楊錢冬，周江玲，楊明，侯天勇

核酸適配體是經(jīng)指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX）技術(shù)篩選得到的短的單鏈寡核苷酸（DNA 或RNA）分子，是由20～110 個(gè)核苷酸構(gòu)成的具有多樣性的隨機(jī)序列和特殊固定序列，其通過(guò)折疊可以形成具有三級(jí)結(jié)構(gòu)的、高親和力的、能特異性結(jié)合靶分子的小分子基團(tuán)[1-2]。目前，核酸適配體已被廣泛應(yīng)用于食品安全保障和環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域[3-6]。與抗體相比，核酸適配體具有生產(chǎn)時(shí)間更短、制造成本更低、可修飾性更高、熱穩(wěn)定性更好等優(yōu)點(diǎn)[7]，并且因其對(duì)目標(biāo)細(xì)胞的高度特異性，在骨科領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。本文對(duì)核酸適配體的基本概念及其在骨科領(lǐng)域的應(yīng)用研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 核酸適配體應(yīng)用現(xiàn)狀

1.1 核酸適配體的篩選及合成

SELEX 技術(shù)是一種生成核酸適配體的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，其基本思想是在體外通過(guò)化學(xué)方法，合成一個(gè)單鏈寡核苷酸池，即SELEX文庫(kù)，然后將感興趣的靶向分子放入含有1014～1016個(gè)單鏈隨機(jī)寡核苷酸池（SELEX 文庫(kù)中的隨機(jī)寡核苷酸通常由40～100 個(gè)核苷酸基團(tuán)組成）進(jìn)行孵育。隨后，首先用磷酸緩沖生理鹽水（phosphate buffer saline, PBS）或去離子水直接沖刷，將未與靶向分子結(jié)合的寡核苷酸分離，再用高鹽溶液（可改變與靶分子結(jié)合的核酸適配體的構(gòu)象使其分離）洗脫得到能結(jié)合目標(biāo)物的寡核苷酸，并將結(jié)合目標(biāo)物的寡核苷酸通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction, PCR）擴(kuò)增，進(jìn)行下一輪的篩選。采用上述方法重復(fù)進(jìn)行幾輪篩選，將能與靶向分子特異性結(jié)合的核苷酸片段從之前生成的非常大的隨機(jī)核苷酸文庫(kù)中分離出來(lái)，且特異性隨著SELEX 過(guò)程的重復(fù)而增高[7]。除用于DNA 核酸適配體的篩選外，SELEX 技術(shù)同樣可用于RNA 核酸適配體的篩選，但篩選RNA 核酸適配體與DNA 核酸適配體的SELEX 技術(shù)有一定差異，在目標(biāo)為篩選RNA 核酸適配體的情況下，首先必須將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成雙鏈DNA，再進(jìn)行SELEX 技術(shù)的操作[3-5]。DNA 核酸適配體與RNA 核酸適配體具有各自的優(yōu)勢(shì)：相較于RNA核酸適配體，DNA 核酸適配體本身更穩(wěn)定，相關(guān)的制造成本也更低[8-9]；而RNA 核酸適配體通常具有更多樣化的三維構(gòu)象和更強(qiáng)的鏈內(nèi)基團(tuán)相互作用，可能會(huì)增加核酸適配體的親和力和特異性。有研究報(bào)道，部分RNA 核酸適配體-靶標(biāo)復(fù)合物的解離常數(shù)（Kd 值）可達(dá)到皮摩爾級(jí)，顯示出了核酸適配體與靶分子的親和力優(yōu)于抗體與抗原之間的作用力[10]。

對(duì)于核酸適配體的篩選，由于SELEX 技術(shù)本身需要構(gòu)建數(shù)量巨大的單鏈隨機(jī)寡核苷酸池，如果重復(fù)次數(shù)不夠?qū)⒃斐珊怂徇m配體親和力和特異性低等問(wèn)題。因此，提高SELEX 技術(shù)的成功率和特異性對(duì)推廣其應(yīng)用來(lái)說(shuō)至關(guān)重要。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)了一系列對(duì)傳統(tǒng)SELEX技術(shù)的改進(jìn)，包括改變結(jié)合的條件和進(jìn)行篩選的平臺(tái)、靶類型、文庫(kù)設(shè)計(jì)和固定基質(zhì)，其衍生出的一系列技術(shù)包括免疫沉淀耦合的SELEX（immunoprecipitation-SELEX,IP-SELEX）、細(xì)胞捕獲的SELEX（cell-SELEX）、毛細(xì)管電泳的SELEX（capillary electrophoresis-SELEX,CE-SELEX）、原子力顯微鏡的SELEX（atomic force microscope-SELEX, AFM-SELEX）和人工擴(kuò)大遺傳信息系統(tǒng)的SELEX（aegis-SELEX）等來(lái)提高SELEX技術(shù)的成功率[11-13]。但是，上述技術(shù)對(duì)操作人員的技術(shù)要求較高，學(xué)習(xí)曲線較長(zhǎng)，在一定程度上限制了新型核酸適配體的開(kāi)發(fā)及其在各領(lǐng)域的應(yīng)用。

