海樂(lè) 易必新 潘小紅

(1.湖南省藥品審核查驗(yàn)中心, 湖南 長(zhǎng)沙 410000;2.湖南省藥品檢驗(yàn)研究院, 湖南 長(zhǎng)沙 410000)

口腔頜面部惡性腫瘤占全身惡性腫瘤的3%～5%,組織病理學(xué)類(lèi)型多樣,以鱗狀細(xì)胞癌最多見(jiàn),屬于世界范圍內(nèi)第六大常見(jiàn)的惡性腫瘤,其發(fā)生與多種內(nèi)、外因素有關(guān),尤以吸煙、飲酒的危險(xiǎn)性最大[1]?？谇活M面部惡性腫瘤的治療以手術(shù)為主,但預(yù)后效果欠佳,復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率較高,放化療效果也不理想[2]。因此,尋找一種對(duì)腫瘤敏感性高、不良反應(yīng)少、療效好的藥物是亟待解決的問(wèn)題。一般認(rèn)為腫瘤的發(fā)生不僅與分化異常有關(guān),與細(xì)胞凋亡機(jī)制也有密切關(guān)系[3]。沒(méi)食子酸(Gallic acid,GA)是一類(lèi)多酚類(lèi)化合物[4],可通過(guò)阻滯細(xì)胞周期和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡在人腫瘤細(xì)胞系中發(fā)揮抗腫瘤作用,在藥理學(xué)方面具有安全性和高效性,已成為腫瘤預(yù)防及治療領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。迄今為止,GA對(duì)人口腔癌SCC-9細(xì)胞的影響少見(jiàn)報(bào)道,本研究觀察沒(méi)食子酸對(duì)SCC-9細(xì)胞增殖及凋亡的影響,探討其可能機(jī)制,為進(jìn)一步闡明沒(méi)食子酸的抗腫瘤機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 沒(méi)食子酸購(gòu)自Sigma公司,SCC-9人舌鱗癌細(xì)胞株來(lái)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所,噻唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自北京索來(lái)寶科技有限公司,膜聯(lián)蛋白V(Annxin V)/碘化丙錠(propidium iodide,PI)凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司,細(xì)胞裂解液和BCA蛋白含量測(cè)定試劑購(gòu)自江蘇碧云天公司,鼠抗人Cleaved-PARP、Cleaved-caspase9、Cleaved-caspase8和Cleaved-caspase3一抗購(gòu)自abcam公司,鼠抗人p-ERK1/2、p-JNK1/2和p-P38一抗購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將SCC-9人舌鱗癌細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基,置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng),收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞貼壁后,將細(xì)胞分為4組：對(duì)照組、低濃度沒(méi)食子酸組(30 μM GA組)、中濃度沒(méi)食子酸組(60 μM GA組)、高濃度沒(méi)食子酸組(90 μM GA組)。

1.3 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 將SCC-9細(xì)胞以密度為5×104個(gè)細(xì)胞/孔,接種于24孔培養(yǎng)板上過(guò)夜,加入含沒(méi)食子酸(0、30、60和90 μM)培養(yǎng)液37 ℃下分別培養(yǎng)24和48 h,然后按照MTT試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,并使用酶標(biāo)儀在563 nm處測(cè)量每個(gè)孔的吸光度。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)SCC-9細(xì)胞周期 SCC-9細(xì)胞同“1.3方法”接種在培養(yǎng)皿上,并與沒(méi)食子酸(30、60和90 μM)共孵育24 h,收集細(xì)胞、重懸,4 ℃固定24 h 后離心去除固定液,在室溫下加入嗅化乙錠(PI)溶液避光染色15 min,使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)SCC-9細(xì)胞凋亡率 將SCC-9細(xì)胞同“1.3方法”接種到24孔板,待細(xì)胞貼壁后將細(xì)胞分組,按照FITC Annexin V凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,SCC-9細(xì)胞加入5 μL FITC Annexin V和5 μL PI染色,混合液置于暗處室溫反應(yīng)15 min,然后加入400 μLAnnexin V-結(jié)合緩沖液重懸1 h后,采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞分析。

