潘冬梅，楊傳倫，張心青，李 杰，李大鵬，韓立霞，馮文娟，和富明，傅英旬，翟 嬌，成魯南，李丙祥

（1.黃河三角洲京博化工研究院有限公司，山東濱州 256500；2.山東博華高效生態(tài)農(nóng)業(yè)科技有限公司，山東濱州 256500；3.山東京博控股集團(tuán)有限公司，山東濱州 256500）

益生菌微生態(tài)制劑是全面禁抗環(huán)境下產(chǎn)生的一種新型綠色添加劑，能有效維持胃腸道微生態(tài)平衡，改善微生物種類（劉瀟，2018），提高消化吸收，并具有無(wú)殘留、無(wú)毒副作用的優(yōu)點(diǎn)（Lokapirnasari 等，2019）。釀酒酵母是常用的益生菌微生態(tài)制劑，可降低家畜瘤胃中的氧氣（Gao等，2017），利于有益菌的繁殖，提高飼料消化率，改善家畜健康狀態(tài)和生產(chǎn)性能（He 等，2019）。目前涉及釀酒酵母作為益生菌微生態(tài)制劑的研究較多。

Thrune 等（2020）研究發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母的重要作用之一是減緩瘤胃家畜pH 的下降，從而保持瘤胃健康，提高家畜生產(chǎn)性能。牛建康等（2021）研究結(jié)果顯示，添加釀酒酵母的奶牛瘤胃pH 為6.22 ～6.27，處于正常范圍且波動(dòng)較小。Chaucheyras-Durand 和Fonty（2022）、Marden等（2021）多項(xiàng)研究表明，釀酒酵母可以降低瘤胃家畜的氧化還原電勢(shì)，有利于提高并促進(jìn)厭氧微生物的活性。Ding 等（2019）研究表明，釀酒酵母可提高瘤胃微生物豐度。金鑫（2019）研究發(fā)現(xiàn)，酵母細(xì)胞壁（Yeast cell wall，YCW）由β- 葡聚糖和甘露聚糖兩種主要功能成分組成，可以作為免疫調(diào)節(jié)因子提高家畜免疫力。Bose 等（2022）、Brown 等（2021）研究表明，β- 葡聚糖可與巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等表面受體結(jié)合，從而刺激機(jī)體 免 疫 系 統(tǒng)。Machová 和Bystricky（2022）、Cheng 等（2020）研究發(fā)現(xiàn)，甘露聚糖具有良好的免疫原性、抗氧化性及抗炎等功能。

近年來(lái)，人們利用微生物發(fā)酵技術(shù)為基礎(chǔ)獲得釀酒酵母益生菌微生態(tài)制劑（趙小麗等，2014），已取得一定進(jìn)展。微生物的培養(yǎng)條件（如培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)基初始pH、菌齡、接種量等）在很大程度上影響釀酒酵母的發(fā)酵水平（李聰，2014），關(guān)乎釀酒酵母作為益生菌微生態(tài)制劑的應(yīng)用成本。王穎等（2007）報(bào)道，通過(guò)優(yōu)化釀酒酵母S.cerevisiae高密度培養(yǎng)條件優(yōu)化，溫度30℃、轉(zhuǎn)速150 r/min，菌液最高OD600值和細(xì)胞密度分別達(dá)15.82 和2.03×108CFU/mL。宋志元等（2015）報(bào)道表面，通過(guò)優(yōu)化釀酒酵母發(fā)酵條件，初始pH值6.0，裝液量75 mL/500 mL，接種量5.0%，振蕩速率180 r/min，發(fā)酵溫度30℃，釀酒酵母活菌數(shù)達(dá)到5.8×108CFU/mL。

為進(jìn)一步改善釀酒酵母的培養(yǎng)條件，提高菌體產(chǎn)量，降低應(yīng)用成本。本試驗(yàn)在前期釀酒酵母培養(yǎng)基優(yōu)化基礎(chǔ)上采用單因素試驗(yàn)篩選釀酒酵母培養(yǎng)條件，再以釀酒酵母菌體干質(zhì)量（dry cell mass，DCM）為響應(yīng)值，利用響應(yīng)面法對(duì)釀酒酵母培養(yǎng)基條件進(jìn)行優(yōu)化，為釀酒酵母生產(chǎn)提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)菌種 釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）由本實(shí)驗(yàn)室篩選保藏。

