丁夢(mèng)， 李強(qiáng)， 李筱葉， 賀敖， 戴卓， 董衡， 牟永斌

南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院，南京市口腔醫(yī)院，南京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)研究所，江蘇 南京（210008）

水凝膠可作為組織工程化支架材料應(yīng)用于骨缺損區(qū)，為細(xì)胞的黏附和增殖提供空間，然而其不可控的流變性影響其在骨缺損區(qū)的固位［1］。甲基丙烯?；髂z（gelatin methacryloyl，GelMA）是經(jīng)過(guò)雙鍵改性處理后得到的明膠衍生物，在光引發(fā)劑作用下可以迅速固化形成適宜于細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的3D 結(jié)構(gòu)，以促進(jìn)血管新生和組織形成［2-3］；此外，基于GelMA 構(gòu)建的3D 支架可調(diào)控機(jī)械和化學(xué)性質(zhì)，可以為細(xì)胞培養(yǎng)提供有利環(huán)境［4］。然而，由于GelMA 缺乏成骨因子或其他促進(jìn)骨再生與礦化的元素，其在骨組織工程中的應(yīng)用研究尚不多見(jiàn)。組織工程種子細(xì)胞來(lái)源多為干細(xì)胞，其中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）來(lái)源廣泛，使用便捷，且免疫原性低，可以作為種子細(xì)胞的首選［5］。多項(xiàng)動(dòng)物和臨床研究均表明BMSCs 對(duì)骨缺損具有良好的治療效果［6-7］，然而，由于體外擴(kuò)增效率不高，培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)和體內(nèi)存活率有限［8-9］，目前干細(xì)胞在體外工程化骨移植物中的真正潛力尚未得到充分發(fā)揮。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)優(yōu)化支架材料作為細(xì)胞遞送的載體，可以為BMSCs 提供合適的微環(huán)境，延長(zhǎng)細(xì)胞活力［10］，同時(shí)還確保了BMSCs 向目標(biāo)譜系分化的關(guān)鍵因素［11］。

為了滿足臨界骨缺損組織再生的臨床需求，筆者研發(fā)了紫外光響應(yīng)交聯(lián)的GelMA 水凝膠，并將自大鼠體內(nèi)提取的BMSCs 均勻分布于GelMA 水凝膠中。通過(guò)大鼠顱骨缺損模型證實(shí)了可注射型GelMA/BMSCs 水凝膠可以在骨缺損部位快速光聚合，有效促進(jìn)骨組織再生與修復(fù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

明膠（Sigma-Aldrich，美國(guó)）；甲基丙烯酸酐（methacrylic anhydride，MA；Sigma-Aldrich，美國(guó)）；苯基（2，4，6-三甲基苯甲?；┝姿徜嚕跮ithium Phenyl（2，4，6trimethylbenzoyl）phosphinate，LAP］（蘇州永沁泉智能設(shè)備有限公司，中國(guó)）；二甲苯（上海滬試實(shí)驗(yàn)器材股份有限公司，中國(guó)）；無(wú)水乙醇（上海滬試實(shí)驗(yàn)器材股份有限公司，中國(guó)）；蘇木素伊紅染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，中國(guó)）；Van Gieson 染色液（北京索萊寶科技有限公司，中國(guó)）；Goldner 三色染色液（北京索萊寶科技有限公司，中國(guó)）；透析袋（Spectrum Laboratories，美國(guó)）；DMEM/F-12 培養(yǎng)基（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)）；胎牛血清（Corning，美國(guó)）；紅細(xì)胞裂解液（碧云天生物技術(shù)有限公司，中國(guó)）；CD29、CD90、CD45、CD31 抗體（Abcam，英國(guó)）；Calcein/PI 細(xì)胞活性與細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司，中國(guó)）；CCK-8 Cell Counting Kit（諾維贊生物科技股份有限公司，中國(guó)）；光固化燈（ EFL-LS-1600-405，蘇州永沁泉智能設(shè)備有限公司，中國(guó)）；Micro-CT（Hiscan XM，蘇州海斯菲德信息科技有限公司，中國(guó)）；CT 三維重建分析（Hiscan Reconstruct/Analyzer software V3.0，蘇州海斯菲德信息科技有限公司，中國(guó)）；掃描電子顯微鏡（Regulus8100，Hitachi，日本）；流式細(xì)胞儀（BDFACSCalibur，Becton Dickinson，美國(guó)）；電子萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)（MTSE45，美特斯工業(yè)系統(tǒng)有限公司，中國(guó)）；共聚焦顯微鏡（Nikon Ti A1，Nikon，日本）。SD 大鼠由上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)營(yíng)部提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2018-0006，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)完全按照南京大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理審查批號(hào)為IACUC-2003101。