1.6 TUNEL法檢測(cè)SCC-9細(xì)胞凋亡 SCC-9細(xì)胞培養(yǎng)及分組同“1.3方法”,按照TUNEL法檢測(cè)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作,在37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后進(jìn)行檢測(cè),顯微鏡下觀察凋亡陽(yáng)性細(xì)胞。

1.7 Western blot檢測(cè)SCC-9細(xì)胞中Cleaved-caspase9、Cleaved-caspase8、Cleaved-caspase3、Cleaved-PARP、p-ERK1/2、p-JNK1/2和p-P38蛋白表達(dá) 收集各組SCC-9細(xì)胞,裂解后BCA試劑盒檢測(cè)總蛋白濃度。電泳分離,PVDF膜轉(zhuǎn)膜、封閉,加入一抗,4 ℃輕搖過(guò)夜,再加入HRP標(biāo)記的二抗孵育2 h、顯色,采用凝膠成像技術(shù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 沒(méi)食子酸抑制人口腔癌SCC-9細(xì)胞增殖 培養(yǎng)24、48 h后,與對(duì)照組比較,低、中和高濃度沒(méi)食子酸組SCC-9細(xì)胞增殖率逐漸下降,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),見(jiàn)圖1。

圖1 MTT檢測(cè)SCC-9細(xì)胞增殖

2.2 沒(méi)食子酸誘導(dǎo)人口腔癌SCC-9細(xì)胞sub G1細(xì)胞周期阻滯 使用流式細(xì)胞儀對(duì)碘化丙啶(PI)染色后的細(xì)胞進(jìn)行定量分析,與對(duì)照組比較,沒(méi)食子酸組SCC-9細(xì)胞的sub G1期DNA含量逐漸增加,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),見(jiàn)圖2。

圖2 沒(méi)食子酸對(duì)SCC-9細(xì)胞周期的影響

2.3 沒(méi)食子酸誘導(dǎo)SCC-9細(xì)胞凋亡 與對(duì)照組比較,低、中和高濃度沒(méi)食子酸組細(xì)胞晚期凋亡率逐漸增加,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),見(jiàn)圖3。

圖3 沒(méi)食子酸對(duì)SCC-9細(xì)胞凋亡的影響

2.4 4組SCC-9細(xì)胞凋亡情況比較 與對(duì)照組比較,低、中和高濃度沒(méi)食子酸組陽(yáng)性細(xì)胞凋亡數(shù)逐漸增加,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),見(jiàn)圖4。

圖4 TUNEL法檢測(cè)各組SCC-9細(xì)胞凋亡

2.5 沒(méi)食子酸誘導(dǎo)SCC-9細(xì)胞中Caspase活化及PARP的裂解 與對(duì)照組比較,中、高濃度食子酸組SCC-9細(xì)胞中Cleaved-caspase9、Cleaved-caspase8、Cleaved-caspase3和Cleaved-PARP蛋白表達(dá)增加,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),見(jiàn)圖5A。與對(duì)照組比較,低、中和高濃度沒(méi)食子酸組SCC-9細(xì)胞中p-ERK1/2、p-JNK1/2和p-P38蛋白表達(dá)增加,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),見(jiàn)圖5B。

圖5 沒(méi)食子酸對(duì)SCC-9細(xì)胞中凋亡及MAPK信號(hào)通路的影響

3 討論

細(xì)胞凋亡是由基因控制的細(xì)胞自主、有序死亡,也是機(jī)體清除不必要受損細(xì)胞的一種病理生理過(guò)程[5-6],因此凋亡可作為腫瘤治療的一種治療策略。沒(méi)食子酸(GA)是一種天然多酚類(lèi)化合物,具有多種生物學(xué)活性,如抗炎、抗氧化等作用[7],還能選擇性抑制腫瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡[8]。但目前關(guān)于GA對(duì)口腔癌作用的具體機(jī)制尚不完全清楚,并且缺乏多種藥理作用之間相關(guān)性研究。

