許騰 崔彥杰 李智偉 劉紅春 郝立君

(新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心,新疆 烏魯木齊 830001)

原發(fā)性免疫性血小板減少癥(Primary immune thrombocytopenia,ITP)是一種主要由免疫介導(dǎo)的血小板破壞和血小板生成障礙性疾病[1-2]。瘀點(diǎn)是ITP主要的臨床表現(xiàn),嚴(yán)重者可以出現(xiàn)內(nèi)臟甚至顱內(nèi)出血,出血的風(fēng)險(xiǎn)隨著年齡的增長(zhǎng)而增加[3]。ITP的發(fā)病機(jī)制,包括免疫、遺傳和環(huán)境因素等,體內(nèi)自身抗體和血小板抗原結(jié)合形成免疫復(fù)合物,單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的Fc受體與自身抗體的Fc段結(jié)合,介導(dǎo)巨噬細(xì)胞吞噬和血小板破壞是ITP的典型發(fā)病機(jī)制[4-5]。然而,越來越多的研究表明[6-8],調(diào)節(jié)性Treg細(xì)胞和Breg細(xì)胞的免疫缺陷(包括數(shù)量減少和/或免疫抑制功能減弱),可能是導(dǎo)致機(jī)體對(duì)血小板抗原失去免疫耐受性從而造成ITP的重要發(fā)病機(jī)制。

程序性細(xì)胞死亡蛋白-1(Programmed cell death receptor-1,PD-1)屬于CD28/B7家族,是一種重要的負(fù)調(diào)節(jié)因子,主要在活化的T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞、NK細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞(DC)和Treg細(xì)胞表面表達(dá)。程序性細(xì)胞死亡蛋白配體-1(Programmed cell death ligand 1,PD-L1)是PD-1的配體,主要在活化的Breg細(xì)胞上廣泛表達(dá),對(duì)抑制炎癥和預(yù)防自身免疫性疾病方面有重要作用[9]。而Treg細(xì)胞和Breg細(xì)胞均是具有獨(dú)特免疫調(diào)節(jié)作用的免疫細(xì)胞亞群,可通過分泌IL-4、IL-10及TGF-β等多種細(xì)胞因子,使ITP患者機(jī)體內(nèi)免疫系統(tǒng)發(fā)生平衡偏移,進(jìn)而促進(jìn)抑制性細(xì)胞因子的分泌等作用,維持外周免疫耐受,可參與多種變態(tài)反應(yīng)性疾病及腫瘤免疫的發(fā)病[10]。已知PD-1/PD-L1信號(hào)通路激活可以增加T細(xì)胞凋亡,抑制T細(xì)胞活化和增殖以維持免疫耐受。而在ITP患者中檢測(cè)出PD-1和PD-L1低表達(dá)[11]。因此,PD-1/PD-L1信號(hào)通路在ITP的發(fā)病機(jī)制中可能具有重要作用。本研究旨在探索ITP患者中PD-1和PD-L1表達(dá)特點(diǎn),以及PD-1/PD-L1信號(hào)通路調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞和Breg細(xì)胞的可能潛在機(jī)制,以期為ITP臨床治療方向提供有價(jià)值的參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年12月—2022年1月在我院治療的ITP患者106例作為觀察組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①診斷符合《成人原發(fā)免疫性血小板減少癥診斷與治療中國(guó)專家共識(shí)(2016年版)》[12]中的標(biāo)準(zhǔn)。②年齡≥18歲。③疾病分期均為新診斷ITP。④患者及家屬知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①入院前已接受過血小板輸注、丙種球蛋白、激素等治療。②合并有急慢性感染、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、惡性腫瘤等其他疾病。③繼發(fā)性血小板減少癥。同時(shí)選取同期健康志愿者100例作為對(duì)照組。

1.2 方法

采取ITP患者和健康人群空腹血7 mL,其中2 mL乙二胺四乙酸(EDTA)進(jìn)行抗凝,1 mL用于Breg細(xì)胞和Treg細(xì)胞檢測(cè),1 mL用于檢測(cè)PD-1、sPD-1和PD-L1,5 mL血2000 r/min低溫離心10 min,收集血清后立即儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱,用于檢測(cè)TGF-β、IL-4、IL-10和IL-17。