1.2 紫外光交聯(lián)GelMA 水凝膠合成

材料合成如模式圖1a 所示，將5 g 明膠溶解于50 mL 的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）中50 ℃水浴攪拌30 min 以充分溶解，然后取10 mL 甲基丙烯酸酐（methacrylic anhydride，MA）以0.5 mL/min 的速度緩慢滴加到明膠溶液中并不停攪拌，混合物置于50 ℃的恒溫水浴中攪拌反應(yīng)3 h，加入400 mL 50 ℃的PBS 稀釋后將稀釋液裝入透析袋（MWCO = 12 ～ 14 kDa）中，在40 ℃的去離子水中透析1 周，每4 h 更換去離子水，結(jié)束后將產(chǎn)物置于-80 ℃冰箱中過(guò)夜，冷凍干燥后得到GelMA。

Figure 1 Strategy by which GelMA/BMSC photocuring hydrogels promote critical bone defect repair圖1 GelMA/BMSCs 光固化水凝膠促進(jìn)臨界性骨缺損修復(fù)策略

在PBS 中以2.5 mg/mL 的濃度溶解LAP，50 ℃水浴震蕩15 min，取所需質(zhì)量的GelMA 凍干粉加入溶解的LAP之中，60 ℃水浴溶解30 min，使用0.22 μm過(guò)濾器過(guò)濾后備用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如圖1b 所示，在大鼠顱骨兩側(cè)制備5 mm 直徑的臨界骨缺損，將GelMA/BMSCs 水凝膠滴入缺損區(qū)，并置于405 nm的紫外光固化燈下照射10 s 以完成固化。術(shù)后第4 周和第8 周拍攝Micro-CT 觀察顱骨缺損修復(fù)情況，第8 周處死大鼠進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)分析。

1.3 交聯(lián)GelMA 水凝膠理化性能分析

配置10%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的GelMA 光固化水凝膠前體，用注射器將GelMA 光固化水凝膠前體滴于平面上，置于光強(qiáng)為10 mW/cm2的405 nm 紫外燈下光照10 s，評(píng)估其溶液流動(dòng)性和光固化性能。將紫外光交聯(lián)后的GelMA 凍干，在切片噴金后置于掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）下觀察其表面特征，采用軟件ImageJ（version: 2.3.0/1.53q）測(cè)量材料電鏡照片孔徑大小并計(jì)算孔隙率，孔隙率 = 孔隙面積/總面積 × 100 %。能量色散X射線光譜儀（energy dispersive X-ray spectroscopy，EDX）檢測(cè)分析元素分布。

制備直徑8 mm，高度10 mm 的圓柱形光固化水凝膠樣品，將樣品置于電子萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)的平臺(tái)上，按照1 mm/min 的加載速率進(jìn)行壓縮試驗(yàn)，應(yīng)力（σ）定義為加載力除以試樣原始截面積，應(yīng)變（ε）定義為變形長(zhǎng)度除以試樣原始長(zhǎng)度，根據(jù)儀器測(cè)試數(shù)據(jù)繪制加載力-位移曲線和應(yīng)力-應(yīng)變曲線，通過(guò)應(yīng)力-應(yīng)變曲線計(jì)算樣本的壓縮強(qiáng)度。

1.4 BMSCs 的提取、培養(yǎng)及鑒定

將2 周齡SPF 級(jí)雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠麻醉下頸椎脫臼處死，無(wú)菌條件下分離脛骨、股骨。剪開(kāi)脛骨、股骨干骺端，用1 mL 注射器吸取預(yù)冷PBS 沖洗骨髓腔，獲得骨髓細(xì)胞懸液，使用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞后PBS 洗2 遍，置于含有10%胎牛血清和雙抗（青霉素100 U/mL、鏈霉素100 U/L，pH 7.2～7.4）的DMEM/F-12 培養(yǎng)基中，37 ℃和5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h 后培養(yǎng)基半量換液，然后每3 d 全量換液。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)到80 %細(xì)胞密度時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代，傳代比例為1∶3。顯微鏡下觀察BMSCs 形態(tài)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BMSCs 的表面標(biāo)記物CD29，CD90，CD45 和CD31 對(duì)其進(jìn)行鑒定。