在通過(guò)SELEX 技術(shù)篩選得到目標(biāo)核苷酸序列后，即可通過(guò)生物合成方法或化學(xué)合成方法合成目標(biāo)核苷酸序列?；瘜W(xué)合成方法是在體外通過(guò)一系列化學(xué)反應(yīng)將核酸適配體的單元（核苷酸）連接起來(lái)，通常采用固相合成技術(shù)；生物合成方法是通過(guò)生物體內(nèi)的酶催化反應(yīng)將核酸適配體的單元連接起來(lái)，通常采用核酸酶反應(yīng)[4-7]。

1.2 核酸適配體的特點(diǎn)

與抗體相對(duì)較大的體積（150～180 kDa，15 nm）相比，核酸適配體具有體積較?。?～30 kDa，2 nm）和更加靈活的特點(diǎn)，可以結(jié)合相對(duì)較小的靶向分子或細(xì)胞[14]。同時(shí)，由于抗體體積較大，在其需要穿透組織發(fā)揮作用時(shí)，可能表現(xiàn)出更多的局限性，特別是在腫瘤的靶向治療中，可能會(huì)由于其較大的體積影響治療效果[15]。但核酸適配體由于體積較小，存在更加容易被腎臟過(guò)濾及在體內(nèi)循環(huán)時(shí)間較短等缺點(diǎn)。有研究表明，可以通過(guò)合理的化學(xué)修飾改變其藥代動(dòng)力學(xué)特征，延長(zhǎng)其在體內(nèi)的半衰期，避免其在體內(nèi)代謝較快這一缺陷[16]。相較于抗體較長(zhǎng)的合成周期及較高的合成費(fèi)用，核酸適配體在幾天內(nèi)就可以完成合成，且費(fèi)用較低，并且核酸適配體的篩選及制備過(guò)程完全是在體外進(jìn)行的，僅依賴于化學(xué)合成過(guò)程，污染風(fēng)險(xiǎn)較低[4-7]。除此之外，核酸適配體最大的優(yōu)勢(shì)在于其不具備免疫原性，所以不會(huì)像抗體一樣造成免疫排斥反應(yīng)[17]（表1）。

表1 核酸適配體與抗體特性比較

1.3 核酸適配體的應(yīng)用

1.3.1 再生醫(yī)學(xué)

再生醫(yī)學(xué)的主要原理之一在于干細(xì)胞技術(shù)的合理應(yīng)用[18]。干細(xì)胞理論上可以無(wú)限分裂和增殖，廣泛存在于各種組織中，具有在特定環(huán)境刺激下衍生和分化成各種類型細(xì)胞的潛力。基于這一原理，再生醫(yī)學(xué)在組織與器官修復(fù)和再生方面取得了一定成果，但如何高效地獲得存活率較高的目標(biāo)干細(xì)胞[19]及整個(gè)技術(shù)流程較高的生產(chǎn)成本等問(wèn)題對(duì)其推廣應(yīng)用造成一定的限制。核酸適配體作為一種新的細(xì)胞分選工具和一種新的細(xì)胞趨化劑和誘捕劑，與傳統(tǒng)的以活性蛋白分子（抗體等）為代表的再生因子相比，具有更高效的細(xì)胞分選效率和更好的體內(nèi)適應(yīng)性[20-21]，可以在組織損傷部位特異性捕獲和募集內(nèi)源性干細(xì)胞，從而促進(jìn)組織的再生和修復(fù)。盡管目前已有大量研究報(bào)道證實(shí)了核酸適配體在再生醫(yī)學(xué)的組織和器官修復(fù)應(yīng)用的優(yōu)勢(shì)[15]，但還沒(méi)有關(guān)于人體試驗(yàn)的報(bào)道。在應(yīng)用于人體之前，研究者們還需要在成本控制、提高篩選效率等方面深入探討，以更好地推進(jìn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人體試驗(yàn)[22]。

