李慧 張吳霞 熊燁

(四川大學(xué)華西醫(yī)院1.層流研究病房;2.臨床試驗(yàn)中心;3.腫瘤科,四川 成都 610044)

多發(fā)性骨髓瘤是一種漿細(xì)胞異常增殖的惡性腫瘤,其主要特征為免疫失調(diào)、骨痛、骨損傷、腎功能衰竭、骨質(zhì)破壞、細(xì)菌性感染等[1-2]。多發(fā)性骨髓瘤是常見的血液系統(tǒng)腫瘤,約占所有惡性腫瘤的1%,約占所有血液系統(tǒng)惡性腫瘤的10%[3-4]。鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子10(KLF10)是KLFs家族的亞型之一,KLFs家族與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),例如前列腺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌等[5]。KLF10作為轉(zhuǎn)錄因子,調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄,細(xì)胞增殖、分化,細(xì)胞周期,在多種腫瘤中有重要作用[6]。目前為止,多項(xiàng)研究證實(shí)了微小RNA-21(miR-21)與多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)[7]。迄今,尚缺乏KLF10和miR-21共同在多發(fā)性骨髓瘤中的研究報(bào)道。因此,本研究通過測(cè)定KLF10和miR-21在多發(fā)性骨髓瘤患者血清中的表達(dá),探究其與預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院在2015年1月—2017年1月收治的多發(fā)性骨髓瘤患者126例作為觀察組,另選取同期在我院進(jìn)行健康體檢的健康者120例作為對(duì)照組。觀察組男性65例,女性61例,平均年齡為(60.50±10.52)歲;對(duì)照組男性59例,女性61例,平均年齡為(59.85±9.26)歲。收集受試者臨床資料,包括免疫球蛋白分型、Durie-Salmon(DS)分期、重度貧血、美國東部腫瘤協(xié)作組體力狀況(ECOG)評(píng)分、骨髓漿細(xì)胞比例等。納入標(biāo)準(zhǔn)：①診斷符合中國多發(fā)性骨髓瘤診斷指南(2022年修訂)[8]。②患者初次診斷為多發(fā)性骨髓瘤。③患者、家屬知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①已接受其他治療,例如免疫療法等。②患者伴有其他心血管、急慢性感染或者其他惡性腫瘤等。③患者伴有精神疾病,無法配合治療者。本研究通過我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 采集觀察組患者確診次日清晨空腹靜脈血和對(duì)照組體檢者當(dāng)日的空腹靜脈血5 mL,離心機(jī)以4000 r/min離心10 min,分離血清。血清保存在-80 ℃冰箱待測(cè)。

1.2.2 主要儀器和試劑 KLF10酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(貨號(hào)：XG-H95904)購自上海西格生物科技有限公司,TRIzol試劑(貨號(hào)：15596026)購自蘇州瑞諾德生物科技有限公司,反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào)：205311)購自蘇州瑞諾德生物科技有限公司,熒光定量PCR試劑盒(貨號(hào)：CR0222)購自賽爾瑞成(北京)生命科學(xué)技術(shù)有限公司,qRT-PCR儀(型號(hào)：MF048-s-01)購自廣州市智取生物科技有限公司。

1.2.3 ELISA檢測(cè)血清KLF10水平 采用KLF10 ELISA試劑盒檢測(cè)受試者血清KLF10水平,操作步驟嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.4 qRT-PCR檢測(cè)血清miR-21表達(dá)水平 使用TRIzol法提取血清中總RNA,采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA(反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：總RNA 2 μL、RNase Free dH2O(20 μL)、PrimeScript RT Master Mix(4 μL))后進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng),qRT-PCR檢測(cè)條件：95 ℃預(yù)變性5 min循環(huán)1次,95 ℃變性30 s、55 ℃退火45 s,75 ℃延伸15 s,共循環(huán)35次。以U6為內(nèi)源對(duì)照,以2-ΔΔCt的方法計(jì)算miR-21的表達(dá)水平。引物由上海烜雅生物科技有限公司合成,引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3 隨訪 對(duì)多發(fā)性骨髓瘤患者術(shù)后進(jìn)行為期5年的隨訪。隨訪方式為電話隨訪或復(fù)診,隨訪內(nèi)容為患者生存情況。隨訪終止時(shí)間為2022年1月,隨訪終點(diǎn)為患者死亡或到隨訪結(jié)束。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清KLF10、miR-21表達(dá)水平 觀察組血清KLF10水平低于對(duì)照組,血清miR-21水平高于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表2。

