張晏銘 韓玉玲 馬延龍 張小雪

摘要：MAX二聚化蛋白3（MAX dimerization protein 3， MXD3）在腫瘤的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起重要作用，廣泛存在于多種動(dòng)物體內(nèi)。為探究MXD3基因在綿羊體內(nèi)的功能，運(yùn)用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)及其軟件，分析了該基因及其編碼的產(chǎn)物。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，綿羊MXD3基因總共編碼了206個(gè)氨基酸殘基，所編碼的蛋白質(zhì)分子式為C1000H1650N332O315S6，分子質(zhì)量為23 556.50 KDa，理論等電點(diǎn)pI為9.32，半衰期為30 h，不穩(wěn)定指數(shù)為88.30。通過基本理化性質(zhì)分析可知，綿羊MXD3主要在細(xì)胞核發(fā)揮作用，不屬于分泌蛋白，不存在信號(hào)肽序列，不存在跨膜結(jié)構(gòu)，是親水性蛋白。該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要是以無(wú)規(guī)卷曲、α螺旋組成，而三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果與二級(jí)結(jié)構(gòu)相符。

關(guān)鍵詞：綿羊；MXD3基因；生物信息學(xué)分析

中圖分類號(hào)：S826? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ? ? ? ? ? 文章編號(hào)：2097-2172（2024）03-0217-05

doi：10.3969/j.issn.2097-2172.2024.03.005

Bioinformatics Analysis of Ovine MXD3 Gene

ZHANG Yanming， HAN Yuling， MA Yanlong， ZHANG Xiaoxue

（College of Animal Science and Technology， Gansu Agriculture University， Lanzhou Gansu 730070， China）

Abstract： MAX dimerized protein 3（MXD3） gene plays an important role in tumor proliferation， apoptosis， invasion and metastasis， which is widely present in a variety of animals. In order to explore the function of MXD3 gene in sheep， bioinformatics analysis of MXD3 gene and its encoded products was conducted by using bioinformatics databases and software. The results showed that MXD3 gene encoded 206 amino acid residues， the protein molecular formula was C1000H1650N332O315S6， the molecular weight was? 23 556.50 KDa， isoelectric point pI was 9.32， the half-life was 30 h， and the instability index was 88.30. Sheep MXD3 protein subcells were mainly located in nucleus， which was not a secreted protein and therefore no signal peptide sequence was detected. No transmembrane structure was found and was regarded as a hydrophilic protein. The secondary structure of the protein was composed of random coil and α helix， and the predicted results of tertiary structure were consistent with the secondary structure.

Key words： Sheep; MXD3 gene; Bioinformatics analysis

MXD3基因是Mad基因家族的一員，MXD3基因的轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)在細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮一定作用。研究發(fā)現(xiàn)，人MXD3基因在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)要高于正常肝細(xì)胞中的表達(dá)，且高表達(dá)MXD3基因的肝細(xì)胞肝癌患者生存率低于低表達(dá)MXD3基因的肝細(xì)胞肝癌患者，表明MXD3是肝細(xì)胞肝癌的潛在生物學(xué)標(biāo)志物和獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)［1 ］。人MXD3基因在髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞中異常高表達(dá)， 在髓母細(xì)胞瘤生物發(fā)生、維持和增殖中起重要作用［2 - 5 ］。據(jù)相關(guān)報(bào)道，該基因的siRNA已被用于神經(jīng)母細(xì)胞瘤和急性B淋巴細(xì)胞白血病的治療，而且癌細(xì)胞的增殖明顯受其抑制［3 ］。MXD3基因在許多人類腫瘤中有表達(dá)，特別是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中最為顯著［4 ］。MXD3基因在小鼠成神經(jīng)管細(xì)胞瘤模型中也有表達(dá)，敲除MXD3基因后，會(huì)減少小鼠成神經(jīng)管細(xì)胞瘤的增生［6 ］。小鼠MXD3基因在小腦中的增殖作用及其在小腦腫瘤中的過表達(dá)一致。MXD3 基因在過渡性 IgD 中表達(dá)-脾臟中的B細(xì)胞，其表達(dá)在小鼠成熟過程中降低。因此，前體 B 細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病樣品中的高M(jìn)XD3基因水平可能反映了白血病細(xì)胞的不成熟性質(zhì)［5 ］。MXD3 基因在小鼠髓母細(xì)胞瘤模型表達(dá)水平增多，過多的MXD3蛋白與Max異二聚體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合DNA結(jié)合位點(diǎn)，抑制Myc蛋白的作用，由此致使細(xì)胞增殖失控和抑癌作用的下降［7 - 9 ］。目前，關(guān)于MXD3基因及其蛋白的結(jié)構(gòu)與功能的研究主要集中于人和小鼠，而對(duì)綿羊的研究很少。本文利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)等，結(jié)合生物信息學(xué)手段對(duì)綿羊MXD3 基因及其編碼產(chǎn)物理化性質(zhì)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、生物學(xué)功能等進(jìn)行了研究，以探究該基因及其編碼產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)與生物學(xué)功能。