1.3.2 靶向藥物治療

研究報(bào)道，以核酸適配體-藥物偶聯(lián)物（aptamerdrug conjugates, ApDCs）形式的靶向藥物可以發(fā)揮治療作用，典型的ApDCs 由三部分組成：核酸適配體、藥物和中間的連接體，目前有一部分ApDCs 已經(jīng)被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration, FDA）批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床[23-24]。與傳統(tǒng)的抗體- 藥物偶聯(lián)物（antibody-drug conjugates,ADCs）[25]相比，ApDCs 具有多種潛在優(yōu)勢(shì)：一方面，核酸適配體可以通過(guò)分子層面上的化學(xué)修飾，與發(fā)揮治療作用的藥物進(jìn)行更加牢固的生物偶聯(lián)；另一方面，ApDCs 分子量相對(duì)較小，因此具備更快、更深的組織滲透能力。此外，通過(guò)將納米技術(shù)引入ApDCs 可以提高載藥能力和被動(dòng)給藥效率，進(jìn)一步推動(dòng)ApDCs的發(fā)展。

盡管已有獲批的藥物用于臨床治療[26-30]，但在核酸適配體靶向藥物治療方面，從基礎(chǔ)向臨床的轉(zhuǎn)化仍然是目前面臨的巨大問(wèn)題。此外，如何進(jìn)一步優(yōu)化核酸適配體-藥物的生物偶聯(lián)及其適用性和毒理學(xué)方面的問(wèn)題仍需進(jìn)一步研究[31]。

1.3.3 疾病診斷

近年來(lái)，由于核酸適配體的各種優(yōu)勢(shì)，大量含有特定功能的核酸適配體被用于設(shè)計(jì)新的生物傳感器，用于各種病原微生物或疾病的早期診斷[32]。迄今為止開(kāi)發(fā)的基于核酸適配體的診斷型生物傳感器根據(jù)其檢測(cè)的目標(biāo)致病性分析物可分為兩類，其中包括針對(duì)致病性毒素或蛋白質(zhì)的一類大分子物質(zhì)，以及針對(duì)致病性細(xì)胞和核酸等的一系列小分子物質(zhì)；可早期診斷的疾病包括獲得性免疫缺陷綜合征[33]、新型冠狀病毒肺炎及一系列特異性微生物感染疾病等[34]。然而，由于SELEX 技術(shù)過(guò)于繁瑣的流程及較高的失敗率限制了其應(yīng)用，目前需解決的主要問(wèn)題是擴(kuò)大覆蓋更多病原體的核酸適配體庫(kù)[33,35]，再與生物傳感技術(shù)聯(lián)用，用于提高疾病的早期診斷率，有可能進(jìn)一步減輕疾病對(duì)患者造成的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

但相對(duì)于傳統(tǒng)檢測(cè)手段，基于核酸適配體的新型檢測(cè)生物傳感器的研究仍處于早期階段，其敏感性和安全性仍需進(jìn)一步的驗(yàn)證，并且其昂貴的造價(jià)及較短的保存周期是目前亟需解決的問(wèn)題[32]。

2 核酸適配體在骨科領(lǐng)域的應(yīng)用前景

2.1 骨與軟骨組織再生

核酸適配體對(duì)目標(biāo)干細(xì)胞有特異性捕獲能力，其在骨科修復(fù)領(lǐng)域有著較大的應(yīng)用前景。Wang等[36]通過(guò)SELEX 技術(shù)，以人胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell, ESC）為靶向分子，篩選出了一種對(duì)ESC 具有特異性捕獲能力的核酸適配體HM69，并將HM69 與納米材料通過(guò)化學(xué)連接的方法進(jìn)行結(jié)合，研究結(jié)果表明，功能化的納米顆粒材料在體內(nèi)外表現(xiàn)出募集間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell, MSC）的能力，并在大鼠模型中獲得了更好的骨缺損修復(fù)結(jié)果。Yang等[20]將核酸適配體HM69 與脫細(xì)胞軟骨細(xì)胞外基質(zhì)連接，并與富含轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β3（transforming growth factor β3, TGF-β3）的甲基丙烯酸明膠混合制成生物墨水，添加于3D 打印技術(shù)制成的聚己內(nèi)酯（polycaprolactone, PCL），構(gòu)建了一種新型的軟骨修復(fù)材料，進(jìn)一步證實(shí)了核酸適配體HM69對(duì)脂肪干細(xì)胞（adipose-derived stem cell, ADSC）的特異性捕獲和募集作用，能夠在缺損原位促進(jìn)軟骨的修復(fù)。隨后Li等[37]將另一種對(duì)人MSC 有特異性捕獲作用的核酸適配體Apt19s 與脫細(xì)胞半月板細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合，同時(shí)與甲基丙烯酸酯明膠混合，并添加納米粒子，構(gòu)建了一種可促進(jìn)半月板再生的新型材料，同樣在兔的半月板缺損模型上得到了驗(yàn)證。Sun 等[38]和Yao 等[39]同樣利用核酸適配體Apt19s 證明了與核酸適配體結(jié)合的原位支架材料對(duì)骨缺損修復(fù)的促進(jìn)作用，其連接的材料分別為連接了人胎盤生長(zhǎng)因子2 氨基酸123～144 肽段的PCL 和脫鈣骨基質(zhì)（decalcified bone matrix, DBM）。此外，在骨缺損的治療過(guò)程中，能夠向細(xì)胞傳遞氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的功能性血管再生是影響體內(nèi)植入后存活率的最關(guān)鍵因素[40]，因此，內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells, EPC）與MSC 聯(lián)用已是目前骨修復(fù)領(lǐng)域的全新熱點(diǎn)[41]。Qi 等[42]的研究證實(shí)了一種對(duì)EPC 有特異性捕獲能力的核酸適配體，可與聚合烯丙胺涂層結(jié)合，用于促進(jìn)血管的再生和目標(biāo)部位的血運(yùn)重建。