表2 兩組血清KLF10、miR-21表達(dá)水平

2.2 觀察組血清KLF10、miR-21表達(dá)相關(guān)性 Pearson分析顯示,觀察組血清KLF10與miR-21水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.447,P<0.05)。見圖1。

圖1 KLF10與miR-21表達(dá)相關(guān)性分析

2.3 血清KLF10、miR-21表達(dá)與多發(fā)性骨髓瘤患者臨床病理特征的關(guān)系 多發(fā)性骨髓瘤患者血清KLF10中位值為26.26 ng/mL,miR-21的中位值為1.34。KLF10≥26.26 ng/mL為高表達(dá),<26.26 ng/mL為低表達(dá);miR-21≥1.34為高表達(dá),<1.34為低表達(dá)。分析結(jié)果表明,多發(fā)性骨髓瘤患者血清KLF10、miR-21水平與患者性別、年齡、免疫球蛋白分型無關(guān)(P>0.05),與患者DS分期、是否重度貧血、ECOG評(píng)分以及骨髓漿細(xì)胞比例有關(guān)(P<0.05)。見表3。

表3 KLF10、miR-21水平與多發(fā)性骨髓瘤患者臨床病理特征的關(guān)系[n(×10-2)]

2.4 血清KLF10、miR-21水平與多發(fā)性骨髓瘤患者預(yù)后的關(guān)系 5年隨訪結(jié)果顯示,126例多發(fā)性骨髓瘤患者死亡49例,生存77例,總生存率為61.11%。

血清KLF10低表達(dá)組死亡33例(52.38%),生存30例(47.62%);血清KLF10高表達(dá)組死亡16例(25.40%),生存47例(74.60%)。血清miR-21低表達(dá)組死亡15例(23.81%),生存48例(76.19%);血清miR-21高表達(dá)組死亡34例(53.97%),生存29例(46.03%)。Kaplan-Meier生存曲線表明,多發(fā)性骨髓瘤患者血清KLF10低表達(dá)組生存率低于高表達(dá)組(χ2=9.651,P=0.032);血清miR-21高表達(dá)組生存率低于低表達(dá)組(χ2=12.056,P=0.0024)。見圖2。

圖2 Kaplan-Meier生存曲線分析KLF10、miR-21與多發(fā)性骨髓瘤患者預(yù)后的關(guān)系

2.5 Cox回歸分析影響多發(fā)性骨髓瘤患者預(yù)后的因素 以多發(fā)性骨髓瘤患者生存狀態(tài)為因變量(死亡=1,存活=0),以患者血清KLF10水平(低表達(dá)=1,高表達(dá)=0)、miR-21水平(高表達(dá)=1,低表達(dá)=0)、DS分期(Ⅲ期=1、Ⅰ～Ⅱ期=0)、是否重度貧血(有=1,無=0)、ECOG評(píng)分(>3分=1,≤3分=0)以及骨髓漿細(xì)胞比例(>30%=1,≤30%=0)為自變量進(jìn)行COX回歸分析。單因素COX回歸分析顯示,血清KLF10低表達(dá)、血清miR-21高表達(dá)、DS分期Ⅲ期、重度貧血、ECOG評(píng)分>3分和骨髓漿細(xì)胞比例>30%均為影響多發(fā)性骨髓瘤患者發(fā)生不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素(P<0.05)。多因素COX回歸分析結(jié)果顯示,血清KLF10低表達(dá)、血清miR-21高表達(dá)、DS分期Ⅲ期、重度貧血、ECOG評(píng)分>3分和骨髓漿細(xì)胞比例>30%是影響多發(fā)性骨髓瘤患者發(fā)生不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見表4。

表4 COX回歸分析影響多發(fā)性骨髓瘤患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素

3 討論

多發(fā)性骨髓瘤是一種骨髓漿細(xì)胞惡性增殖的血液系統(tǒng)惡性腫瘤,可引起多種臟器功能損傷[9-11]。多發(fā)性骨髓瘤的主要臨床癥狀為骨痛、骨質(zhì)疏松、貧血、感染、腎功能衰竭等[12-14]。隨著對(duì)多發(fā)性骨髓瘤的深入研究,以及治療策略改善、開發(fā)新藥等,多發(fā)性骨髓瘤患者生存期明顯提升,但由于其異質(zhì)性、耐藥性、易復(fù)發(fā)等特點(diǎn),目前其死亡率、復(fù)發(fā)率依然較高,且多發(fā)性骨髓瘤仍無法治愈,嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[15-16]。多發(fā)性骨髓瘤的具體發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚,可能與電離輻射、感染、遺傳因素等多種機(jī)制有關(guān)[17]。