1? ?材料與方法

1.1? ?序列來源

數(shù)據(jù)資料來源于NCBI網(wǎng)站的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，其中包括綿羊（XM_042250364.2， XP_042106298.1）、人（NM_000044.6， NP_000035.2）、兔子（XM_00271 0426.4， XP_002710472.1）、狗（XM_038663261.1，XP_038519189.1）、牛（NM_001193259.1， NP_0011 80188.1）、豬（NM_001244104.1， NP_001231033.1）、馬（XM_023617137.1， XP_023472905.1）、山羊（XM_ 018050624.1，XP_017906113.1）等8個(gè)物種的mRNA序列與氨基酸序列。括號(hào)內(nèi)為GenBank登錄號(hào)。

1.2? ?方法

采用NCBI的ORF Finder程序分析綿羊MXD3基因的開放閱讀框，使用Bioedit及ProtParam軟件分析綿羊MXD3基因的理化性質(zhì)，通過PSORTⅡ軟件預(yù)測(cè)綿羊MXD3蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位，選擇SignalP 3.0軟件預(yù)測(cè)綿羊MXD3蛋白潛在信號(hào)肽剪切位點(diǎn)，采用TMHMM程序預(yù)測(cè)綿羊MXD3蛋白跨膜螺旋區(qū)域，通過Smart軟件分析綿羊MXD3蛋白保守結(jié)構(gòu)域，使用Prot Scale在線工具分析綿羊MXD3蛋白親疏水性，采用Jpred軟件預(yù)測(cè)綿羊MXD3蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，通過Swiss-model在線軟件預(yù)測(cè)綿羊MXD3蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)，采用DNAMAN軟件分析多序列比對(duì)及同源性［10 - 17 ］。

2? ?結(jié)果與分析

2.1? ?綿羊MXD3基因開放閱讀框分析

對(duì)開放閱讀框分析得知（圖1），綿羊MXD3基因中含有1個(gè)最長(zhǎng)621 bp的 ORF，起始密碼子位于604 bp處，終止密碼子位于1 224 bp處，編碼了206個(gè)氨基酸殘基。

2.2? ?綿羊MXD3基因編碼產(chǎn)物理化性質(zhì)分析

蛋白質(zhì)的基本性質(zhì)包括相對(duì)分子質(zhì)量、氨基酸組成、親水性平均值、等電點(diǎn)等。采用Prot- Param和 Bioedit軟件對(duì)綿羊MXD3基因編碼產(chǎn)物的理化性質(zhì)分析可知，綿羊MXD3基因分子式為C1000H1650N332O315S6，編碼206個(gè)氨基酸殘基，相對(duì)分子質(zhì)量為23 556.50 KDa，理論等電點(diǎn)pI為9.32。該蛋白共含31個(gè)負(fù)電荷殘基數(shù)（Asp+Glu）、36個(gè)正電荷殘基數(shù)（Arg+Lys）。其氨基酸組如圖2所示。其中Arg（精氨酸）和Leu（亮氨酸）含量最高，所占比例為13.59%； Trp（蛋氨酸）含量最少，所占比例為1.20%。該基因編碼產(chǎn)物半衰期為30 h，不穩(wěn)定指數(shù)為88.30，屬于不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。

2.3? ?綿羊MXD3蛋白亞細(xì)胞定位

通過PSORTⅡ軟件預(yù)測(cè)得知，綿羊MXD3基因編碼蛋白的亞細(xì)胞分布于細(xì)胞核的可能性最大（69.6%），分布于細(xì)胞骨架的可能性次之（13.0%），分布于高爾基體、細(xì)胞質(zhì)、質(zhì)膜、分泌囊泡系統(tǒng)的可能性最小（4.3%）。由此推斷，綿羊MXD3基因主要在細(xì)胞核中發(fā)揮生物學(xué)作用，其次在細(xì)胞骨架中發(fā)揮作用。