1.5 細(xì)胞包封（3D 培養(yǎng)）及活性鑒定

取GelMA 凍干粉2 g 加入含20 mL 0.25% LAP的PBS 溶液中攪拌溶解，取第3～5 代BMSCs 細(xì)胞用胰蛋白酶消化，洗滌重懸于配制的GelMA 光固化水凝膠溶液（5 × 106個(gè)細(xì)胞/mL）中備用。

將GelMA/BMSCs 水凝膠在48 孔板中固化并加入培養(yǎng)基，每2 d 換液1 次。分別于1、2、5 d 加入含10 % CCK-8 的新鮮無(wú)血清培養(yǎng)基，37 ℃孵育1 h，隨后用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)450 nm 處的光密度值（OD值）以評(píng)估水凝膠的細(xì)胞毒性。細(xì)胞存活率通過(guò)實(shí)驗(yàn)組的吸光度ODm 和對(duì)照組的吸光度ODn 比值來(lái)計(jì)算得到：細(xì)胞存活率= ODm/ODn×100%

同樣的方法培養(yǎng)GelMA/BMSCs 水凝膠于共聚焦小皿中，于1、2、5 d 加入Calcein/PI 細(xì)胞活性與細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑來(lái)評(píng)估細(xì)胞在水凝膠中的增殖活性，使用共聚焦顯微鏡對(duì)細(xì)胞進(jìn)行成像。

1.6 大鼠顱骨缺損模型構(gòu)建及治療

選用6 只SPF 級(jí)雄性SD 大鼠（6 周齡，體質(zhì)量約200 g），其中3 只為對(duì)照組，3 只為GelMA/BMSCs組。異氟烷麻醉，大鼠呈俯臥位，顱骨區(qū)備皮、碘伏消毒、鋪巾、暴露手術(shù)視野，在大鼠顱骨行3 cm縱向切口，切開(kāi)皮膚，皮下組織和肌肉－骨膜層并翻瓣，鈍性分離暴露顱骨骨板。使用外徑為5 mm的環(huán)鉆在顱骨制備全層骨膜骨質(zhì)缺損，鉆孔時(shí)用裝有無(wú)菌生理鹽水的注射器降溫，以免過(guò)熱損害腦組織。GelMA/BMSCs 組：將20 μL 10% GelMA/BMSCs 水凝膠溶液緩慢滴入顱骨缺損區(qū)，置于光強(qiáng)為10 mW/cm2的405 nm 紫外燈下光照10 s，檢測(cè)水凝膠在位，撥動(dòng)無(wú)明顯位移；對(duì)照組的骨缺損不做任何處理，逐層縫合關(guān)閉創(chuàng)口。術(shù)后每只大鼠肌注0.8 MU 青霉素，連續(xù)3 d，預(yù)防術(shù)后感染。

1.7 顱骨Micro CT 分析

術(shù)后4、8 周，骨缺損部位進(jìn)行Micro-CT 掃描，掃描參數(shù)為：80 kV，100 μA，單次曝光時(shí)間50 ms，掃描分辨率25 μm，掃描角度間隔0.5°。收集斷層掃描數(shù)據(jù)，用Hiscan Analyzer software 進(jìn)行分析處理，Hiscan Reconstruct software 行三維重建成像，測(cè)量以下各項(xiàng)骨新生指標(biāo)：新生骨量（new bone volume，BV）、骨體積分?jǐn)?shù)（new bone volume/total bone volume，BV/TV）、骨表面積（bone surface，BS）、骨表面積組織體積比（bone surface/total bone volume，BS/TV）、骨礦物質(zhì)密度（bone mineral density，BMD）、骨小梁厚度（trabecular bone thickness，Tb.Th）、骨小梁間距（trabecular bone spacing，Tb.Sp）、骨小梁數(shù)量（number of trabecular bone，Tb.N）。

