葉智蓮，楊文武，況利平

(深圳市吉邇科技有限公司喜馬拉雅實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳 518000)

電子煙是指用于產(chǎn)生氣溶膠供人抽吸的電子傳輸系統(tǒng)[1]。電子煙煙液是配合電子煙煙具使用的霧化物，主要化學(xué)成分有煙堿、丙二醇、丙三醇及各類香精香料，不同風(fēng)味的煙液成分十分復(fù)雜[2-3]。甜味劑的應(yīng)用促進(jìn)了電子煙水果口味的發(fā)展，受到廣大電子煙消費(fèi)者的追捧[4]。為了克服單一甜味劑的局限性，一般采用甜味劑復(fù)配，起到增強(qiáng)甜味和風(fēng)味，彌補(bǔ)或掩蔽不良口味的作用[5]。甜味劑用量過(guò)大，電子煙煙液在霧化過(guò)程中會(huì)容易出現(xiàn)“糊味”，這與甜味劑的分子量大小、甜味劑純度、霧化溫度、霧化芯材料及結(jié)構(gòu)等因素相關(guān)[6]。合理使用甜味劑是安全的，不會(huì)對(duì)消費(fèi)者的健康產(chǎn)生風(fēng)險(xiǎn)，但超限量、超范圍，或者使用劣質(zhì)的人工合成甜味劑，會(huì)對(duì)消費(fèi)者的身體健康產(chǎn)生一定的負(fù)面影響[7-8]。過(guò)度攝入可能會(huì)出現(xiàn)皮膚問(wèn)題、情緒波動(dòng)、呼吸不暢，導(dǎo)致頭痛、癲癇、過(guò)敏等癥狀[9]。甜味劑經(jīng)過(guò)電子煙煙具霧化后產(chǎn)生的氣溶膠比傳統(tǒng)食品等經(jīng)口攝入方式更為復(fù)雜，因此甜味劑的選擇、使用劑量的安全檢測(cè)評(píng)估極為必要。

甜味劑的檢測(cè)方法有分光光度法、高效液相色譜法、離子色譜法、液相色譜-質(zhì)譜法和氣相色譜法等[10]。目前，電子煙煙液中多種甜味劑的檢測(cè)主要采取高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，如廖惠云等[11]采用SPE-HPLC-MS/MS同時(shí)測(cè)定電子煙煙液中9種甜味劑；楊飛等[12]采用UPLC-MS/MS同時(shí)測(cè)定電子煙煙液中安賽蜜等5種合成甜味劑。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀方法的儀器昂貴、維護(hù)成本高。HPLC-ELSD不需要化合物具有發(fā)色團(tuán)或者熒光基團(tuán)的光學(xué)特性，適用領(lǐng)域廣，方法操作簡(jiǎn)單，分析時(shí)間短，靈敏度高。本研究建立電子煙煙液中常用甜味劑的檢測(cè)方法，為電子煙中甜味劑復(fù)配和風(fēng)味開(kāi)發(fā)提供技術(shù)支持，同時(shí)適用于對(duì)電子煙煙液中甜味劑的批量檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

11款不同水果口味的電子煙煙液(均購(gòu)自國(guó)外市場(chǎng))，編號(hào)為：Y1—Y11，其中Y1、Y2為草莓香蕉味；Y3、Y4為藍(lán)莓樹莓味；Y5、Y6為草莓味；Y7、Y8為富士蘋果味；Y9為藍(lán)莓覆盆子檸檬味；Y10為桃子味；Y11為西瓜味。

安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜、愛(ài)德萬(wàn)甜(純度≥98%，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)；阿力甜、紐甜、新甲基橙皮苷二氫查爾酮(純度≥98%，壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司)；羅漢果苷V(純度≥98%，上海麥克林生化科技有限公司)；甲醇、乙腈(HPLC級(jí)，壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司)；甲酸、三乙胺、乙酸銨(HPLC級(jí)，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)；試驗(yàn)用水為實(shí)驗(yàn)室自制超純水。

1.2 儀器設(shè)備

高效液相色譜儀(LC-2050C 3D) (日本島津公司)；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD-16) (日本島津公司)；氮?dú)獍l(fā)生器(上海析維醫(yī)療科技有限公司)；電子天平(上海奧豪斯儀器有限公司)；超聲波清洗儀(深圳潔盟技術(shù)股份有限公司)；高速離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制：分別精密稱取安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、三氯蔗糖、阿力甜、紐甜、阿斯巴甜、NHDC、愛(ài)德萬(wàn)甜、羅漢果苷V各 100 mg，置于 10 mL 容量瓶中。用50%甲醇水定容至刻度線，得到各甜味劑質(zhì)量濃度均為 10 mg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制：分別移取混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液5、10、25、50、100、250 μL 至6個(gè) 10 mL 的容量瓶中，用50%甲醇水稀釋并定容，制得不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中10種甜味劑的質(zhì)量濃度分別均為5、10、25、50、100、250 mg/L。

