田亮亮， 南欣榮，2

1.山西醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院·口腔醫(yī)院, 山西 太原（030001）； 2.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院口腔頜面外科， 山西 太原（030001）

口腔癌是常見的惡性腫瘤，主要為原發(fā)于舌、頰、牙齦、硬腭、口底等部位的鱗狀細(xì)胞癌（squamous cell carcinoma，SCC）。由于早期口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）癥狀并不明顯，不少患者就診時已達(dá)臨床Ⅲ/Ⅳ期，導(dǎo)致較差的臨床轉(zhuǎn)歸。盡管眾多學(xué)者致力于提高晚期OSCC患者的生存率，但是OSCC 患者5 年生存率仍在50% ～ 60%。研究發(fā)現(xiàn)，90%的頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）中存在表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）的過表達(dá)［1］，EGFR 被激活后，可調(diào)節(jié)相關(guān)下游信號通路，通過激活轉(zhuǎn)錄因子和上調(diào)重要癌基因來刺激腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展［2］。尼妥珠單抗是靶向EGFR 的單克隆抗體，Patil等［3］研究指出，尼妥珠單抗聯(lián)合化療可以在不增加毒副反應(yīng)的基礎(chǔ)上表現(xiàn)出較好的腫瘤反應(yīng)率。臨床實踐表明，治療效果對預(yù)后影響較大，新輔助化療（neoadjuvant chemotherapy，NAC）作為OSCC 患者的重要治療方案，可提高手術(shù)切除率，對改善預(yù)后有重要意義［4］。

炎癥在腫瘤微環(huán)境中具有重要作用，可促進(jìn)腫瘤的發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移，并且與預(yù)后不良相關(guān)［5］。Ram 等［6］研究表明，血液學(xué)炎癥指標(biāo)，如中性粒細(xì)胞/淋 巴細(xì)胞比值（neutrophil to lymphocyte ratio，NLR）對OSCC 的預(yù)后判斷具有重要意義。Yang等［7］Meta 分析表明，高NLR 與OSCC 的不良臨床病理特征、較差的生存期相關(guān)。盡管有眾多學(xué)者研究外周血炎癥指標(biāo)與OSCC 的關(guān)系，但其與OSCC術(shù)前尼妥珠單抗聯(lián)合新輔助化療療效之間的關(guān)系目前尚無明確定論。本研究探討外周血NLR 對局晚期OSCC 患者采用尼妥珠單抗聯(lián)合新輔助化療療效的影響，為臨床提供參考。

1 資料和方法

1.1 一般資料

本研究通過山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院倫理委員會審批（［2020］倫審字（K065）號），獲得患者知情同意。收集 2020 年9 月至2023 年6 月山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院收治的局晚期OSCC 患者59 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①病理診斷均為鱗狀細(xì)胞癌，臨床分期為Ⅲ、Ⅳ期的初診病例；②所有病例均接受尼妥珠單抗聯(lián)合術(shù)前新輔助化療；③化療后再次完善影像學(xué)檢查，評估療效及行根治性手術(shù)；④患者化療前1 周內(nèi)血常規(guī)完整；⑤能配合完成醫(yī)院治療及隨訪。排除標(biāo)準(zhǔn)：①嚴(yán)重心肺功能障礙；②嚴(yán)重肝腎功能或骨髓造血功能異常; ③合并有其他惡性腫瘤。收集完整的臨床資料，包括年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況和是否神經(jīng)侵犯等。

1.2 研究方法

1.2.1 術(shù)前尼妥珠單抗聯(lián)合新輔助化療方案

59 例患者均接受尼妥珠單抗+TP（多西他賽+順鉑）術(shù)前新輔助化療，化療結(jié)束2～3 周后入院行腫瘤根治性手術(shù)。誘導(dǎo)化療方案為：尼妥珠單抗注射液（400 mg，d1）+多西他賽注射液（75 mg/m2，d2）+順鉑注射液（30 mg/d，d2-d4）。

1.2.2 確定NLR 閾值及分組 收集患者化療前及化療后外周血中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞數(shù)值，NLR=中性粒細(xì)胞計數(shù)/淋巴細(xì)胞計數(shù)。應(yīng)用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC），得到化療前NLR 閾值，將患者分為高NLR組、低NLR 組。

