杜詩(shī)敏， 劉蘊(yùn)賢， 常曉峰， 李哲

1.西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院 陜西省顱頜面精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安（710004）； 2.西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院口腔種植科，陜西 西安（710004）； 3.西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院數(shù)字化種植修復(fù)科，陜西 西安（710004）

鈦金屬因其良好的生物相容性和優(yōu)異的機(jī)械性能，已成為口腔種植體的首選材料。鈦表面通常缺乏骨誘導(dǎo)活性，因而骨結(jié)合時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)（3 ～ 6 個(gè)月）。通過(guò)在鈦表面構(gòu)筑有序納米形貌可調(diào)控多種骨再生進(jìn)程［1］，其中以鈦納米管陣列結(jié)構(gòu)（titanium nanotube，TNT）的相關(guān)研究最為廣泛。研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)改變陽(yáng)極氧化電壓可制備出不同管徑TNT 形貌，并在血凝塊形成［2］、免疫炎癥反應(yīng)［3］、血管新生［4］、新骨形成［5］等多個(gè)骨再生階段發(fā)揮重要調(diào)控作用。目前納米形貌改性鈦種植體已在合成方法、機(jī)制探索、體內(nèi)驗(yàn)證等方面得到了系統(tǒng)論證，但至今尚未在臨床中廣泛應(yīng)用，其主要原因之一是對(duì)納米形貌機(jī)械強(qiáng)度的擔(dān)憂［6］。例如，種植體植入體內(nèi)過(guò)程中需要對(duì)抗較高扭力，納米形貌是否可以抵抗較高的剪切應(yīng)力并完整進(jìn)入體內(nèi)發(fā)揮作用？同時(shí)納米形貌若發(fā)生剝脫也會(huì)引發(fā)生物安全性的問題［7］，因此，提高種植體表面納米形貌的機(jī)械穩(wěn)定性至關(guān)重要。

貝殼是一種典型的具有輕質(zhì)、高強(qiáng)、高韌性能的材料，其珍珠層由文石片碳酸鈣（約95%）及有機(jī)質(zhì)（約5%）有序排列而成，由于其獨(dú)特的“磚-泥” 結(jié)構(gòu)使其具有極高的強(qiáng)度，同時(shí)兼具良好的韌性［8］。受此啟發(fā)，仿貝殼高強(qiáng)高韌材料已成為工業(yè)制造領(lǐng)域研究熱點(diǎn)。Song 等［9］利用氧化石墨烯納米片與磺化苯乙烯-丁乙烯/丁苯乙烯復(fù)合物制備了一種超堅(jiān)韌的人造珍珠層，可表現(xiàn)出約15.3 MJ/m3的超高韌性，優(yōu)于天然珍珠層（約1.8 MJ/m3）和其他石墨烯基納米復(fù)合材料（約0.3 MJ/m3）。理論上，若能在鈦表面模仿出貝殼的“磚泥”結(jié)構(gòu)，即在無(wú)機(jī)納米形貌的間隙中原位生長(zhǎng)有機(jī)納米材料，或?qū)⑻嵘{米形貌在植入過(guò)程中的機(jī)械穩(wěn)定性。

有機(jī)雜化介孔硅（hybrid organic- inorganic mesoporous silica，HMS）是由有機(jī)硅源和無(wú)機(jī)硅源共同組成的孔徑介于2 ～ 50 nm 之間的多孔納米材料，其中以氨基雜化介孔硅（Amino-HMS，AHMS）的研究最為廣泛。因其無(wú)毒、可降解、易于修飾等優(yōu)勢(shì)被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域［10-11］。介孔硅基材料已被證明可以與TNT 通過(guò)氫鍵作用牢固結(jié)合［12］，此外氨基基團(tuán)（NH2-）和硅元素（Si）的存在也被證明對(duì)成骨細(xì)胞黏附、增殖和分化發(fā)揮重要作用［13-14］。因此，本研究以TNT 為模型材料原位沉積AHMS（TNT@AHMS），通過(guò)不同比例的有機(jī)/無(wú)機(jī)硅源用量探索合成參數(shù)；通過(guò)多種儀器完成TNT@AHMS 的材料表征；通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其機(jī)械強(qiáng)度、降解行為、細(xì)胞活性和促成骨能力，旨在為鈦表面納米形貌保護(hù)涂層設(shè)計(jì)提供可行方案。