1.2.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Breg細(xì)胞和Treg細(xì)胞 Breg細(xì)胞檢測(cè)管吸取100 uL全血,然后依次加入FITC標(biāo)記的CD38、PE標(biāo)記的CD19和PerCP標(biāo)記的CD45各20 uL,APC標(biāo)記的CD245 uL。Treg細(xì)胞檢測(cè)管吸取100 uL全血,然后依次加入FITC標(biāo)記的CD4、PE標(biāo)記的CD127和PerCP標(biāo)記的CD3各20 uL,APC標(biāo)記的CD255 uL。將檢測(cè)管避光放置15 min后加入2 mL紅細(xì)胞裂解液,溶血10 min后離心去上清液,再加入2 mL磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌離心去上清液,加入500 uL PBS重懸。使用MACSQuant流式細(xì)胞儀(Miltenyi Biotec GmbH,Bergisch Gladbach,德國(guó))進(jìn)行檢測(cè),使用FlowJo10.5分析檢測(cè)數(shù)據(jù),計(jì)算Breg細(xì)胞占CD19+細(xì)胞的百分比和Treg細(xì)胞占CD4+細(xì)胞的百分比。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PD-1 使用APC標(biāo)記的CD3,Percp標(biāo)記的CD4,FITC標(biāo)記的CD8和PE標(biāo)記的PD-1單克隆抗體。對(duì)于PD-L1檢測(cè),使用PerCp標(biāo)記的CD11c,PE標(biāo)記的PD-L1和PE-cy7標(biāo)記的HLA-DR單克隆抗體。將樣品在室溫下在黑暗中孵育15 min,然后用PBS洗滌2次,重懸,并在MACSQuant流式細(xì)胞儀(Miltenyi Biotec GmbH,Bergisch Gladbach,德國(guó))上進(jìn)行分析。流式細(xì)胞儀提供的MACSQuant軟件用于數(shù)據(jù)分析。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (ELISA) 檢測(cè)sPD-1、TGF-β、IL-4、IL-10和IL-17 取出儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱的血樣本,將50 uL稀釋的標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測(cè)樣品依次加入每個(gè)孔中,然后加入50 uL生物素標(biāo)記的抗體。在37 ℃孵育1 h后,用磷酸鹽緩沖液吐溫-20(PBST)洗滌孔3次。之后,加入80 uL親和鏈霉素-HRP并在37 ℃下孵育30 min。用PBST洗滌3次后,將底物A和B各50 uL加入反應(yīng)孔中,并在37 ℃下孵育10 min。然后通過加入50 uL終止液停止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀測(cè)量OD 450值。sPD-1、TGF-β、IL-4、IL-10和IL-17抗體購(gòu)自abcam公司。酶標(biāo)儀為美國(guó)Molecu-lar公司SPECTCA MAX190。

1.3 病情程度判斷 輕度患者：血小板(PLT)≥50×109/L;中度患者：30×109/L≤PLT<50×109/L;重度患者：PLT<30×109/L[11]。本次研究ITP輕度患者32例,中度患者44例,重度患者30例。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較 兩組性別、年齡、BMI一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性見表1。

表1 兩組一般資料比較

2.2 兩組Treg細(xì)胞百分比、Breg細(xì)胞百分比等比較 觀察組Breg細(xì)胞百分比、Treg細(xì)胞百分比、TGF-b、IL-10和IL-4水平明顯低于對(duì)照組(P<0.05);觀察組Treg細(xì)胞表面PD-1陽(yáng)性率、Breg細(xì)胞表面PD-L1陽(yáng)性率、sPD-1和IL-17水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05);兩組sPD-L1水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 兩組Treg細(xì)胞百分比、Breg細(xì)胞百分比等比較

2.3 觀察組不同病情患者Treg細(xì)胞百分比、Breg細(xì)胞百分比等比較 觀察組重度患者Breg細(xì)胞百分比、Treg細(xì)胞百分比明顯低于輕度和中度患者(P<0.05),而Treg細(xì)胞表面PD-1陽(yáng)性率、Breg細(xì)胞表面PD-L1陽(yáng)性率明顯高于輕度和中度患者(P<0.05);觀察組中度患者Breg細(xì)胞百分比、Treg細(xì)胞百分比明顯低于輕度患者(P<0.05),而Treg細(xì)胞表面PD-1陽(yáng)性率、Breg細(xì)胞表面PD-L1陽(yáng)性率明顯高于輕度患者(P<0.05);觀察組不同病情患者TGF-β、sPD-1、sPD-L1、IL-10、IL-4和IL-17水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 觀察組不同病情患者Treg細(xì)胞百分比、Breg細(xì)胞百分比等比較