1.2.3 療效判斷 對所有患者在用藥前及用藥后2 ～ 3 周均進(jìn)行核磁共振影像學(xué)檢查，檢查結(jié)果由2名經(jīng)驗豐富的影像科醫(yī)師測量腫瘤原發(fā)灶的最大徑，意見不一致時由雙方商討決定。參照臨床實體瘤評價標(biāo)準(zhǔn)（response evaluation criteria in solid tumours version 1.1， Resist v.1.1）評定療效，分為完全緩解（complete response，CR）、部分緩解（partial response，PR）、疾病穩(wěn)定（stable disease，SD）和疾病進(jìn) 展（progressive disease，PD），有 效 率（response rate，RR）=（CR+PR）/總例數(shù)。尼妥珠單抗聯(lián)合新輔助化療后根據(jù)實體瘤療效評價標(biāo)準(zhǔn)評估化療療效。

1.2.4 免疫組織化學(xué)檢測組織標(biāo)本中EGFR 的表達(dá)變化

使用免疫組化方法測定新輔助化療前后OSCC組織中EGFR 的表達(dá)，使用平均光密度值反映陽性表達(dá)率。

采集兩組病灶組織標(biāo)本，將其常規(guī)進(jìn)行甲醛固定及石蠟包埋等處理。實驗開始前將蠟塊放置-20 ℃冰箱中冰凍30 min，切成4 μm 的薄片，烤片機(jī)烤干后進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。將石蠟切片、脫蠟、水化，消除內(nèi)源性過氧化物酶，再依次進(jìn)行沖洗、抗原修復(fù)和暴露，室溫孵育10 min，在每張切片上分別滴加工作濃度為1∶200 的一抗工作液100 μL（Ag24847，來源于鼠，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)，4 ℃孵育過夜，次日用PBS水洗3次，每次5 min，滴加工作濃度為1∶500 的二抗100 μL（酶標(biāo)羊抗鼠IgG 聚合物，PK10018，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司），室溫孵育后，PBS 清洗3 次，每次5 min。采用DAB 顯色，蘇木素進(jìn)行復(fù)染，沖洗。將切片脫水透明后自然風(fēng)干，取適量封片膠封片。使用人乳腺癌組織陽性切片為陽性對照，PBS 緩沖液代替一抗工作液為陰性對照［8］。采用3D Histech 掃描分析系統(tǒng)對切片進(jìn)行掃描，提取圖像。陽性表達(dá)結(jié)果采用平均光密度值反映，每個標(biāo)本隨機(jī)選取3 個視野（×400），采用圖像處理軟件Image J 進(jìn)行半定量分析，測定平均光密度值，取平均數(shù)為最終的平均光密度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS25.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，分類資料采用例數(shù)（百分比）表示，組間比較采用χ2檢驗。平均光密度值用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較如符合正態(tài)分布采用t 檢驗，若不符合正態(tài)分布采用秩和檢驗。應(yīng)用受試者工作特征曲線計算NLR最佳閾值。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

共收集59 例患者，男性35 例，女性24 例，年齡42～78 歲，中位年齡63 歲。59 例患者中舌癌12 例，頰癌15 例，牙齦癌21 例，口底癌10 例，硬腭癌1 例；Ⅲ期24 例，Ⅳ期35 例。

2.1 ROC 分組及分析

以治療有效率為狀態(tài)變量，NLR 為檢驗變量，繪制ROC 曲線（圖1）。ROC 曲線下面積=0.753，95%CI= （0.625-0.881），P＜0.01。根據(jù)約登指數(shù)得到最佳截取值為2.377，對應(yīng)敏感度為0.857，特異度為0.645。根據(jù)截斷值將納入病例分為＜2.377組24 例，＞2.377 組35 例。

Figure 1 ROC curve of the NLR for predicting the efficacy of preoperative nimotuzumab combined with neoadjuvant chemotherapy with TP for locally advanced oral squamous cell cancer圖1 NLR 對局晚期口腔鱗狀細(xì)胞癌患者術(shù)前尼妥珠單抗聯(lián)合TP 新輔助化療療效預(yù)測的ROC 曲線

2.2 新輔助治療前NLR 與新輔助治療療效之間的關(guān)系

低NLR組經(jīng)術(shù)前尼妥珠單抗聯(lián)合新輔助化療后療效評價，CR 3 例，PR 17 例，SD 4 例，PD 0 例，RR 83.3%；高NLR 組尼妥珠單抗聯(lián)合新輔助化療后療效評價：CR 1 例，PR 10 例，SD 24 例，PD 0 例，RR 31.4%。分析結(jié)果顯示，低NLR 組和高NLR 組近期新輔助治療療效有統(tǒng)計學(xué)差異，χ2= 15.592，P＜0.001（表1），典型MRI 影像學(xué)變化見圖2。

