途徑[4]，既可減少人工成本，又可降低對(duì)環(huán)境的影響，更重要的是，對(duì)非靶標(biāo)生物的風(fēng)險(xiǎn)降低[5]。Cry1C蛋白作為有效的Bt（Bacillus thuringiensis）轉(zhuǎn)基因蛋白之一，其蛋白質(zhì)的表達(dá)量和抗蟲性呈正相關(guān)，但在不同回交轉(zhuǎn)育品系中Bt蛋白的表達(dá)量同時(shí)受到多種因素的影響，例如：外源基因啟動(dòng)子的選擇、密碼子偏好性選擇、基因在基因組中的插入位置以及回交受體的遺傳背景等[6]。因此，研究不同遺傳背景下Bt轉(zhuǎn)基因抗蟲效果的穩(wěn)定性，對(duì)轉(zhuǎn)Bt抗蟲基因作物的推廣和應(yīng)用具有重要意義。

筆者以轉(zhuǎn)Cry1C基因玉米C492及其回交轉(zhuǎn)育獲得的5個(gè)轉(zhuǎn)基因玉米自交系為試驗(yàn)材料，采用室內(nèi)玉米離體組織生測(cè)的方法研究其對(duì)玉米螟和草地貪夜蛾的抗蟲效果，以期為抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米新品種選育和抗蟲防治提供可利用的種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試玉米品種：轉(zhuǎn)Cry1C基因的抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米C492（綜31背景），完成回交轉(zhuǎn)育的轉(zhuǎn)基因玉米自交系C492/N-76（PA亞群）、C492/N202（PB亞群）、C492/S273（蘇灣亞群）、C492/DH1901（溫?zé)岱N質(zhì)）和C492/DH1904（溫?zé)岱N質(zhì)），非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼衩诪榫C31（自330亞群）。所有試驗(yàn)材料均由湖南省作物研究所玉米研究室培育和保存。

試蟲材料：亞洲玉米螟和草地貪夜蛾的蟲卵均購(gòu)買自浩康生物科技有限公司。蟲卵置于人工氣候箱（28℃）孵化。所有初孵幼蟲作為供試蟲源用于室內(nèi)玉米離體組織生測(cè)試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

所有試驗(yàn)材料均種植于湖南省作物研究所轉(zhuǎn)基因育種溫室大棚，分小區(qū)種植，隨機(jī)排列，每個(gè)自交系種植4行，行長(zhǎng)為5 m，株距為0.2 m，行距為0.6 m。2023年4月25日播種，一次性施用宜施壯玉米配方肥（N–P2O5–K2O=24–7–7）750 kg/hm2作為底肥，其他管理同當(dāng)?shù)卮筇锷a(chǎn)。

1.3 室內(nèi)抗蟲性鑒定

取生長(zhǎng)至5～8葉期玉米植株地上部分帶回室內(nèi)，取幼嫩心葉，用消毒剪刀剪成2～3 cm大小，放在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，用毛筆輕挑玉米螟和草地貪夜蛾初孵幼蟲放于接蟲板中，每孔接1頭初孵幼蟲。每塊板為1次重復(fù)，每個(gè)處理設(shè)重復(fù)4次。接蟲后將培養(yǎng)板放置在溫度為28℃，光周期為16 h光照、8 h黑暗，相對(duì)濕度為70%～80% 的人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔天更換相同來(lái)源的新鮮組織，6 d后記錄死亡幼蟲數(shù)，并進(jìn)行拍照。以蟲體癱軟發(fā)黑，不能移動(dòng)判為死亡。死亡率=死亡幼蟲數(shù)/總幼蟲數(shù)×100%。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)匯總，利用SPSS 17.0軟件進(jìn)行方差分析，使用最小顯著差異（Least Significant Difference，LSD）方法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同轉(zhuǎn)基因玉米品種對(duì)玉米螟的抗性差異

為了比較轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米C492及其回交轉(zhuǎn)育獲得的5個(gè)轉(zhuǎn)基因玉米自交系對(duì)玉米螟抗性的差異，取5～8葉期玉米心葉進(jìn)行室內(nèi)玉米螟抗蟲性鑒定，接蟲6 d后統(tǒng)計(jì)玉米螟死亡情況。室內(nèi)玉米離體組織生測(cè)結(jié)果（圖1）表明，Bt基因在不同遺傳背景下對(duì)玉米螟的抗性存在顯著差異，但是轉(zhuǎn)基因玉米C492和5個(gè)轉(zhuǎn)基因自交系均表現(xiàn)出高殺蟲活性，供試玉米螟死亡率均在90%以上。

其中，C492，C492/DH1904，C492/S273，C492/N-76

在接蟲后第6天玉米螟死亡率都達(dá)到100%，蟲子體型較小且均已死亡，葉片未見明顯損傷（圖2B）；而非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼衩拙C31上玉米螟死亡率低于10%，蟲子體型明顯增加且可正?；顒?dòng)，葉片明顯被咬食（圖2A）。

2.2 不同轉(zhuǎn)基因玉米品種對(duì)草地貪夜蛾的抗性差異

進(jìn)一步比較轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米C492及其回交轉(zhuǎn)育獲得的5個(gè)轉(zhuǎn)基因玉米自交系對(duì)草地貪夜蛾抗性的差異，取5～8葉期玉米心葉進(jìn)行室內(nèi)草地貪夜蛾抗蟲性鑒定，接蟲6 d后統(tǒng)計(jì)草地貪夜蛾死亡情況。室內(nèi)玉米離體組織生測(cè)結(jié)果（圖3）表明，Bt基因在不同遺傳背景下對(duì)草地貪夜蛾的抗性存在顯著差異，但是轉(zhuǎn)基因玉米C492和5個(gè)自交系均表現(xiàn)出較高殺蟲活性，供試草地貪夜蛾死亡率均在80%以上。