綜上所述，只要在適當(dāng)?shù)臈l件下，對(duì)干細(xì)胞有較高特異性識(shí)別能力的核酸適配體與各種所需的支架材料相結(jié)合[43]（文獻(xiàn)報(bào)道均為化學(xué)鍵相連接），并加以相應(yīng)的修飾，在骨科修復(fù)重建領(lǐng)域具有較大的應(yīng)用潛力，可實(shí)現(xiàn)具有選擇性的、定向捕獲新材料的構(gòu)建。值得注意的是，上述研究均未對(duì)核酸適配體進(jìn)行作用機(jī)制上的探討及研究。目前，由于臨床上醫(yī)學(xué)倫理問(wèn)題的限制及核酸適配體成骨、成血管機(jī)制尚不明確，因此尚未應(yīng)用于臨床。

2.2 骨腫瘤疾病的診治

骨組織是腫瘤的常見(jiàn)好發(fā)部位，按發(fā)病機(jī)制可分為原發(fā)性骨腫瘤和繼發(fā)性轉(zhuǎn)移骨腫瘤[44]，目前核酸適配體對(duì)骨腫瘤的治療應(yīng)用較少，但一些研究報(bào)道了其在骨腫瘤疾病診治領(lǐng)域的良好效果。Hao等[45]研究報(bào)道了一種靶向針對(duì)前列腺癌細(xì)胞的核酸適配體APT A10-3.2，其在轉(zhuǎn)移骨腫瘤小鼠模型中表現(xiàn)出了良好的腫瘤細(xì)胞殺傷效果，可達(dá)到抑制繼發(fā)性轉(zhuǎn)移骨腫瘤的目的。而在原發(fā)性骨腫瘤方面，Wang 等[46]報(bào)道的一種新型核酸適配體LP-16 可以特異性結(jié)合骨肉瘤細(xì)胞，對(duì)骨肉瘤的早期診斷有較大的意義。

目前核酸適配體在骨腫瘤領(lǐng)域應(yīng)用較少，未來(lái)的研究可以將特異性治療骨腫瘤的藥物與核酸適配體結(jié)合，達(dá)到精準(zhǔn)靶向治療的目的。

3 總結(jié)

核酸適配體具有合成成本相對(duì)較低、熱穩(wěn)定性更高及不具備免疫原性等優(yōu)點(diǎn)。在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域方面，核酸適配體表現(xiàn)出對(duì)干細(xì)胞的特異性捕獲和識(shí)別能力，在組織再生方面具有良好的應(yīng)用前景。作為靶向藥物時(shí)，核酸適配體可提高藥物對(duì)有害細(xì)胞或組織的特異性。作為早期診斷手段，核酸適配體可以與生物傳感器相結(jié)合，提高檢測(cè)效力。目前，核酸適配體在骨科領(lǐng)域的應(yīng)用較少，主要應(yīng)用于骨與軟骨再生和骨腫瘤疾病的診治。SELEX 技術(shù)繁瑣的流程及較高的失敗率嚴(yán)重限制了核酸適配體的臨床應(yīng)用，未來(lái)對(duì)核酸適配體的研究重點(diǎn)在于如何進(jìn)一步簡(jiǎn)化新型核酸適配體的篩選流程，以及如何提高其對(duì)特異性細(xì)胞識(shí)別的親和力和靶向性。在骨科領(lǐng)域，如何發(fā)揮核酸適配體特異性識(shí)別、募集目標(biāo)細(xì)胞的能力，如何通過(guò)特異性識(shí)別目標(biāo)細(xì)胞表面的分子信號(hào)實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的特異性刺激，如何促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化，并探索其作用的具體機(jī)制，以進(jìn)一步推動(dòng)核酸適配體從基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)到臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化。

【利益沖突】所有作者均聲明不存在利益沖突