表1 低NLR 組與高NLR 組局晚期口腔鱗狀細(xì)胞癌患者術(shù)前接受尼妥珠單抗聯(lián)合TP 新輔助化療療效對比Table 1 Comparison of preoperative nimotuzumab combined with neoadjuvant chemotherapy with TP between patients with advanced oral squamous cell cancer in the low NLR group and the high NLR group

Figure 2 Representative cases of efficacy evaluation before and after neoadjuvant chemotherapy in patients with advanced oral squamous cell cancer who received preoperative nimotuzumab combined with neoadjuvant chemotherapy with TP圖2 局晚期口腔鱗狀細(xì)胞癌患者術(shù)前接受尼妥珠單抗聯(lián)合TP 新輔助化療前后療效評估代表性病例

2.3 新輔助治療后NLR 變化

新輔助治療后NLR 總體呈下降趨勢，NLR 范圍波動在0.5 ～ 10.2，平均值為2.95 ± 2.47，與化療前NLR 相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表2）。

表2 低NLR 組與高NLR 組局晚期口腔鱗狀細(xì)胞癌患者術(shù)前接受尼妥珠單抗聯(lián)合TP 新輔助化療后NLR 變化情況Table 2 Changes in the NLR in patients with advanced oral squamous cell cancer in the low NLR group and the high NLR group after nimotuzumab combined with neoadjuvant chemotherapy with TP before surgery ± s

表2 低NLR 組與高NLR 組局晚期口腔鱗狀細(xì)胞癌患者術(shù)前接受尼妥珠單抗聯(lián)合TP 新輔助化療后NLR 變化情況Table 2 Changes in the NLR in patients with advanced oral squamous cell cancer in the low NLR group and the high NLR group after nimotuzumab combined with neoadjuvant chemotherapy with TP before surgery ± s

In the low NLR group, the difference between the NLR before and after nimotuzumab combined with neoadjuvant chemotherapy was statistically significant.In the high NLR group.The change in the NLR before and after neoadjuvant therapy was statistically significant.NLR: neutrophil to lymphocyte ratio; TP: docetaxel and cisplatin

Groups Lower NLR group Higher NLR group n t P After neoadjuvant therapy 1.423 ± 0.458 3.342 ± 0.350 Before neoadjuvant therapy 1.857 ± 0.346 4.468 ± 0.457 0.012 0.041 24 35 2.987 1.986

2.4 新輔助治療前NLR 與臨床病理特征之間的關(guān)系

化療前高、低NLR 組間年齡、性別、腫瘤部位、臨床分期、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、是否神經(jīng)侵犯均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，表3）。

表3 低NLR 組與高NLR 組局晚期口腔鱗狀細(xì)胞癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系Table 3 Relationship of clinic pathological features of patients with locally advanced oral squamous cell carcinoma between low NLR and high NLR group

2.5 EGFR 表達(dá)情況

使用免疫組化方法檢測尼妥珠單抗聯(lián)合TP 新輔助化療前后OSCC 組織中EGFR 的表達(dá)情況，EGFR 的表達(dá)主要位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，表現(xiàn)為棕黃色顆粒。低NLR 組新輔助治療前EGFR 蛋白表達(dá)的平均光密度值為0.113 ± 0.026，新輔助治療后降為0.044 ± 0.015，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；高NLR 組新輔助治療前EGFR 蛋白表達(dá)的平均光密度值為0.124 ± 0.018，新輔助治療后降為0.084 ±0.013，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。低NLR 組和高NLR 組新輔助治療后EGFR 表達(dá)皆出現(xiàn)下降，低NLR 組較高NLR 組下降幅度更大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表4。高NLR 組和低NLR 組新輔助治療前后EGFR 表達(dá)情況見圖3。

表4 低NLR 組與高NLR 組局晚期口腔鱗狀細(xì)胞癌患者術(shù)前接受尼妥珠單抗聯(lián)合TP 新輔助化療后EGFR 變化情況Table 4 Changes in the EGFR in patients with advanced oral squamous cell cancer in the low NLR group and the high NLR group after nimotuzumab combined with neoadjuvant chemotherapy with TP before surgery ± s

表4 低NLR 組與高NLR 組局晚期口腔鱗狀細(xì)胞癌患者術(shù)前接受尼妥珠單抗聯(lián)合TP 新輔助化療后EGFR 變化情況Table 4 Changes in the EGFR in patients with advanced oral squamous cell cancer in the low NLR group and the high NLR group after nimotuzumab combined with neoadjuvant chemotherapy with TP before surgery ± s