2.4? ?不同物種MXD3蛋白的同源性分析

采用DNAMAN軟件將人和綿羊、兔子、牛、狗、山羊、豬、馬7個(gè)動(dòng)物的氨基酸序列進(jìn)行序列比對(duì)。結(jié)果表明，MXD3氨基酸序列在物種間的表達(dá)相對(duì)保守，山羊和綿羊的同源性趨于一致，為100%；牛與綿羊同源性次之，為98%；豬和馬僅與綿羊同源性有少量不同，均為95%；兔子與綿羊同源性為91%；狗與綿羊同源性更低，為86%；而人和其余7種動(dòng)物的同源性最低，為17%（圖3、圖4）。

2.5? ?綿羊MXD3蛋白潛在信號(hào)肽剪切位點(diǎn)預(yù)測(cè)

通過SignalP 3.0軟件對(duì)綿羊MXD3蛋白分析可知，綿羊MXD3基因編碼產(chǎn)物的原始剪切位點(diǎn)（C值）、綜合剪切位點(diǎn)估計(jì)值（Y值）、 信號(hào)肽位點(diǎn)估計(jì)值（S值）分別在第26位、第3位、第1位，最大值分別為0.124、0.037、0.217（圖5）。由此推測(cè)，綿羊MXD3基因編碼產(chǎn)物不存在信號(hào)肽，是非分泌性蛋白，為不具跨膜區(qū)域的非跨膜蛋白。

2.6? ?綿羊MXD3蛋白跨膜螺旋結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

通過TMHMM Server v.2.0在線軟件進(jìn)行分析表明，綿羊MXD3基因編碼產(chǎn)物在膜外無(wú)任何序列，該蛋白無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)，為非跨膜蛋白（圖6）。

2.7? ?綿羊MXD3蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

結(jié)構(gòu)域的位置位于超二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，有獨(dú)特的空間構(gòu)象，是蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的基本單位。保守結(jié)構(gòu)域是基因的核心，有重要的功能。采用Smart軟件對(duì)綿羊MXD3蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析的結(jié)果（圖7、表1）表明，綿羊MXD3蛋白的第11～26位、第122～138位、第148～167位氨基酸殘基均為低復(fù)雜性區(qū)域（Low complexity region）。

2.8? ?綿羊MXD3蛋白親疏水性分析

通過Prot Scale軟件判斷綿羊MXD3蛋白親疏水性發(fā)現(xiàn)，綿羊MXD3蛋白疏水性在氨基酸第14位表現(xiàn)最大值1.667，在第46位表現(xiàn)最小值 -3.444，在0以下的氨基酸更加密集（x ＜ 0為親水性氨基酸），且|3.444| ＞ |1.667|（圖8），可知綿羊MXD3蛋白是親水性蛋白。

2.9? ?綿羊MXD3蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.9.1? ? 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)? ? 采用Jpred在線軟件對(duì)綿羊MXD3蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析預(yù)測(cè)（圖9）可知，α螺旋占比為39.32%，β折疊占比為5.34%，無(wú)規(guī)卷曲占比為55.34%，無(wú)規(guī)卷曲占主要地位。

2.9.2? ? 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)? ? 蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)（tertiary structure）是指多肽鏈借助各種作用力，其進(jìn)一步折疊卷曲成為復(fù)雜的球形分子。利用Swiss-model在線軟件對(duì)綿羊MXD3蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)空間構(gòu)象進(jìn)行預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，綿羊MXD3基因編碼蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)主要由無(wú)規(guī)卷曲與α螺旋折疊卷曲構(gòu)成（圖10）。

3? ?小結(jié)

綿羊MXD3基因中有1條全長(zhǎng)為621 bp的ORF，編碼206個(gè)氨基酸殘基。該蛋白分子質(zhì)量為23 556.50 KDa，亮氨酸、精氨酸含量最多，均為13.59%，理論等電點(diǎn)pI為9.32。綿羊MXD3基因編碼蛋白屬不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。亞細(xì)胞定位分析，綿羊MXD3基因主要在細(xì)胞核中發(fā)揮生物學(xué)作用，均為69.6%。綿羊MXD3基因的氨基酸序列與多種動(dòng)物高度相似。綿羊MXD3基因編碼產(chǎn)物中不存在信號(hào)肽，不是跨膜蛋白，也不是分泌性蛋白。綿羊MXD3蛋白為親水性蛋白。綿羊MXD3基因編碼產(chǎn)物的二級(jí)結(jié)構(gòu)由無(wú)規(guī)卷曲、α螺旋和β折疊構(gòu)成，其中無(wú)規(guī)卷曲占主要地位，三級(jí)結(jié)構(gòu)主要由無(wú)規(guī)卷曲和α螺旋折疊卷曲而成。MXD3基因在細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮一定作用，對(duì)于腫瘤增殖和癌癥患者中表達(dá)異常，對(duì)于腫瘤和癌癥預(yù)防，治療有重要意義，而其在小鼠和人相關(guān)方面研究較多，對(duì)于綿羊相關(guān)MXD3基因的相關(guān)研究有待進(jìn)一步探索。