KLFs家族有17種亞型,其成員的異常表達(dá)與多種實(shí)體瘤、血液瘤關(guān)系密切,參與了癌細(xì)胞的增殖、分化、侵襲、轉(zhuǎn)移等過程[18]。KLF10屬于KLFs家族,是一種腫瘤抑制因子,具有調(diào)節(jié)癌細(xì)胞增殖、凋亡和炎癥反應(yīng)等功能,在抑制癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡中起重要作用[19]。有研究表明,在多發(fā)性骨髓瘤中KLF10低表達(dá)[20]。Lin等[21]研究發(fā)現(xiàn),KLF10在胃癌中呈低表達(dá),可作為胃癌的獨(dú)立預(yù)后因素。Yeh等[22]最近研究發(fā)現(xiàn),KLF10在口腔鱗狀細(xì)胞癌中低表達(dá),可作為其獨(dú)立預(yù)后因素。miRNA是一類內(nèi)源性非編碼微小RNA,長(zhǎng)度在18～25個(gè)核苷酸,在機(jī)體組織分化、免疫及各種疾病的調(diào)控中具有重要作用[7]。miR-21是miRNA的一種,在多種生物學(xué)功能中發(fā)揮作用,例如免疫反應(yīng)、骨骼再生、成骨分化、癌癥等[23]。Handa等[24]研究發(fā)現(xiàn),多發(fā)性骨髓瘤外泌體中miR-21呈高表達(dá),促進(jìn)骨髓瘤細(xì)胞的發(fā)展。還有研究發(fā)現(xiàn),多發(fā)性骨髓瘤患者漿細(xì)胞中miR-21呈高表達(dá),促進(jìn)了腫瘤發(fā)展[25]。本研究結(jié)果顯示,觀察組血清KLF10水平低于對(duì)照組,血清miR-21水平高于對(duì)照組,提示二者參與了多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生發(fā)展過程。Pearson相關(guān)性分析顯示,觀察組血清KLF10與miR-21水平呈負(fù)相關(guān),提示miR-21可能通過負(fù)向調(diào)控KLF10的表達(dá)在多發(fā)性骨髓瘤中發(fā)揮作用。分析血清KLF10、miR-21水平與患者臨床病理特征的關(guān)系發(fā)現(xiàn),多發(fā)性骨髓瘤患者血清KLF10、miR-21水平均與患者DS分期、是否重度貧血、ECOG評(píng)分以及骨髓漿細(xì)胞比例有關(guān),進(jìn)一步提示二者與多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系,下一步可開展實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證二者關(guān)系,為多發(fā)性骨髓瘤的治療提供新思路。Kaplan-Meier生存曲線分析表明,多發(fā)性骨髓瘤患者血清KLF10低表達(dá)組生存率低于高表達(dá)組,血清miR-21高表達(dá)組生存率低于低表達(dá)組。多因素COX回歸分析顯示,血清KLF10低表達(dá)、血清miR-21高表達(dá)、DS分期Ⅲ期、重度貧血、ECOG評(píng)分>3分和骨髓漿細(xì)胞比例>30%是影響多發(fā)性骨髓瘤患者發(fā)生不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素,提示血清KLF10、miR-21表達(dá)具有評(píng)估多發(fā)性骨髓瘤患者預(yù)后的作用,臨床可通過監(jiān)測(cè)患者血清KLF10、miR-21水平,合理制定治療方案,提高患者生存期和生活質(zhì)量。

4 結(jié)論

多發(fā)性骨髓瘤患者血清KLF10表達(dá)下調(diào),miR-21表達(dá)上調(diào),二者表達(dá)水平與患者臨床病理特征相關(guān),且二者是多發(fā)性骨髓瘤患者發(fā)生不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素,與多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。后續(xù)研究將擴(kuò)大樣本量,深入探究二者相互作用關(guān)系以及多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)病機(jī)制,為臨床治療提供依據(jù)。