The change in optical density was obtained by subtracting the average optical density before neoadjuvant therapy from the average optical density after neoadjuvant therapy.The change in the mean optical density of EGFR expression before and after neoadjuvant therapy was significantly different between the low NLR group and the high NLR group,and the decrease was greater in the low NLR group.These results indicated that EGFR expression decreased more in the low NLR group after neoadjuvant therapy, and the neoadjuvant therapy effect was better.EGFR: epidermal growth factor receptor; NLR: neutrophil to lymphocyte ratio

Groups n Change t P Lower NLR group Higher NLR group 24 35 2.120 2.038 0.043 0.031 t P Before neoadjuvant therapy 0.113 ± 0.026 0.124 ± 0.018 1.694 0.064 After neoadjuvant therapy 0.044 ± 0.015 0.084 ± 0.013 2.122 0.036 0.068 ± 0.008 0.040 ± 0.011 3.264 0.036

Figure 3 Comparison of EGFR expression in the oral cancer tissues of patients with advanced oral squamous cell carcinoma in the low NLR group and high NLR group before and after preoperative nimotuzumab combined with neoadjuvant chemotherapy with TP圖3 局晚期口腔鱗狀細(xì)胞癌患者術(shù)前接受尼妥珠單抗聯(lián)合TP 新輔助化療前后低NLR 組和高NLR 組癌組織中EGFR 表達(dá)變化

3 討 論

炎癥可誘導(dǎo)血管生成、細(xì)胞增殖、活性氧化物引起的DNA 損傷，并抑制癌細(xì)胞的凋亡［9-10］。在腫瘤微環(huán)境（tumor microenviroment，TME）中，腫瘤細(xì)胞重編程周圍的基質(zhì)細(xì)胞，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，不同的免疫細(xì)胞膨脹和募集，促進(jìn)癌癥進(jìn)展［11］。中性粒細(xì)胞通常反映患者全身炎癥情況，淋巴細(xì)胞是患者特異性免疫應(yīng)答的重要部分，NLR 可間接反應(yīng)患者炎癥/免疫狀態(tài)，衡量促腫瘤/抗腫瘤炎癥反應(yīng)之間的平衡關(guān)系，當(dāng)動態(tài)平衡被打破，會引起腫瘤的發(fā)生發(fā)展［12］。

研究表明，腫瘤細(xì)胞可以募集并激活中性粒細(xì)胞，稱為腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞（tumor-associated neutrophils，TANS）［13］，TANS 可通過降低CD4+/CD8+細(xì)胞比例并抑制腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）的產(chǎn)生，形成免疫抑制微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移等，還可以分泌表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）破壞基底膜并侵入周圍組織，促進(jìn)腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移。此外，腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞可能通過彈性基質(zhì)酶、基質(zhì)金屬蛋白酶等［14］，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移，抑制宿主對惡性腫瘤的免疫反應(yīng)，使腫瘤細(xì)胞的生長不受控制。

中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比值已被證實是多種腫瘤，如胃癌［15］、卵巢癌［16］、膀胱癌［17］化療效果的預(yù)測指標(biāo)。Tachinami 等［18］研究指出，NLR 可作為復(fù)發(fā)性或轉(zhuǎn)移性O(shè)SCC 患者接受納武利尤單抗治療效果的預(yù)測指標(biāo)。Sánchez-Canteli 等［19］研究也表明，NLR 與頭頸部鱗狀細(xì)胞癌化療療效存在相關(guān)性。尼妥珠單抗是靶向EGFR 的單克隆抗體，能與EGFR 的胞外區(qū)特異性結(jié)合，阻斷其信號傳導(dǎo)，從而抑制腫瘤增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。本研究中對局晚期OSCC 患者使用尼妥珠單抗聯(lián)合TP術(shù)前新輔助化療方案，多數(shù)患者可達(dá)到臨床部分緩解，根據(jù)所得NLR 最佳截斷值將其分為高、低NLR 組；低NLR 組共24 例，達(dá)到治療有效（CR+PR）者共20 例，RR 83.33%。高NLR 組共35 例，達(dá)到治療有效（CR+PR）者共11 例，RR 31.30%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。本研究結(jié)果顯示，術(shù)前外周血炎癥指標(biāo)對于局晚期OSCC 患者尼妥珠單抗聯(lián)合TP 新輔助化療療效具有一定的預(yù)測意義，低NLR 組尼妥珠單抗聯(lián)合TP 化療效果優(yōu)于高NLR 組，這與Wang等［20］在局晚期胃癌中的研究結(jié)果相似。