1 材料和方法

1.1 主要材料、試劑和儀器

純鈦圓片（直徑15 mm，厚度1 mm）、純鈦螺紋釘（直徑1.5 mm，長(zhǎng)度2.5 mm）（寶雞鈦業(yè)有限公司，中國(guó)）；防水SiC 砂紙400 ～2 000 目（Matador，德國(guó)）；氫氟酸、丙酮、乙醇（天津富宇化工有限公司，中國(guó)）；去離子水（第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院藥劑科，中國(guó)）；十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）、氨丙基三乙氧基硅烷（3-aminopropyl triethoxysilane，APTES）、正硅酸乙酯（tetraethyl orthosilicate，TEOS）、氫氧化鈉、環(huán)己烷、DAPI（Sigma-Aldrich，美國(guó))；原硅酸四乙酯（tetraethyl orthosilicate，TEOS，瑪雅試劑，中國(guó)）；αMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（Gibco，美國(guó)）；青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶（Sigma，美國(guó)）；4% 多聚甲醛、25% 戊二醛、六甲基二硅胺烷（天津天力化工，中國(guó)）；CCK-8 試劑盒、MicroBCA 試劑盒、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）定量及染色試劑盒（碧云天，中國(guó)）；陽(yáng)極氧化電源（DH18600，北京大華無(wú)線電儀器廠，中國(guó)）；數(shù)控超聲波清洗器（KH-600GTDV，昆山市超聲儀器有限公司，中國(guó)）；恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo ScientificTMFormaTMⅡ，Thermo，美國(guó)）；場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡（S-4800，HITACHI，日 本）；ICP -AES 分 析 儀（Spectro Genesis，PE5300DV，德國(guó)）；水接觸角測(cè)定儀（KRUSS，EasyDrop-Standard，德國(guó)）；共聚焦顯微鏡（A1 PLUS，Nikon，日本）；X 射線光電子能譜儀（X-ray photo-electron spectroscopy，XPS）（Thermo Scientific K-Alpha，ThermoFisher，美 國(guó)）； Micro-CT（SKYSCAN 2214，Bruker，比利時(shí)）；采用小鼠前成骨細(xì)胞系（MC3T3-E1 亞克隆14，ATCC，美國(guó)）進(jìn)行體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)；SD 大鼠（雄性、6 周齡）來(lái)源于西安交通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。動(dòng)物許可編號(hào)：SCXK（陜）2023-002。

1.2 純鈦表面納米管TNT 的制備

使用砂紙依次將純鈦試樣拋光并置0.5% 氫氟酸中反應(yīng)30 min 取出，部分試樣記做純鈦酸蝕組（Ti 組）。其余試樣進(jìn)一步置于0.5 % 氫氟酸電解液中，采用20 V 恒壓直流電對(duì)試樣進(jìn)行陽(yáng)極氧化處理，持續(xù)時(shí)間1 h，記為納米管組（TNT 組）。所有試樣依次在丙酮、無(wú)水乙醇、去離子水中超聲蕩洗10 min，晾干備用。

1.3 納米管間氨基雜化介孔硅TNT@AHMS 的制備

AHMS 的沉積策略采用課題組前期使用的油水兩相法［12］：將60 mg CTAB、250 μL NaOH（0.1 mol/L）依次加入到30 mL 水中獲得水相溶液；將鈦試樣放入上述液體中60 ℃反應(yīng)1 h；將40 μL 有機(jī)硅源（APTES）和無(wú)機(jī)硅源（TEOS）的混合液溶于1 mL環(huán)己烷中，并逐滴加入到水相溶液中，APTES/TEOS 用量比分別為 3∶1，1∶1，1∶3。繼續(xù)反應(yīng)4 h后取出試樣，采用無(wú)水乙醇、去離子水交替沖洗，經(jīng)60 ℃干燥1 h 后，采用含0.2 wt % NH4NO3的乙醇溶液60 ℃下回流 2 h，共重復(fù)3 次以徹底去除CTAB模板劑，晾干備用。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)與接種