1.1.2 試劑 葡萄糖、硫酸銨、磷酸氫二鉀、氯化鈣、硫酸鎂、硫酸鋅、硫酸錳、維生素B1、維生素B7（分析純或生化試劑）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；糖蜜（工業(yè)生產(chǎn)用）、酵母抽提物（分析純或生化試劑）：安琪酵母股份有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基（g/L）（陳雪等，2014）：葡萄糖20、蛋白胨20、酵母粉10，121℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖48、糖蜜50、酵母抽提物78、硫酸銨2、磷酸氫二鉀3、氯化鈣0.1、硫酸鋅0.05、硫酸錳0.05、維生素B10.1、維生素B70.1，121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備 XY-1B/2C 電子天平：江蘇省常州市Xingyun ；405-60-SC 型精密pH 計(jì)：梅特勒；BKQ-Z301 立式壓力蒸汽滅菌器：山東博科集團(tuán)；SW-CJ-2G 型超凈工作臺(tái)：聚創(chuàng)環(huán)保設(shè)備有限公司；HZQ-QD 型恒溫恒濕振蕩培養(yǎng)箱：蘇州威爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 試驗(yàn)方法

（1）種子液制備：挑取1 環(huán)釀酒酵母菌株的新鮮斜面接種于100 mL YPD 培養(yǎng)基 中，28 ℃，180 r/min 條 件 下 震 蕩 培 養(yǎng)16 h（OD600nm=1.2 ～1.4）。

（2）發(fā)酵方法：將菌齡為16 h 種子液，按5%接種于裝有100 mL 初始pH 為7.0 發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃，180 r/min 條件下震蕩培養(yǎng)48 h，檢測(cè)酵母菌體干質(zhì)量。

（3）酵母菌體干質(zhì)量（dry cell mass，DCM）的測(cè)定（Xu 等，2016）：酵母發(fā)酵液6000 r/min離心5 min，用蒸餾水洗滌菌體2 次，105℃烘干至質(zhì)量恒定。

1.3.2 釀酒酵母培養(yǎng)條件優(yōu)化

（1）單因素試驗(yàn) 培養(yǎng)溫度篩選：將菌齡為16 h 種子液，按5% 的接種量、接種于初始pH 為7.0 滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵溫度分別為22、24、26、28、30℃，180 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)48 h后檢測(cè)酵母菌體干質(zhì)量。

培養(yǎng)時(shí)間篩選：將菌齡為16 h 種子液，按5%的接種量接種于初始pH 為7.0 滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)基中，按已確定培養(yǎng)溫度，180 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)時(shí)間分別為24、48、72、96、120 h 后檢測(cè)酵母菌體干質(zhì)量。

培養(yǎng)基初始pH 篩選：將菌齡為16 h 種子液，按5% 的接種量接種于初始pH 分別為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5 滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)基中，按已確定發(fā)酵溫度，180 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)已確定時(shí)間后，檢測(cè)酵母菌體干質(zhì)量。

菌 齡 篩 選：將 菌 齡 分 別 為8、12、16、20、24 h 種子液，按5% 的接種量接種于已確定初始pH 滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)基中，按已確定發(fā)酵溫度，180 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)已確定時(shí)間后檢測(cè)酵母菌體干質(zhì)量。

（2）響應(yīng)面試驗(yàn) 根據(jù)釀酒酵母培養(yǎng)條件單因素優(yōu)化結(jié)果，選擇對(duì)酵母菌體干質(zhì)量影響較大的培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)基初始pH、菌齡4 個(gè)因素，采用Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)作響應(yīng)面試驗(yàn)（WANG 等，2015），試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平

2 結(jié)果與分析

2.1 釀酒酵母培養(yǎng)條件單因素試驗(yàn)

2.1.1 培養(yǎng)溫度試驗(yàn) 釀酒酵母培養(yǎng)溫度不同，生長(zhǎng)速率也不同，在合適的溫度下酵母菌體干質(zhì)量積累多。由圖1 可知，在培養(yǎng)溫度為24℃時(shí)，酵母菌體干質(zhì)量最高，為24.10 g/L；當(dāng)培養(yǎng)溫度為24 ～30℃時(shí)，酵母菌體干質(zhì)量隨溫度升高而下降，可能高溫加速了酵母菌體的衰亡，導(dǎo)致酵母菌體干質(zhì)量降低（鄒艷等，2017）。因此，釀酒酵母最適培養(yǎng)溫度為24℃。

圖1 不同培養(yǎng)溫度對(duì)酵母菌體干質(zhì)量的影響

2.1.2 培養(yǎng)時(shí)間試驗(yàn) 由圖2 可知，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為24 ～72 h 時(shí)，酵母菌體干質(zhì)量隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而增高；培養(yǎng)時(shí)間為72 h 時(shí)，酵母菌體干質(zhì)量最高，為27.34 g/L；當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為72 ～120 h 時(shí)，酵母菌體干質(zhì)量有所下降。因此，釀酒酵母最適培養(yǎng)時(shí)間為96 h。

圖2 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)酵母菌體干質(zhì)量的影響

2.1.3 培養(yǎng)基初始pH 試驗(yàn) 由圖3 可知，培養(yǎng)基初始pH 為6.5 時(shí)酵母菌體干質(zhì)量最高，為28.67 g/L，pH 偏低或偏高都不利于酵母菌體的生長(zhǎng)。因此，釀酒酵母最適培養(yǎng)基初始pH 為6.5。