1.3.2 樣品前處理

精密稱取 0.5 g 樣品于 10 mL 容量瓶中，加入50%甲醇水定容至刻度線，渦旋振蕩混勻，超聲 20 min，高速離心后，提取液經(jīng) 0.22 μm 濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液分析。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：HPLC column Shim-pack GIST C18(250 mm×4.6 mm；5 μm)或者等效柱；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：15 μL；流速：1 mL/min；流動(dòng)相A：0.1%甲酸水(用三乙胺調(diào)pH=4.5)；流動(dòng)相B：甲醇；洗脫梯度：0～5 min 80%A，5～10 min 50%A，10～25 min 25%，25～26 min 80%A，26～30 min 80%A。ELSD檢測(cè)器：漂移管溫度：40 ℃；載氣流量：3.00 L/min；壓力：0.375 MPa；霧化氣體：氮?dú)狻?/p>

2 結(jié)果與討論

2.1 液相色譜條件的確定

通過(guò)調(diào)整流動(dòng)相流速和配比來(lái)優(yōu)化10種甜味劑的分離度。當(dāng)流速為 1 mL/min，按照上述洗脫梯度，可以使10種甜味劑得到很好的分離，并且可以有效避開(kāi)電子煙煙液的干擾峰和磺胺類甜味劑(安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素)的特征峰，得到較為滿意的分離度，如圖1、圖2所示。

1.安賽蜜；2.糖精鈉；3.甜蜜素；4.三氯蔗糖；5.阿斯巴甜；6.阿力甜；7.新甲基橙皮苷二氫查爾酮；8.愛(ài)德萬(wàn)甜；9.羅漢果苷V；10.紐甜。

1.安賽蜜；2.糖精鈉；3.甜蜜素；4.三氯蔗糖；5.阿斯巴甜；6.阿力甜；7.新甲基橙皮苷二氫查爾酮；8.愛(ài)德萬(wàn)甜；9.羅漢果苷V；10.紐甜。

2.2 流動(dòng)相的確定

實(shí)驗(yàn)考察了甲醇、乙腈作為流動(dòng)相有機(jī)相的差異，用乙腈作為有機(jī)相，易導(dǎo)致出峰時(shí)間相近的兩個(gè)組分共同流出，分離效果不佳，因此選擇甲醇作為有機(jī)相。通過(guò)不同水相的選擇，改變流動(dòng)相體系，考察不同流動(dòng)相體系對(duì)分離效果的影響，對(duì)比了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水、甲醇-5 mmol/L 乙酸銨、甲醇-5 mmol/L 乙酸銨(含0.1%甲酸)等不同體系下目標(biāo)化合物的色譜峰強(qiáng)度、峰形和分離效果。結(jié)果表明：以水作為水相時(shí)，安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素不出峰，可能與三種化合物均呈堿性有關(guān)，容易在C18柱上吸附，難以洗脫，而且紐甜的峰形矮胖。以甲醇-5 mmol/L 乙酸銨、甲醇-5 mmol/L 乙酸銨(含0.1%甲酸)作為水相時(shí)，甜蜜素均出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象且峰形矮胖；安賽蜜、糖精鈉的分離度變差。為了延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命，減少銨鹽的使用，本研究對(duì)0.1%甲酸水進(jìn)行pH值調(diào)試進(jìn)而改善峰形、色譜峰強(qiáng)度和分離度；分別將0.1%甲酸水的pH值用三乙胺調(diào)節(jié)成3.0、4.0、4.5、5.0、7.5，隨著pH值升高，安賽蜜作為第一個(gè)出峰的物質(zhì)，出峰時(shí)間從 3.5 min 推移到 4.8 min，當(dāng)pH值升至4.5后，甜蜜素的拖尾現(xiàn)象得到完全解決，三氯蔗糖和阿斯巴甜、愛(ài)德萬(wàn)甜和羅漢果苷V得到很好的分離效果，而且多種甜味劑的色譜峰強(qiáng)度達(dá)到最高，見(jiàn)圖3。因此，確定甲醇-0.1%甲酸水溶液(pH=4.5)作為流動(dòng)相，10種甜味劑得到很好的分離效果，并且可以跟電子煙煙液的其他雜質(zhì)峰、3種磺胺類甜味劑的特征峰完全分離，10種甜味劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見(jiàn)圖1。