采用MC3T3-E1 細(xì)胞系作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，培養(yǎng)基為含有10% FBS、青鏈霉素雙抗（100 U/mL）的α-MEM 培養(yǎng)基，置于含有5% CO2的 37 ℃孵箱中培養(yǎng)，隔日換液。細(xì)胞密度達(dá)到85 %時(shí)，使用胰蛋白酶消化細(xì)胞并傳代。鈦試樣的消毒采用75%乙醇過(guò)夜浸泡，細(xì)胞接種前紫外照射至少30 min。

1.5 材料表征

掃描電鏡：將試樣置于掃描倉(cāng)中采用20 kV 加速電壓進(jìn)行形貌觀察；親水性測(cè)定：校準(zhǔn)水平面后，將50 μL 去離子水滴加在試樣表面，待液滴穩(wěn)定后使用DSA1 軟件（KRUSS，德國(guó)）測(cè)量接觸角并拍照記錄。XPS：采用氮?dú)馇謇頋崈粼嚇颖砻?，使用單色Al-Kα X 射線源，工作電壓為12 kV ×15 mA，壓力為2 × 10-7Pa，使用Xpspeak 4.1 軟件來(lái)分析高分辨率光譜。采用納米壓痕儀測(cè)定材料表面涂層強(qiáng)度并繪制載荷-深度曲線。

1.6 體外機(jī)械強(qiáng)度評(píng)估

將試樣輕柔倒扣于24 孔板底部，每孔加入1 mL PBS 溶液后采用超聲震蕩儀蕩洗15 min，取出后晾干觀察。

1.7 體外降解行為觀察

將試樣置于 24 孔板，每孔加入 1 mL PBS 溶液，在恒溫?fù)u床的晃動(dòng)下進(jìn)行體外模擬浸泡實(shí)驗(yàn)（37 ℃，80 rpm），2、8、12、24、72 h 后取盡上層浸提液用作 ICP-AES 硅濃度檢測(cè)。

1.8 細(xì)胞早期黏附和活力測(cè)定

將MC3T3-E1 細(xì)胞接種于材料表面24 h 后去除培養(yǎng)液，采用 2.5%戊二醛固定，電鏡試樣采用乙醇梯度脫水后上機(jī)觀察；共聚焦顯微鏡檢測(cè)試樣采用DAPI 染液孵育15 min 后封片觀察；細(xì)胞活力測(cè)定采用CCK-8 法，具體步驟依照廠商提供的說(shuō)明書進(jìn)行，450 nm 波長(zhǎng)下測(cè)量OD 值。

1.9 ALP 染色及活性測(cè)定

接種于材料表面的MC3T3-E1 細(xì)胞成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d后，4 %多聚甲醛室溫固定，每孔加入 200 μL ALP 染液孵育20 min，置于體式顯微鏡下拍攝；活性檢測(cè)：成骨誘導(dǎo)7 d 后，每孔加入250 μL 細(xì)胞裂解液冰上裂解15 min，收集裂解液于EP 管中給予凍融循環(huán)3 次，離心取上清后加入顯色底物和檢測(cè)緩沖液孵育30 min，測(cè)定405 nm 處吸光度，剩余ALP 樣品采用MicroBCA 試劑盒行細(xì)胞內(nèi)總蛋白定量，對(duì)ALP 活性結(jié)果標(biāo)定。

1.10 鈦螺紋釘修飾、體內(nèi)植入實(shí)驗(yàn)及Micro-CT檢測(cè)

酸蝕粗化（Ti）、陽(yáng)極氧化（TNT）、以及含納米管形貌保護(hù)涂層（TNT@AHMS）的鈦螺紋釘合成方法同1.2，1.3 部分。臨床中種植體推薦的植入扭力一般為35 Ncm，但鑒于本實(shí)驗(yàn)所用螺紋釘?shù)闹睆絻H為1.5 mm，且大鼠股骨皮質(zhì)骨較薄，因此常規(guī)備洞植入可能會(huì)影響植體初期穩(wěn)定性和涂層保護(hù)能力的評(píng)估。因此本實(shí)驗(yàn)在不備洞的情況下隨機(jī)將TNT、TNT@AHMS 試樣植入3 只SD 大鼠兩側(cè)股骨干骺端（每只大鼠每側(cè)股骨同時(shí)植入TNT、TNT@AHMS試樣各一枚，即每組進(jìn)行6 次重復(fù)），嚴(yán)密縫合后觀察1 d 并再次取出，采用胰蛋白酶處理血凝塊后PBS 漂洗3 遍，上機(jī)觀察。另將18 只SD 大鼠隨機(jī)分為Ti 組、TNT 組和TNT@AHMS 組，植入螺紋釘后分層縫合，術(shù)后連續(xù)3 d 肌注青霉素，術(shù)后4 周處死大鼠取股骨樣本進(jìn)行Micro-CT 掃描，評(píng)估不同試樣表面成骨情況。選擇感興趣區(qū)域（region of interest，ROI）行三維圖像重建，并定量分析骨體積分?jǐn)?shù)。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理批準(zhǔn)（XJTUAE2023-1288）。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用 GraphPad Prism 8 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析進(jìn)行多組間比較，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 鈦表面形貌掃描電鏡觀察