其中，C492，C492/N202，C492/N-76的草地貪夜蛾死亡率在接蟲后第6天都達(dá)到了90%以上，

葉片上的蟲體大小相對(duì)較小，葉片未見明顯損傷（圖4B），而C492/DH1901和C492/DH1904對(duì)草地貪夜蛾的抗性相對(duì)較差；非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼衩拙C31上草地貪夜蛾死亡率均低于15%，葉片啃食嚴(yán)重，幾乎完全被啃食（圖4A）。

3 小結(jié)與討論

隨著生物工程技術(shù)的不斷發(fā)展，轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米商業(yè)化種植為控制害蟲危害和延緩害蟲抗性提供了新的技術(shù)途徑[7]。自1996年開始，轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米開始大規(guī)模商業(yè)化種植，目前已有200個(gè)以上具有抗蟲性狀的轉(zhuǎn)基因玉米轉(zhuǎn)化事件被批準(zhǔn)商業(yè)化生產(chǎn)[8]。在轉(zhuǎn)基因玉米產(chǎn)業(yè)化過(guò)程中，回交轉(zhuǎn)育是導(dǎo)入目標(biāo)基因最主要方法，因此，優(yōu)良的轉(zhuǎn)化體及其回交轉(zhuǎn)育育成的新材料都極為可貴。外源基因在不同回交轉(zhuǎn)育材料中是否能夠穩(wěn)定表達(dá)，仍然需要對(duì)不同轉(zhuǎn)化體和回交轉(zhuǎn)育材料進(jìn)行表型鑒定，積累更多更可靠的數(shù)據(jù)，為轉(zhuǎn)基因玉米產(chǎn)業(yè)化的安全應(yīng)用提供參考。Venkatesh等[9]分別將抗蟲玉米 MON 89034、抗旱玉米 MON 87460、耐草甘膦玉米NK603回交轉(zhuǎn)育至6個(gè)玉米自交系，通過(guò)全基因組序列分析發(fā)現(xiàn)不同自交系與受體親本基因型相似性為93.7%～99.35%。由此可見，通過(guò)回交轉(zhuǎn)育的方法可以在導(dǎo)入供體親本目標(biāo)基因的同時(shí)保持其他遺傳背景與受體親本基因型基本一致。該研究將轉(zhuǎn)Cry1C基因的抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米C492回交轉(zhuǎn)育到5個(gè)不同遺傳背景的自交系，這些材料適合研究不同遺傳背景對(duì)Bt基因抗蟲效果的影響。

轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米的目標(biāo)性狀是否突出，能否在大田生產(chǎn)中對(duì)靶標(biāo)害蟲產(chǎn)生殺蟲毒性，是評(píng)價(jià)其育種利用價(jià)值和商業(yè)化前景的關(guān)鍵。研究表明，Bt蛋白對(duì)鱗翅目害蟲具有較高的殺蟲毒性，美國(guó)孟山都公司育成的第一代Bt轉(zhuǎn)基因玉米Mon810對(duì)歐洲玉米螟和亞洲玉米螟表現(xiàn)出較高的田間抗蟲性[10]。張爽等[11]研究表明，轉(zhuǎn)基因玉米CM8101心葉、雌穗尖、雄穗、花絲及籽粒對(duì)玉米螟均表現(xiàn)出較高的抗性，各組織飼喂3 d后，玉米螟死亡率均達(dá)75%以上。

對(duì)已有抗蟲基因進(jìn)行改造，可以提高殺蟲毒性、延緩害蟲抗性。李國(guó)平等[12]研究發(fā)現(xiàn)，Cry1Ab、Cry1F、Vip3A和Cry2Ab蛋白對(duì)草地貪夜蛾都表現(xiàn)出明顯的致死作用。張丹丹等[13]發(fā)現(xiàn)，草地貪夜蛾取食轉(zhuǎn)Cry1Ab+Vip3Aa基因的玉米后，矯正死亡率為53.02%～100%。該研究以轉(zhuǎn)Cry1C基因的抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米C492為供體，通過(guò)回交轉(zhuǎn)育將抗蟲基因?qū)?個(gè)不同遺傳背景的自交系中，發(fā)現(xiàn)C492及其5個(gè)自交系均對(duì)玉米螟表現(xiàn)為高抗，飼喂6 d后玉米螟死亡率均達(dá)到90%以上，對(duì)草地貪夜蛾也表現(xiàn)出較高的抗性，飼喂6 d后草地貪夜蛾死亡率為80.21%～92.71%，說(shuō)明Cry1C基因在不同遺傳背景的自交系中均能穩(wěn)定遺傳和表達(dá)，但是不同轉(zhuǎn)Cry1C基因的自交系對(duì)玉米螟和草地貪夜蛾的抗性存在顯著差異。作為轉(zhuǎn)基因育種中間材料的C492/N-76和C492/N202均對(duì)玉米螟和草地貪夜蛾表現(xiàn)出良好的控制效果，為后續(xù)抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米新品種選育提供了重要基礎(chǔ)材料，將有助于穩(wěn)步、有序推進(jìn)湖南省轉(zhuǎn)基因玉米產(chǎn)業(yè)化研究的進(jìn)程。

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（責(zé)任編輯：張煥裕）