本研究MTT檢測(cè)結(jié)果顯示,相同作用時(shí)間下,隨著GA濃度增加,SCC-9細(xì)胞的增殖率逐漸下降,具有藥物濃度相關(guān)性;而相同作用濃度下,48 h作用時(shí)間的SCC-9細(xì)胞增殖率低于24 h,說(shuō)明其抑制效果具有時(shí)間相關(guān)性。流式細(xì)胞儀和TUNEL檢測(cè)結(jié)果提示,GA參與了細(xì)胞凋亡調(diào)控,藥物濃度的增加能誘導(dǎo)SCC-9細(xì)胞sub、G1細(xì)胞周期阻滯,從而晚期凋亡率逐漸增加、抑制其增殖,且凋亡具有濃度依賴(lài)性。

Caspases蛋白酶激活級(jí)聯(lián)反應(yīng)在凋亡各個(gè)階段發(fā)揮重要作用[9]。細(xì)胞內(nèi)凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)涉及兩條基本途徑：外源性通路和內(nèi)源性通路[10]。外源性凋亡信號(hào)可誘導(dǎo)形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物,激活細(xì)胞膜近端的Caspase-8等,然后剪切活化執(zhí)行型Caspase(如Caspase-3),同時(shí)活化的Caspase-8還可以剪切活化PARP,進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11];內(nèi)源性通路也稱(chēng)為線粒體途徑,線粒體膜電位變化和線粒體內(nèi)外膜通透性增加引導(dǎo)釋放細(xì)胞色素C,隨后與胞漿中的凋亡蛋白酶激活因子-1(Apaf-1)結(jié)合,激活Caspase-9,啟動(dòng)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng),誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]。PARP是真核細(xì)胞中的DNA修復(fù)酶,可識(shí)別結(jié)構(gòu)損傷的片段DNA[13]。Caspase-3一旦被激活,即可誘導(dǎo)PARP發(fā)生斷裂,使細(xì)胞進(jìn)入凋亡途徑[14]。Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組比較,中、高濃度沒(méi)食子酸組SCC-9細(xì)胞中Cleaved-caspase9、Cleaved-caspase8、Cleaved-caspase3和Cleaved-PARP蛋白表達(dá)增加,提示沒(méi)食子酸可能通過(guò)細(xì)胞外傳導(dǎo)途徑活化Caspase-8,進(jìn)一步激活下游效應(yīng)因子Caspase-3,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;沒(méi)食子酸還可能通過(guò)線粒體途徑,促進(jìn)凋亡刺激因子與Apaf-1形成多聚復(fù)合物,激活Caspase-9,進(jìn)而激活下游的 Caspase-3,誘導(dǎo)PARP發(fā)生剪切,進(jìn)入凋亡途徑。

MAPK是一絲席氨酸蛋白激酶家族,p38、ERK 1/2、JNK是MAPK家族的主要成員,其中JNK、p38 MAPK 信號(hào)通路活化與細(xì)胞凋亡有關(guān)[15]。研究表明,活化的MAPK通過(guò)級(jí)聯(lián)反應(yīng)將外界信號(hào)傳遞給細(xì)胞核,調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、遷移、分化和凋亡[16-17]。文獻(xiàn)報(bào)道[18],人肝癌和早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞中,甘草黃酮通過(guò)JNK1/2途徑激活Caspase-9、Caspase-8和Caspase-3導(dǎo)致細(xì)胞凋亡;ERK 1/2級(jí)聯(lián)是一種經(jīng)典的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路,ERKl/2磷酸化是功能活動(dòng)的標(biāo)志,能介導(dǎo)細(xì)胞的增殖、分化和死亡多種病理生理過(guò)程[19-20]。Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),沒(méi)食子酸組p-ERK1/2、p-JNK1/2和p-P38蛋白表達(dá)較對(duì)照組逐漸增加(P<0.05),提示沒(méi)食子酸可能通過(guò)磷酸化JNK、p38、ERK1/2途徑激活下游信號(hào)因子Caspase-9、Caspase-8和Caspase-3,發(fā)揮促進(jìn)SCC-9細(xì)胞凋亡、抑制其增殖的作用,這與本研究MTT結(jié)果基本一致。

4 結(jié)論

沒(méi)食子酸具有抑制SCC-9細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡作用,這與其可以通過(guò)激活MAPK/ERK信號(hào)通路,活化下游Caspase信號(hào)因子,誘導(dǎo)PARP發(fā)生斷裂,促使細(xì)胞進(jìn)入凋亡途徑有關(guān),提示沒(méi)食子酸可作為一種潛在的口腔癌治療劑。