1.8 組織形態(tài)學(xué)分析

術(shù)后8 周顱骨取材用于研究各組大鼠顱骨缺損成骨情況，顱骨樣本浸泡于10%乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetra acetic acid，EDTA）脫鈣液緩慢脫鈣，經(jīng)酒精梯度脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后切片，依次行蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，H&E staining）、Goldner 染色和Van Gieson（VG）染色。同時(shí)取出大鼠心肝脾肺腎用于評(píng)估光固化水凝膠體內(nèi)生物相容性，心肝脾肺腎4%多聚甲醛固定后進(jìn)行H&E 染色。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用GraphPad Prism 9.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果中各項(xiàng)定量指標(biāo)均采用均值 ±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組數(shù)據(jù)比較使用雙因素方差分析（two-way ANOVA），P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 GelMA 水凝膠表征

圖2a 顯示了GelMA 在紫外光照射下的交聯(lián)過(guò)程。GelMA 水凝膠固化前呈較好的流動(dòng)性（圖2b），經(jīng)405 nm 紫外燈照射10 s 后迅速固化，流動(dòng)性消失（圖2c）。SEM 圖像觀察到固化的GelMA 內(nèi)部呈現(xiàn)3D 海綿狀大孔凝膠網(wǎng)絡(luò)（圖2d、2e），大孔形貌均勻，孔隙率為73.42 %，孔徑為（28.75 ± 7.13） μm（圖2f），空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣的運(yùn)輸以及細(xì)胞遷移。EDX 結(jié)果（圖2g ～ 2i）顯示C 和O 均勻分布在水凝膠的網(wǎng)狀大孔結(jié)構(gòu)上，合并圖像進(jìn)一步證實(shí)了兩個(gè)元素的均勻重疊。

Figure 2 Construction and characterization of the GelMA hydrogel圖2 GelMA 水凝膠的構(gòu)建及表征

2.2 GelMA 水凝膠機(jī)械性能

圖3a、3b 分別為GelMa 水凝膠的應(yīng)力-應(yīng)變曲線和力-位移曲線，結(jié)果顯示，10%的GelMA 水凝膠表現(xiàn)出較高的壓縮強(qiáng)度，當(dāng)縱向形變達(dá)到90%時(shí)，才會(huì)產(chǎn)生結(jié)構(gòu)破壞，壓縮強(qiáng)度高達(dá)152 kPa，賦予了其在臨界性骨缺損區(qū)應(yīng)用的可能性。此外，筆者也發(fā)現(xiàn)在水凝膠被壓縮的初始階段，曲線較為平緩，說(shuō)明其在較小的外力下就會(huì)產(chǎn)生較大的形變，而曲線的后段則較為陡峭，說(shuō)明在壓縮的后期需要較大的力才會(huì)使水凝膠繼續(xù)形變直至破碎。

Figure 3 Mechanical properties of the GelMA hydrogel圖3 GelMA 水凝膠的機(jī)械性能

2.3 BMSCs 的鑒定

采用全骨髓貼壁法提取大鼠BMSCs，圖4a～4c顯示體外培養(yǎng)BMSCs 細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，呈梭形或紡錘型。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)（圖4d～4g），所提取的大鼠BMSCs 表面抗原CD29 和CD90 呈陽(yáng)性，其陽(yáng)性表達(dá)率分別為98.9%和97.3%，CD45 和CD31呈陰性，其陽(yáng)性表達(dá)率分別為1.8%和1.7%，證明所提取的細(xì)胞為干細(xì)胞。

Figure 4 Extraction and identification of rat bone marrow mesenchymal stem cells圖4 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的提取與鑒定

2.4 BMSCs 在水凝膠中的活性

光固化GelMA 作為BMSCs 培養(yǎng)的支架，應(yīng)具有良好的組織相容性和促進(jìn)細(xì)胞增殖的能力。因此，將提取和鑒定完成的第4 代BMSCs 與GelMA 水凝膠充分混合，固化后進(jìn)行培養(yǎng)，并觀察第1、2、5 天的細(xì)胞生長(zhǎng)情況。圖5a 的活/死染色結(jié)果顯示，綠色熒光標(biāo)記的BMSCs 活細(xì)胞在培養(yǎng)第1 天多呈卵圓形，部分細(xì)胞可見(jiàn)突起；第2 天細(xì)胞形態(tài)更加鋪展，細(xì)胞呈紡錘狀或梭形；第5 天，細(xì)胞數(shù)量明顯增多，視野中可見(jiàn)大量綠色熒光，值得注意的是，在細(xì)胞培養(yǎng)的過(guò)程中，可以被PI 染色呈現(xiàn)紅色熒光的死細(xì)胞始終未見(jiàn)增多。此外，用CCK-8 對(duì)細(xì)胞增殖情況進(jìn)行了定量分析（圖5b），在第5 天，BMSCs 出現(xiàn)了159.4%的增殖，細(xì)胞數(shù)量與第1 天相比明顯增多（P= 0.048）。以上結(jié)果說(shuō)明，GelMA光固化水凝膠在體外與細(xì)胞共培養(yǎng)并不會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，相反，其具有一定的促進(jìn)BMSCs 活性和增殖的作用。