2.4 相關(guān)性分析 將Breg細(xì)胞百分比、Treg細(xì)胞百分比等指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)分析,結(jié)果顯示,Treg細(xì)胞表面PD-1陽(yáng)性率與Breg細(xì)胞表面PD-L1陽(yáng)性率呈正相關(guān)(r=0.466,P<0.05),見圖1。

圖1 相關(guān)分析圖

2.5 觀察組治療前后Treg細(xì)胞百分比、Breg細(xì)胞百分比等比較 與治療前相比,觀察組治療后Breg細(xì)胞百分比、Treg細(xì)胞百分比、TGF-β、IL-10和IL-4水平有所升高(P<0.05),而Treg細(xì)胞表面PD-1陽(yáng)性率、Breg細(xì)胞表面PD-L1陽(yáng)性率、sPD-1和IL-17水平有所降低(P<0.05),治療前后 sPD-L1水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 觀察組治療前后Treg細(xì)胞百分比、Breg細(xì)胞百分比等比較

3 討論

ITP的發(fā)病主要集中于歐美地區(qū),且可發(fā)生于任何年齡段,兒童期及老年期為ITP發(fā)病的高峰期[13]。ITP是由機(jī)體免疫失衡引起的自身免疫性疾病,包括免疫介導(dǎo)的血小板破壞,伴有不同程度的出血[14]。ITP的發(fā)生機(jī)制多樣復(fù)雜,涉及多個(gè)方面。在ITP的免疫發(fā)病機(jī)制中,T細(xì)胞仍處于中心階段,在抗血小板自身免疫的啟動(dòng)、傳遞和維持中起著重要作用[15]。T細(xì)胞需要雙信號(hào)才能激活：T細(xì)胞抗原受體特異性識(shí)別抗原呈遞細(xì)胞呈遞的抗原肽,并為T細(xì)胞活化提供第一信號(hào);然后,相應(yīng)的受體與抗原呈遞細(xì)胞上的共刺激分子結(jié)合,提供第二激活信號(hào)。此外,T細(xì)胞活化過程中還存在負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制,PD1/PD-L1通路即其中之一[16]。PD-1/PD-L1通路的慢性刺激可導(dǎo)致效應(yīng)T細(xì)胞耗竭和功能障礙,防止過度免疫損傷,對(duì)維持信號(hào)通路免疫穩(wěn)態(tài)起重要的調(diào)節(jié)作用[17]。PD-1/PD-L1信號(hào)通路在ITP、多發(fā)性硬化、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[18]。

Treg是CD4+T細(xì)胞的一個(gè)特殊亞群,可通過抑制免疫系統(tǒng)的激活,從而維持體內(nèi)平衡和對(duì)自身抗原的耐受性,并在多種自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用[19]。Breg細(xì)胞是一種特殊的B細(xì)胞亞群,可以促進(jìn)CD4+CD25-T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為Treg細(xì)胞,并促進(jìn)其分化[20]。Treg細(xì)胞和Breg細(xì)胞可以細(xì)胞之間的直接相互作用和細(xì)胞因子(如IL-10和TGF-β)的產(chǎn)生來抑制CD4+T細(xì)胞或CD8+T細(xì)胞的活化和增殖,并通過與效應(yīng)T細(xì)胞和單核細(xì)胞的直接相互作用發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[21-22]。免疫應(yīng)答失衡和免疫耐受性喪失,在ITP的發(fā)病機(jī)制中也起重要作用[23]。輔助性T細(xì)胞(Th)亞群協(xié)調(diào)不同的免疫應(yīng)答并介導(dǎo)不同細(xì)胞因子(IL-4)的活性,異常的Th細(xì)胞活性可能導(dǎo)致慢性炎癥和自身免疫性疾病[24]。本研究結(jié)果顯示,ITP患者治療后Breg細(xì)胞百分比、Treg細(xì)胞百分比、TGF-β、IL-10和IL-4水平均有所升高(P<0.05),提示Breg細(xì)胞、Treg細(xì)胞數(shù)量及其異常功能等細(xì)胞免疫紊亂是ITP的重要機(jī)制?？紤]Breg細(xì)胞、Treg細(xì)胞明顯減少,使得分泌IL-10和TGF-β減少,從而減弱了對(duì)CD4+T細(xì)胞或CD8+T細(xì)胞的活化和增殖的抑制作用,破壞了Th1/Th2和CD4+/CD8+平衡狀態(tài),同時(shí)減少了Treg細(xì)胞的產(chǎn)生,使機(jī)體免疫耐受機(jī)制減弱[25]。本研究發(fā)現(xiàn),觀察組Breg細(xì)胞百分比、Treg細(xì)胞百分比、TGF-β、IL-10和IL-4水平均明顯降低(P<0.05),且Breg細(xì)胞百分比、Treg細(xì)胞百分比的降低程度與ITP的嚴(yán)重程度呈正比(P<0.05)。