掃描電鏡觀察可見氫氟酸酸蝕后鈦表面出現(xiàn)了微米坑樣形貌（圖1a）；通過(guò)20 V 電壓下陽(yáng)極氧化成功在鈦表面制備出了管徑約100 nm 均勻排列的管狀陣列結(jié)構(gòu)（圖1b）；采用3∶1，1∶1，1∶3 三種不同APTES/TEOS 用量比于TNT 表面沉積AHMS涂層，結(jié)果顯示3∶1 和1∶1 用量比未能沉積介孔納米涂層（圖1c、1d），但在用量比為1:3 時(shí)可見鈦納米管間均勻覆蓋AHMS 涂層，介孔孔徑約4 nm（圖1e、1f）。

Figure 1 Scanning electron microscopy images of acid-etched titanium, anodized titanium, and AHMS coatings deposited in situ with different APTES/TEOS ratios圖1 酸蝕鈦、陽(yáng)極氧化鈦以及不同APTES/TEOS 用量比下原位沉積AHMS 涂層后的電鏡圖

2.2 親水性、元素表征及納米壓痕檢測(cè)

水接觸角測(cè)定結(jié)果顯示Ti、TNT、TNT@AHMS的親水角分別約為36.1°、14.73°、12.78°（圖2a），其中TNT@AHMS 的親水性顯著優(yōu)于Ti（P＜0.001），但與TNT 之間未見明顯差異（P= 0.425，圖2b）。XPS 檢測(cè)結(jié)果顯示，相比于TNT，AHMS 沉積后試樣出現(xiàn)了明顯的N1s 峰（圖2c），再次證明了TNT@AHMS 合成成功。納米壓痕儀生成的載荷-深度曲線可見，在同樣施加200 N 載荷的條件下，納米探頭在TNT@AHMS 表面的壓入深度僅為50 nm，而在TNT 表面可達(dá)100 nm，這說(shuō)明TNT@AHMS 具有更優(yōu)異的表面機(jī)械強(qiáng)度（圖2d）。

Figure 2 Water contact angles, XPS measurements and nanoindentation tests on different sample surfaces圖2 不同試樣表面水接觸角、XPS 及納米壓痕檢測(cè)結(jié)果

2.3 體外機(jī)械性能測(cè)定

掃描電鏡可見，在相同條件下超聲震蕩15 min后TNT 形貌破壞明顯，部分TNT 從基底剝脫，形成大量無(wú)規(guī)則碎片，而TNT@AHMS 仍維持原有結(jié)構(gòu)，兩者結(jié)合緊密未見破壞（圖3）。

Figure 3 Scanning electron microscopy images of different samples before and after ultrasonic vibration for 15 min圖3 不同試樣超聲震蕩15 min 前后的掃描電鏡圖像

2.4 體外降解性實(shí)驗(yàn)

TNT@AHMS 的降解過(guò)程如圖4，其中硅離子濃度測(cè)定結(jié)果可見：在浸泡早期，AHMS 可以發(fā)生快速降解，硅離子濃度升高明顯，8 h 后表面基本觀察不到介孔結(jié)構(gòu)，12 h 后累計(jì)硅釋放量進(jìn)入平臺(tái)期，約10 ppm。而電鏡結(jié)果可見AHMS 介孔結(jié)構(gòu)可維持2 h，在12 h 后則恢復(fù)為基底TNT 形貌，這與硅離子釋放結(jié)果基本一致。