Figure 5 Cell viability of BMSCs cultured with GelMA hydrogels for 1, 2, and 5 days圖5 BMSCs 與GelMA 水凝膠培養(yǎng)1、2、5 d 的細(xì)胞活性

2.5 大鼠顱骨缺損模型的建立和治療結(jié)果

大鼠顱骨臨界性缺損模型手術(shù)操作過(guò)程如圖6a～6d 所示，在大鼠顱骨中縫兩側(cè)制備直徑為5 mm的全層骨膜骨質(zhì)缺損，實(shí)驗(yàn)組3 只大鼠滴加GelMA/BMSCs 水凝膠溶液20 μL，紫外燈下光照，逐層縫合關(guān)閉創(chuàng)口，對(duì)照組3 只大鼠的骨缺損不做任何處理，6 只SD 大鼠均存活至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)。大鼠術(shù)后4、8 周顱骨Micro-CT 結(jié)果如圖6e ～ 6h 所示。術(shù)后4 周，對(duì)照組的骨缺損幾乎無(wú)修復(fù)，僅邊緣見(jiàn)極少量新骨形成；實(shí)驗(yàn)組GelMA/BMSCs 水凝膠組可見(jiàn)骨缺損內(nèi)部有大量新骨生成，缺損范圍顯著減小。術(shù)后8 周，對(duì)照組缺損較4 周時(shí)無(wú)明顯改變；實(shí)驗(yàn)組經(jīng)GelMA/BMSCs 治療后，骨缺損區(qū)近乎被骨結(jié)構(gòu)完全充填，缺損區(qū)一側(cè)僅留下細(xì)小狹長(zhǎng)的骨缺損間隙。

Figure 6 Establishment of a skull defect model in SD rats and Micro-CT imaging analysis after treatment圖6 SD 大鼠顱骨缺損模型建立和治療后Micro-CT 影像學(xué)分析

對(duì)Micro-CT 進(jìn)行量化分析的結(jié)果（圖7）顯示，GelMA/BMSCs治療可以有效促進(jìn)骨再生。術(shù)后4周，GelMA/BMSCs 組BV、BV/TV、BS、BS/TV 值均顯著高于對(duì)照組（BV：P= 0.013；BV/TV：P＜0.001；BS：P＜0.001；BS/TV：P＜0.001）；同樣，術(shù)后8周， GelMA/BMSCs 組BV、BV/TV、BS、BS/TV 值也顯著高于對(duì)照組（BV：P= 0.004；BV/TV：P＜0.001；BS：P＜0.001，BS/TV：P＜0.001）。BMD 和Tb.Th 值在兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；兩組的Tb.Sp 和Tb.N在4 周時(shí)無(wú)明顯區(qū)別（P＞0.05），但8 周時(shí)GelMA/BMSCs組Tb.Sp顯著低于對(duì)照組（P= 0.045），而Tb.N顯著高對(duì)照組（P= 0.049）。大鼠顱骨缺損區(qū)新生骨的量化數(shù)據(jù)進(jìn)一步驗(yàn)證了GelMA/BMSCs 組修復(fù)水平顯著優(yōu)于對(duì)照組。

Figure 7 Quantitative analysis of micro-CT images after treatment in SD rats圖7 SD 大鼠顱骨缺損治療術(shù)后Micro-CT 圖像的定量分析