PD-1/PD-L1信號(hào)通路的激活抑制T細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子的產(chǎn)生,在調(diào)節(jié)免疫平衡和維持外周免疫耐受中起重要作用。PD-1和PD-L1有兩種形式,即分泌形式(sPD-1和sPD-L1)和膜結(jié)合形式[26]?？扇苄猿绦蛐约?xì)胞死亡蛋白-1(sPD-1)是通過細(xì)胞膜表面PD-1磷酸水解獲得的PD-1的可溶性形式,在免疫相關(guān)性疾病中高表達(dá),被認(rèn)為會(huì)阻斷PD-1/PD-L1信號(hào)通路[27]。而可溶性程序性細(xì)胞死亡蛋白配體-1(sPD-L1)可以通過保留IgV結(jié)構(gòu)域來刺激PD-1,并能促進(jìn)PD-1/PD-L1信號(hào)通路,從而抑制T細(xì)胞增殖和活化[28-29]。由Th17細(xì)胞分泌的IL-17,作用于不同的靶細(xì)胞,觸發(fā)炎癥介質(zhì)的釋放,介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、自身免疫性疾病、腫瘤、移植排斥反應(yīng)等疾病的發(fā)生[30-31]。本研究發(fā)現(xiàn),觀察組Treg細(xì)胞表面PD-1陽(yáng)性率、Breg細(xì)胞表面PD-L1陽(yáng)性率、sPD-1和IL-17水平均明顯升高(P<0.05),sPD-L1水平變化未見明顯差異(P>0.05)。Treg細(xì)胞表面PD-1陽(yáng)性率、Breg細(xì)胞表面PD-L1陽(yáng)性率與ITP的嚴(yán)重程度呈正比。Treg細(xì)胞表面PD-1陽(yáng)性率與Breg細(xì)胞表面PD-L1陽(yáng)性率呈正相關(guān)。ITP患者治療后Treg細(xì)胞表面PD-1陽(yáng)性率、Breg細(xì)胞表面PD-L1陽(yáng)性率、sPD-1和IL-17水平降低(P<0.05),治療前后sPD-L1水平變化未見明顯差異(P>0.05)。提示PD-1/PD-L1信號(hào)通路及免疫應(yīng)答失衡是ITP發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制。考慮sPD-1的產(chǎn)生增加,促進(jìn)了PD-1/PD-L1信號(hào)通路的阻斷。雖然Treg細(xì)胞和Breg細(xì)胞表面的PD-1/PD-L1陽(yáng)性率增加,但I(xiàn)L-17水平仍然升高,加強(qiáng)作用于不同的靶細(xì)胞,觸發(fā)炎癥介質(zhì)的釋放,因此PD-1/PD-L1通路被有效阻斷,使T細(xì)胞過度增殖活化和促進(jìn)細(xì)胞因子的產(chǎn)生,從而造成機(jī)體免疫耐受減弱和免疫應(yīng)答失衡。

4 結(jié)論

ITP患者Treg細(xì)胞表面PD-1和 Breg細(xì)胞表面PD-L1陽(yáng)性率明顯升高,與患者病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān),同時(shí)Treg細(xì)胞表面PD-1和 Breg細(xì)胞表面PD-L1表達(dá)之間存在相關(guān)性,可進(jìn)一步研究。