Figure 4 Silicon ion release curve and morphology changes of TNT@AHMS圖4 TNT@AHMS 硅離子釋放曲線及形貌變化

2.5 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

材料表面生物相容性主要通過(guò)細(xì)胞早期黏附、形態(tài)和活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。接種24 h 后，SEM 鏡下可見TNT@AHMS 表面細(xì)胞黏附數(shù)量明顯升高，細(xì)胞為多邊形，可見大量偽足呈放射狀伸展，細(xì)胞連接增多，此時(shí)Ti、TNT 表面細(xì)胞伸展相對(duì)不足，偽足較少（圖5a）。CCK-8 結(jié)果顯示，在接種 24、48、72 h后， TNT@AHMS 表面細(xì)胞始終保持最高的活性（圖5b）。共聚焦顯微鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果（圖5c、5d）與電鏡結(jié)果一致（TNT@AHMSvsTi:P＜0.001；TNT@AHMSvsTNT:P＜0.05）。成骨誘導(dǎo)7 d 后，經(jīng)ALP 染色比較成骨細(xì)胞分化能力，TNT@AHMS表面細(xì)胞的ALP 活性最高，進(jìn)一步采用ALP定量試劑盒進(jìn)行半定量分析，其結(jié)果與上述染色結(jié)果基本一致（TNT@AHMSvsTi:P＜0.001；TNTvsTi:P＜0.01，圖5e、5f）。

Figure 5 Cell adhesion behaviors, cell activity and ALP levels on different surfaces of the samples圖5 不同試樣表面細(xì)胞黏附數(shù)量、形態(tài)、活性及ALP 水平測(cè)定

2.6 體內(nèi)植入試驗(yàn)及成骨效果評(píng)價(jià)

所有試樣均在不備洞情況下手動(dòng)攻入大鼠股骨（圖6a）。植入前掃描電鏡結(jié)果可見鈦釘具有自攻性螺紋，螺紋間距約200 μm，通過(guò)陽(yáng)極氧化法及油水兩相法在螺紋釘表面可成功制備出TNT 和TNT@AHMS 形貌，與圓鈦片基本一致。在不備洞情況下攻入鈦螺紋釘后24 h 取出，可見螺紋釘表面覆蓋大量血凝塊，給予清理后進(jìn)一步觀察可見TNT 組出現(xiàn)明顯剝脫，而TNT@AHMS 仍可保留較完整的形貌結(jié)構(gòu)（圖6b），這與體外檢測(cè)結(jié)果基本一致。鈦釘植入4 周后，Micro-CT 及三維重建結(jié)果顯示：TNT@AHMS 表面骨組織覆蓋面積最大（圖6c，黃色部分），TNT 次之，Ti 最少，骨體積分?jǐn)?shù)計(jì)算結(jié)果也同樣顯示，AHMS 的存在進(jìn)一步提高了TNT 的骨體積分?jǐn)?shù)（TNT@AHMSvsTi:P＜0.01；TNT@AHMSvsTNT:P＜0.05，圖6d）。VG（Van Gieson）染色結(jié)果可見TNT@AHMS 表面新骨形成更為明顯（圖6e 深紅色部分），與Micro-CT 結(jié)果基本一致。

Figure 6 Morphological observation before and after implantation in rats and Micro-CT and VG staining results of osseointegration after 4 weeks圖6 大鼠體內(nèi)植入試樣前后形貌觀察及4 周后Micro-CT、VG 染色成骨檢測(cè)

3 討 論

納米形貌的成骨誘導(dǎo)作用及機(jī)制已得到廣泛研究［15］，然而納米形貌是否具有可靠的機(jī)械強(qiáng)度以保證植入時(shí)可以維持自身結(jié)構(gòu)尚存爭(zhēng)議，這也阻礙了納米形貌修飾鈦種植體的臨床應(yīng)用。雖然無(wú)扭力植入理念已被少量種植系統(tǒng)采用并獲得了良好的臨床效果［16］，將形貌制備在該類種植體上或許可以避免剝脫問題，但該策略并不滿足臨床日益增長(zhǎng)的對(duì)即刻種植、即刻負(fù)重的需求。也有學(xué)者提出零維納米形貌的替代方案［17］，但該方法并未從根本上解決上述問題。