2.6 缺損區(qū)組織形態(tài)學(xué)分析

組織形態(tài)學(xué)染色結(jié)果顯示了與顱骨缺損影像學(xué)分析相似的趨勢(shì)（圖8），紅色箭頭指示了疏松的結(jié)締組織，黃色箭頭標(biāo)志礦化的骨組織。H&E 染色結(jié)果顯示對(duì)照組僅缺損邊緣出現(xiàn)少量新生骨質(zhì)，缺損中央廣泛分布纖維結(jié)締組織；而GelMA/BMSCs 組呈現(xiàn)大量新生骨。在Goldner 染色中，骨小梁、皮質(zhì)骨等成熟礦化骨呈綠色，類骨質(zhì)呈橙紅色，膠原纖維呈綠色。結(jié)果顯示對(duì)照組大量纖維結(jié)締組織大量浸潤(rùn)，GelMA/BMSCs 組缺損區(qū)中央可見(jiàn)不成熟的類骨質(zhì)，邊緣則呈現(xiàn)明顯的板層骨轉(zhuǎn)變。VG 染色也呈現(xiàn)出與H&E 染色和Goldner 染色一樣的結(jié)果。

Figure 8 Histopathological analysis of skull defects in SD rats at the 8th week after the operation圖8 術(shù)后8 周 SD 大鼠顱骨缺損區(qū)組織病理學(xué)分析

第8 周取出的大鼠心肝脾肺腎H&E 染色結(jié)果顯示GelMA/BMSCs 組大鼠主要臟器均無(wú)明顯組織學(xué)異常（圖9），無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，與對(duì)照大鼠相比無(wú)明顯差異，證明GelMA/BMSCs 水凝膠對(duì)機(jī)體無(wú)明顯組織毒性，具有良好的生物相容性。

Figure 9 H&E staining of the heart, liver, spleen, lung, and kidney in rats圖9 大鼠心肝脾肺腎H&E 染色

3 討 論

骨修復(fù)是一個(gè)復(fù)雜而漫長(zhǎng)的生理過(guò)程，組織工程為骨再生提供了新材料和新思路，其中支架和細(xì)胞的構(gòu)建對(duì)組織工程具有關(guān)鍵意義［12］。為了進(jìn)一步推動(dòng)組織工程在骨再生領(lǐng)域的應(yīng)用，本研究設(shè)計(jì)合成了一種具有紫外光響應(yīng)固化特性的GelMA/BMSCs 復(fù)合水凝膠，通過(guò)SEM 以及體外試驗(yàn)檢測(cè)其理化性能，并通過(guò)SD 大鼠顱骨臨界骨缺損模型評(píng)價(jià)其對(duì)骨修復(fù)的影響。GelMA 水凝膠具有良好的流動(dòng)性，可通過(guò)注射器注入缺損區(qū)進(jìn)而有效彌補(bǔ)缺損而不受骨缺損形態(tài)的限制，在缺損區(qū)成型后可以為BMSCs 增殖分化以及骨組織再生提供適宜的空間環(huán)境。研究結(jié)果顯示，GelMA/BMSCs 組中新生骨量顯著多于對(duì)照組，其表層骨完整，骨小梁結(jié)構(gòu)更加成熟，骨壁增厚，更接近正常組織。因此，GelMA/BMSCs 復(fù)合水凝膠具有出色的骨誘導(dǎo)、骨引導(dǎo)和骨整合能力，表現(xiàn)出更優(yōu)越的成骨活性，在大鼠顱骨臨界缺損模型中顯著促進(jìn)了骨修復(fù)。

骨組織工程是將種子細(xì)胞接種于具有生物活性的支架材料上，隨后將細(xì)胞生物材料復(fù)合物移植入骨缺損部位，支架材料在體內(nèi)逐漸降解吸收并被新骨替代，從而實(shí)現(xiàn)骨組織缺損修復(fù)［13］。組織工程骨材料來(lái)源充足，具備優(yōu)秀的生物相容性、良好的骨傳導(dǎo)能力以及快速形成新生骨等特點(diǎn)，因而具有廣闊應(yīng)用前景［14-15］，其中，水凝膠是近來(lái)廣受關(guān)注的一種支架材料。Van Den Bulcke 等［16］于2000 年首次合成了GelMA 水凝膠，它是將甲基丙烯酸共價(jià)接枝于膠原水解后產(chǎn)物—明膠而得到的一種半人工合成的水凝膠網(wǎng)絡(luò)大分子。該水凝膠不僅具有明膠的RGD 序列和基質(zhì)金屬蛋白酶底物，有助于細(xì)胞黏附和材料降解，還具有優(yōu)異的生物相容性和光敏性，理化性能靈活可調(diào)，易于與多種材料結(jié)合成為復(fù)合支架材料［17-18］。