參考文獻(xiàn)：

［1］ 王? ?宇．? MXD3在肝細(xì)胞肝癌中的表達(dá)及臨床意義［D］．? 荊州：長(zhǎng)江大學(xué)，2023．

［2］ BARISONE G A， NGO T， TRAN M， et al．? Role of MXD3 in proliferation of DAOY human medulloblastoma cells［J］.? PLoS One， 2012， 7（7）： e38508

［3］ BARISONE G A， SATAKE N， LEWIS C， et al．? Loss of MXD3 induces apoptosis of Reh human precursor B acute lymphoblastic leukemia cells［J］．? Blood Cells Mol Dis，? 2015， 54（4）： 329-335.

［4］ DUONG C， YOSHIDA S， CHEN C， et al．? Novel targeted therapy for neuroblastoma： silencing the MXD3 gene using siRNA［J］.? Pediatr Res， 2017， 82（3）： 527-535.

［5］ SATAKE N， DUONG C， CHEN C， et al．? Targeted therapy with MXD3 siRNA， anti-CD22 antibody and nanoparticles for precursor B-cell acute lymphoblastic leukaemia［J］. Br J Haematol， 2014， 167（4）： 487-499.

［6］ 郝? ?丹.? 三個(gè)黃牛品種生長(zhǎng)性狀選擇的Mxd3基因標(biāo)記研究［D］．? 楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2016．

［7］ 黃? ?艷，張艷亮，段? ?勇.? MXD3基因與腫瘤相關(guān)性的研究進(jìn)展［J］．? 實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2017，35（5）：635-637；641．

［8］ NAIR S K， BURLEY S K.? Structural Aspects of Interactions Within the Myc/Max/Mad Network［J］．? Curr Top Microbiol Immunol， 2006， 302： 123-143.

［9］ BERNHARD L？譈SCHER.? Function and regulation of the transcription factors of the Myc/Max/Mad network．［J］．? Gene， 2001， 277（1-2）： 1-14.

［10］ 張小雪，李發(fā)弟，王維民．? 綿羊ANXA10基因生物信息學(xué)分析［J］．? 甘肅農(nóng)業(yè)科技，2016（6）：1-4．

［11］ 劉? ?佳，王? ?禎，代友超，等．? 綿羊HTR4基因的生物信息學(xué)分析［J］．? 甘肅農(nóng)業(yè)科技，2020（10）：35-40．

［12］ 陳倩玲，何亞鵬，張引弟，等．? 綿羊RPS20基因的生物信息學(xué)分析［J］．? 甘肅農(nóng)業(yè)科技，2022，53（8）：39-43．

［13］ 李? ?娜，王維民，張德印，等．? 綿羊ADRA1B基因生物信息學(xué)分析［J］．? 甘肅農(nóng)業(yè)科技，2019（9）：42-48．

［14］ 張小雪，趙利明，劉? ?佳，等．? 綿羊ELOVL5基因的生物信息學(xué)分析［J］．? 甘肅農(nóng)業(yè)科技，2022，53（4）：24-29．

［15］ 陳占玉，黃永亮，王維民，等．? 綿羊HSPA1L基因的生物信息學(xué)分析［J］．? 甘肅農(nóng)業(yè)科技，2022，53（7）：83-88．

［16］ 靳澤希，馮? ?芬，鄧曉銀，等.? 綿羊NRCAM基因的生物信息學(xué)分析［J］.? 甘肅農(nóng)業(yè)科技，2020（12）：19-24.

［17］ 代淇佳，馬? ?博，謝? ?凡，等.? 綿羊ＡＮＯ５基因的生物信息學(xué)分析［J］.? 寒旱農(nóng)業(yè)科學(xué)，2024，3（1）：37-42.