圖3 流動(dòng)相pH值對(duì)目標(biāo)化合物色譜峰強(qiáng)度的影響

2.3 ELSD檢測(cè)器參數(shù)的確定

影響ELSD的主要參數(shù)有漂移管溫度和載氣流量。參照ELSD-16型號(hào)的使用要求，進(jìn)氣口最大壓力≤0.5 MPa，調(diào)節(jié)氮?dú)獍l(fā)生器的閥門，使氮?dú)獾膲毫υ谕扑]使用范圍0.35～0.4 MPa 之間，調(diào)節(jié)至 0.375 MPa。ELSD中漂移管的溫度設(shè)置在30～80 ℃ 之間，可以根據(jù)流動(dòng)相的成分而定。漂移管溫度設(shè)置低時(shí)，流動(dòng)相得不到充分揮發(fā)，背景噪聲增加；漂移管溫度設(shè)置過(guò)高時(shí)，流動(dòng)相沸騰，背景噪聲也會(huì)增加，同時(shí)可能會(huì)造成部分熱敏性物質(zhì)的分解或揮發(fā)。通過(guò)調(diào)整載氣流量分別為2.5、3.0、3.5 L/min 和漂移管溫度分別為35、40、45、50 ℃。實(shí)驗(yàn)表明，載氣流量和漂移管溫度對(duì)組分的保留時(shí)間基本沒(méi)有影響，選擇載氣流量為 3.0 L/min 和漂移管溫度為 40 ℃ 時(shí)，噪聲小、靈敏度高、色譜圖基線平穩(wěn)，滿足實(shí)驗(yàn)要求。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍和檢出限

在1.3.3條件下，將配制的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)樣 15 μL 進(jìn)行分析測(cè)試，以峰面積為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制二次曲線，即：y=ax2+bx+c。以信噪比(S/N)為3時(shí)的進(jìn)樣質(zhì)量濃度為各種甜味劑的檢出限(LOD)，以信噪比(S/N)為10時(shí)的進(jìn)樣質(zhì)量濃度為各種甜味劑的定量限(LOQ)。結(jié)果表明，各種甜味劑在5～250 mg/L 的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)大于0.998，可以滿足定量分析的要求，見(jiàn)表1。

表1 10種甜味劑的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.5 方法準(zhǔn)確度和精密度

選取一款在售的電子煙煙液，通過(guò)對(duì)樣品進(jìn)行加標(biāo)回收來(lái)驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確度。分別進(jìn)行低、中、高三水平的加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，每個(gè)水平進(jìn)行重復(fù)測(cè)試6次，計(jì)算樣品中各種甜味劑的回收率和RSD，通過(guò)回收率和RSD評(píng)價(jià)該方法的準(zhǔn)確度和精密度，結(jié)果見(jiàn)表2。回收率在90.0%～110.0%，RSD在0.774%～7.65%，表明該方法有較好的準(zhǔn)確度和重復(fù)性，能夠滿足測(cè)試需求。

表2 不同質(zhì)量濃度下10種甜味劑的加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)

2.6 樣品實(shí)測(cè)分析

對(duì)市場(chǎng)上11款不同口味的電子煙煙液進(jìn)行2次平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。常應(yīng)用于電子煙的甜味劑有三氯蔗糖、紐甜等，含量一般在0.5%以下，其它類型的甜味劑應(yīng)用較少，可能與樣本量較少、三氯蔗糖和紐甜的甜度、風(fēng)味較好相關(guān)。甜味劑復(fù)配可能帶來(lái)多種風(fēng)味，并且創(chuàng)造新穎的口感，以滿足不同消費(fèi)者的需求。

表3 11款電子煙樣品中甜味劑含量的測(cè)定結(jié)果 ρ/(mg·g-1)

3 結(jié)論

建立了HPLC-ELSD同時(shí)測(cè)定電子煙煙液中的安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜、阿力甜、新甲基橙皮苷二氫查爾酮、愛(ài)德萬(wàn)甜、羅漢果苷V、紐甜的檢測(cè)方法。10種甜味劑在5～250 mg/L 范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)高于0.998，回收率在90.0%～110.0%，RSD在0.774%～7.65%，具有良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。該方法實(shí)驗(yàn)步驟簡(jiǎn)單、分析時(shí)間短，改善了部分標(biāo)準(zhǔn)方法中只能滿足單種或者幾種甜味劑檢測(cè)的不足，為電子煙煙液中甜味劑的篩查和檢測(cè)提供了準(zhǔn)確、可靠的分析方法，能夠滿足實(shí)驗(yàn)室的日常檢測(cè)需求。