在組織工程設(shè)計(jì)中，細(xì)胞來(lái)源一直是一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題。不合理的細(xì)胞組分可能導(dǎo)致植入后免疫反應(yīng)增強(qiáng)，在支架周圍形成纖維囊，從而導(dǎo)致植入失?。?9］。為避免植入后的過(guò)度免疫反應(yīng)，通常會(huì)選擇具有較高生物活性和較低免疫原性的同物種原代細(xì)胞［20］。近年來(lái)，干細(xì)胞移植治療作為一種極具潛力的促進(jìn)組織修復(fù)再生的技術(shù)而備受關(guān)注。BMSCs 是一類起源于中胚層的成體干細(xì)胞，具有自我更新及多向分化潛能，在干細(xì)胞技術(shù)中得到廣泛應(yīng)用［21］，且目前已建立了臨床級(jí)細(xì)胞系和臨床研究管理規(guī)范，有望較早實(shí)現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化，多項(xiàng)動(dòng)物和臨床研究均表明BMSCs 移植治療對(duì)骨缺損治療效果良好［22-25］。因此，筆者將BMSCs 包封在GelMA 水凝膠，可以實(shí)現(xiàn)更優(yōu)異的成骨效果。動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果顯示，組織工程支架植入顱骨缺損4周和8 周時(shí)，GelMA/BMSCs 組的BV、BV/TV、BS、BS/TV 值均顯著高于對(duì)照組，3D 重建的Micro-CT 影像也直觀展示了GelMA/BMSCs 治療組促成骨能力。

BMSCs 的增殖和分化能力是促進(jìn)骨組織再生的關(guān)鍵，研究表明，BMSCs 的增殖和分化可能受到支架機(jī)械性能的影響［26］。適當(dāng)硬度的水凝膠不僅能促進(jìn)MSCs 新陳代謝和自我更新，還能引導(dǎo)其向特定細(xì)胞系分化。在本研究中，筆者使用了萬(wàn)能測(cè)試儀評(píng)估了GelMA 的壓縮強(qiáng)度，結(jié)果顯示GelMA 壓縮強(qiáng)度為152 kPa，基質(zhì)剛度的增加導(dǎo)致細(xì)胞骨架張力增加，進(jìn)而使得細(xì)胞核變大，這也與筆者拍攝的熒光染色細(xì)胞結(jié)構(gòu)圖像相符。

作為一種可光固化的水凝膠，GelMA 的特性和功能可通過(guò)紫外線輻射來(lái)調(diào)節(jié)。在影響凝膠力學(xué)性能的因素中，與輻射有關(guān)的參數(shù)如強(qiáng)度、曝光時(shí)間和光引發(fā)劑濃度等被視作決定水凝膠性能的重要外部控制因素［27-28］。研究發(fā)現(xiàn)，GelMA 水凝膠的力學(xué)性能受光引發(fā)劑的種類和濃度的影響較大［1］。本研究選用生物相容性優(yōu)異的LAP 作為光引發(fā)劑。有學(xué)者研究對(duì)比LAP、IC2959 和2，2’-偶氮［2-甲基-N-（2-羥基乙基）丙酰胺］（VA086）對(duì)GelMA和透明質(zhì)酸甲基丙烯酸酯復(fù)合水凝膠（GelMA/HAMA）進(jìn)行機(jī)械壓縮試驗(yàn)，結(jié)果表明VA086 水凝膠模量較低，LAP 水凝膠模量較高。在較短的交聯(lián)時(shí)間內(nèi)，IC-2959 和VA086 均未能形成穩(wěn)定的水凝膠，而LAP 則通過(guò)交聯(lián)形成穩(wěn)定的水凝膠［29］。以上結(jié)果與本研究結(jié)果一致，合成的GelMA/BMSCs 水凝膠在10 mW/cm2的紫外燈下反應(yīng)10 s 即可迅速定型，形成具有網(wǎng)格狀空隙結(jié)構(gòu)的水凝膠，這不僅保證了水凝膠的性能，又確保了臨床操作的便利性。

4 結(jié) 論

本研究制備的GelMA/BMSCs 光固化水凝膠復(fù)合支架具有良好生物相容性，其促成骨效果顯著，為臨床臨界性骨缺損的修復(fù)提供了一種新的生物材料，具有良好的轉(zhuǎn)化前景。

【Author contributions】Ding M and Li Q performed the experiments and wrote the article.Li XY, He A, Dai Z, Dong H performed the experiments, analyzed the data, revised the article.Mou YB designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.