天然貝殼具有高強(qiáng)高韌表面，這源于其內(nèi)部有機(jī)質(zhì)-無(wú)機(jī)質(zhì)有序排列而成的“磚泥”結(jié)構(gòu)。鑒于鈦表面納米形貌同樣為無(wú)機(jī)TiO2，理論上若能在結(jié)構(gòu)間原位生長(zhǎng)出可降解的有機(jī)間質(zhì)，則有望提升納米形貌的機(jī)械強(qiáng)度，但目前尚無(wú)研究可以借鑒。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)油水兩相法成功在TNT 表面原位沉積出AHMS（TNT@AHMS），介孔孔徑約4 nm，涂層均勻連續(xù)，重要的是實(shí)現(xiàn)了自下而上的全層沉積效果，納米管間、管周及外表面均被完整覆蓋。該結(jié)構(gòu)與課題組先前在TNT 表面沉積的無(wú)機(jī)介孔硅薄膜 基 本 一 致［12］。TNT 表 面 存 在 的 游 離 羥 基（-OH），可以與硅膠束表面的羥基基團(tuán)（-SiOH）發(fā)生氫鍵作用，這是合成成功的關(guān)鍵。此外，硅膠束尺寸極小，可以進(jìn)入納米管內(nèi)部，這可能是實(shí)現(xiàn)全層沉積的主要原因［18］。XPS結(jié)果顯示N1s峰的存在，再次證明TNT 表面的介孔涂層為氨基雜化介孔硅。

鈦種植體植入體內(nèi)通常需要耐受較大扭力，本研究首先通過(guò)體外超聲震蕩法初步證實(shí)了TNT@AHMS 的機(jī)械穩(wěn)定性。在體內(nèi)試驗(yàn)中，為了模擬高扭力環(huán)境，在不備洞的條件下植入了鈦螺紋釘，其結(jié)果與體外一致，即AHMS 起到了預(yù)期的納米形貌保護(hù)作用。在植入24 h 后AHMS 完全降解并重新暴露出TNT 陣列結(jié)構(gòu)，這與體外降解實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。AHMS 的高速降解性源于其內(nèi)部多孔結(jié)構(gòu)。有研究表明，水分子進(jìn)入到介孔孔洞會(huì)攻擊內(nèi)部Si-O-Si 骨架引發(fā)水解，此外環(huán)境中的離子成分也會(huì)加速這一過(guò)程［19］。AHMS 的快速降解巧妙地避免了對(duì)TNT 結(jié)構(gòu)及后續(xù)生物活性的影響，同時(shí)AHMS 的摻入不僅未發(fā)現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒性，相反，還對(duì)MC3T3-E1 細(xì)胞的黏附、增殖、分化能力起到顯著的上調(diào)作用。這可能與AHMS 高比表面積、親水性等物理特性，以及APTES 的引入和低劑量的硅離子釋放（10 ppm）等化學(xué)因素有關(guān)［20］。

本研究仍存在一定局限性，例如TNT@AHMS雖然在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出可靠的穩(wěn)定性，但其彈性模量、機(jī)械強(qiáng)度、韌度具體是多少仍需進(jìn)一步測(cè)定，因?yàn)椴牧媳砻娴纳鲜鲂再|(zhì)對(duì)細(xì)胞的生物學(xué)行為同樣具有顯著影響；此外，APTES 和硅元素協(xié)同發(fā)揮促成骨功效的內(nèi)在機(jī)制亟待進(jìn)一步探索；最后，未來(lái)研究中仍需要采用大動(dòng)物模型植入標(biāo)準(zhǔn)種植體以驗(yàn)證納米形貌保護(hù)效果和成骨性能。綜上，本實(shí)驗(yàn)受天然貝殼高強(qiáng)高韌表面特性啟發(fā)，通過(guò)在鈦納米管表面原位沉積氨基雜化介孔硅，實(shí)現(xiàn)了鈦表面無(wú)毒、可降解、促成骨、結(jié)合穩(wěn)固的納米形貌保護(hù)涂層的構(gòu)建，為最終納米形貌修飾種植體的研發(fā)提供新的思路。

【Author contributions】Du SM performed the experiments and wrote the article.Liu YX, Chang XF performed the experiments, revised the article.Li Z designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.