此外，患者接受化療后NLR 整體呈下降趨勢，即中性粒細(xì)胞絕對值相對減少或淋巴細(xì)胞絕對值相對增加?？赡苁且驗榛颊呓邮芑熀?，改善了機(jī)體的免疫功能、營養(yǎng)狀態(tài)。Yi 等［21］在肺癌中的研究也發(fā)現(xiàn)這一規(guī)律，當(dāng)患者接受2 個周期的化療后，NLR 明顯下降。Liu 等［22］研究表明，化療后維持低NLR 水平的患者有更好的化療療效和預(yù)后，而NLR 增加的患者總生存期縮短。NLR 是一個動態(tài)變化的指標(biāo)，受炎癥、免疫狀態(tài)及治療方案的影響，其動態(tài)變化可能會影響治療及預(yù)后。Kim 等［23］在乳腺癌的研究發(fā)現(xiàn)，治療前和治療后NLR 持續(xù)較低及NLR 發(fā)生變化的患者較NLR 持續(xù)較高的患者有更好的預(yù)后。Skórzewska 等［24］在胃癌中發(fā)現(xiàn)，治療前NLR 較高者，腫瘤消退率較差，而治療后NLR 增加的患者，對治療無反應(yīng)的風(fēng)險增加。

尼妥珠單抗因其靶向性強(qiáng)，親和力高，目前已廣泛應(yīng)用于臨床，在頭頸部鱗癌、食管鱗癌、肺癌等多種腫瘤中顯示較好的療效及安全性［25-26］。研究表明，抗EGFR 單抗聯(lián)合化療可下調(diào)癌組織中EGFR 的表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖［27］。本研究免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示：高NLR 組、低NLR組尼妥珠單抗聯(lián)合TP 化療后EGFR 的表達(dá)都出現(xiàn)下降，且低NLR 組下降幅度較高NLR 組更大，提示使用尼妥珠單抗聯(lián)合TP 術(shù)前新輔助化療方案后，低NLR 組治療效果更好。

NLR 與OSCC 患者預(yù)后的關(guān)系也被廣泛研究，但對OSCC 患者的預(yù)后價值仍不明確，這可能與樣本量、腫瘤部位及研究中使用的臨界值差異有關(guān)。Ng 等［28］研究表明，NLR 較低的患者有更好的疾病控制率和總生存率（overall survival，OS），Rodrigo等［29］研究結(jié)果也證實以上觀點；Marta 等［30］研究表明，NLR 是預(yù)后不良的獨立預(yù)測因子。Takenaka等［31］發(fā)現(xiàn)有2/3 的研究表明，較高的NLR 與預(yù)后不良相關(guān)，但其他研究結(jié)果不顯著。另外，Ye 等［32］未發(fā)現(xiàn)治療前NLR 與HNSCC 存活率之間存在關(guān)聯(lián)；Templeton 等［33］報道NLR 對預(yù)后的影響可能取決于部位。高NLR 與預(yù)后不良的相關(guān)機(jī)制尚不清楚，確定NLR 與腫瘤預(yù)后相關(guān)性的最佳臨界值可能是將該血液學(xué)標(biāo)志物轉(zhuǎn)化為臨床實踐的先決條件。Yang 等［7］研究表明，高NLR 與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、較高的T 分期、腫瘤分化程度差、神經(jīng)侵犯等臨床病理特征相關(guān)。本研究未發(fā)現(xiàn)高、低NLR 組間臨床病理特征存在差異，可能與樣本量較少有關(guān)。此外，有研究指出，NLR 還可預(yù)測早期舌鱗狀細(xì)胞癌頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生，Salzano 等［34］回顧性分析了100例早期舌鱗狀細(xì)胞癌，當(dāng)NLR 大于2.93 時，隱匿性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險增加。

綜上，尼妥珠單抗聯(lián)合TP 新輔助化療具有良好的抗腫瘤作用，能夠達(dá)到縮小腫瘤、臨床降期的目的。使用新輔助治療前外周血指標(biāo)NLR 預(yù)測新輔助治療療效具有可行性，與其他腫瘤的研究結(jié)果一致［35］。新輔助治療前不同的NLR 與療效存在差異，較高的NLR 意味尼妥珠單抗聯(lián)合TP 新輔助化療近期療效較差，新輔助治療前外周血NLR 對療效預(yù)測有一定的價值，并且簡便易得，但仍需要進(jìn)一步的前瞻性研究，同時擴(kuò)大樣本量證實其差異性并得到準(zhǔn)確的臨界值，以供臨床參考。

【Author contributions】Tian LL processed the research, collected,analyzed the data and wrote the article.Nan XR designed the study,guided and critically reviewed the article structures.All authors read and approved the final manuscript as submitted.