圖3 不同培養(yǎng)基初始pH 對(duì)酵母菌體干質(zhì)量的影響

2.1.4 菌齡試驗(yàn) 菌齡代表種子液的培養(yǎng)時(shí)間，種子液在對(duì)數(shù)期轉(zhuǎn)接發(fā)酵瓶，菌種生理代謝最強(qiáng)，不同菌齡對(duì)酵母菌體干質(zhì)量的影響結(jié)果見(jiàn)圖4，當(dāng)菌齡為12 h 時(shí)，酵母菌體干質(zhì)量最高，為29.31 g/L，種子液處在對(duì)數(shù)期。因此，釀酒酵母最適菌齡為12 h。

通過(guò)釀酒酵母培養(yǎng)條件單因素試驗(yàn)優(yōu)化，釀酒酵母在培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度24℃、培養(yǎng)時(shí)間96 h、培養(yǎng)基初始pH6.5、菌齡12 h 時(shí)，酵母菌體干質(zhì)量最高為29.56 g/L。

2.2 釀酒酵母培養(yǎng)條件響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 Box-Benhnken 試驗(yàn)結(jié)果與分析 根據(jù)釀酒酵母培養(yǎng)條件單因素優(yōu)化結(jié)果選擇對(duì)酵母菌體干質(zhì)量影響較大的培養(yǎng)溫度（A）、培養(yǎng)時(shí)間（B）、培養(yǎng)基初始pH（C）、菌齡（D）為自變量，酵母菌體干質(zhì)量（R）為響應(yīng)值，運(yùn)用Box-Benhnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)29 組試驗(yàn)。設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

表3 回歸模型方差分析

所得的多元二次回歸方程為：

由表3 可知，模型相關(guān)系數(shù)R2=0.9614，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.9227，模 型P值＜0.0001，模型顯著；失擬項(xiàng)P值0.0562 ＞0.05，失擬項(xiàng)不顯著，表明模型可用于分析釀酒酵母的培養(yǎng)條件試驗(yàn)結(jié)果（Marek 等，2016）。由P值可知，一次項(xiàng)A，交互項(xiàng)CD，二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2對(duì)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），其他項(xiàng)對(duì)結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。由F 值可知，4 個(gè)因素對(duì)酵母菌體干質(zhì)量影響由大到小順序?yàn)椋号囵B(yǎng)溫度（A）＞培養(yǎng)基初始pH（C）＞菌齡（D）＞培養(yǎng)時(shí)間（B）。

圖5 為根據(jù)多元二次回歸方程繪制培養(yǎng)基初始pH（C）和菌齡（D）交互作用的三維響應(yīng)面圖。由圖6 可知，酵母菌體干質(zhì)量隨著培養(yǎng)基初始pH（C）和菌齡（D）兩者均呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，C、D 交互作用響應(yīng)面較為陡峭，等高線橢圓程度較為明顯，對(duì)酵母菌體干質(zhì)量的影響極顯著（P＜0.01）（Kieliszek 等，2015）。根據(jù)二次回歸方程得到釀酒酵母最優(yōu)培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度23.74℃、培養(yǎng)時(shí)間71.44 h、培養(yǎng)基初始pH 6.53、菌齡12.11 h 時(shí)，酵母菌體干質(zhì)量最高為29.72 g/L。

圖5 培養(yǎng)基初始pH 和菌齡交互作用對(duì)酵母菌體干質(zhì)量影響的響應(yīng)面

2.2.2 模型驗(yàn)證 為了方便操作，將釀酒酵母培養(yǎng)條件修正為：培養(yǎng)溫度23.5 ℃、培養(yǎng)時(shí)間71.5 h、培養(yǎng)基初始pH 6.5、菌齡12 h。在此條件下進(jìn)行3 次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，酵母菌體干質(zhì)量平均值為（29.70±0.04）g/L，與預(yù)測(cè)值基本一致，說(shuō)明模型可以較好地反映出酵母菌體干質(zhì)量與培養(yǎng)條件變化關(guān)系的趨勢(shì)（李莉等，2015）；同時(shí)，用釀酒酵母最優(yōu)培養(yǎng)條件發(fā)酵較優(yōu)化前提高了33.12%。

3 結(jié)論

本研究取釀酒酵母菌體干質(zhì)量培養(yǎng)的重要條件進(jìn)行單因素試驗(yàn)，篩選4 個(gè)重要影響因素，根據(jù)Box-Behnken 設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，得出釀酒酵母最優(yōu)培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度23.5℃、培養(yǎng)時(shí)間71.5 h、培養(yǎng)基初始pH 6.5、菌齡12 h。在最優(yōu)培養(yǎng)條件下，酵母菌體干質(zhì)量達(dá)到（29.70±0.04）g/L，較優(yōu)化前提高33.12%。