張鵬敏，王文秀，孫劍鋒，陳志周，馬倩云，王 頡

（河北農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，河北 保定 071000）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）通過產(chǎn)生耐高溫和耐酸的腸毒素而導致食物中毒，是最常見的食源性致病菌之一。由于S.aureus對高溫、高鹽等條件具有一定耐受能力，因此常規(guī)滅菌手段難以清除。每年因S.aureus所引發(fā)的食源性疾病在全球多個國家和地區(qū)均有暴發(fā)。據(jù)歐洲食品安全局報道，2021年歐洲境內(nèi)由S.aureus細菌毒素引起的病例占總體食源性病例的1.5%，位居細菌毒素感染疾病第2位[1]。美國國家監(jiān)測局報告指出，2009—2018年間美國各州食源性疾病暴發(fā)227 321 次，其中由包括S.aureus在內(nèi)的細菌毒素引起的事件占7.5%[2]。在我國，2020年由S.aureus引起的食物中毒事件占全國食品中毒事件的1.1%[3]。國家疾病預防控制中心也將S.aureus列入引起我國細菌性食物中毒事件的主要致病因素之一[4]。因此，如何高效清除S.aureus成為研究熱點。

最近，越來越多的數(shù)據(jù)表明，光動力滅活（photodynamic inactivation，PDI）是一種有前景的冷殺菌技術(shù)，可以抑制細菌、霉菌、病毒和寄生蟲等多種微生物生長[5]。PDI處理的抑菌原理是在特定波長光照下，光敏劑吸收具有能量的光子并由基態(tài)進入激發(fā)態(tài)，迫使氧分子發(fā)生電子轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS），ROS與細菌細胞內(nèi)多種分子相互作用，進而抑制細菌生長[6]。PDI處理僅需要光敏劑、氧氣和與光敏劑匹配的光源。相比于其他冷殺菌技術(shù)如超聲、射線等具有耗能低、綠色環(huán)保等優(yōu)勢。目前常見的光敏劑包括5-鹽酸氨酮戊酸[7]、酞菁鋅[8]、亞甲基藍[9]、玫瑰紅[10]、竹紅菌素[11]、金絲桃素[12]、葉綠素[13]以及姜黃素[14]等。

姜黃素是一種從姜黃根莖中提取的多酚化合物，常作為食品著色劑，具有抗增殖、抗氧化和抗菌等多種生物活性。因此，姜黃素在食品中的研究最為廣泛。姜黃素分子本身具有抗菌活性，對S.aureus、銅綠假單胞菌[15]和單核細胞增生李斯特菌[16]等均有抑制作用，但是該抗菌活性效率較低、耗時長。研究表明，在400～470 nm激發(fā)波長下，姜黃素可快速產(chǎn)生具有細胞毒性的ROS從而清除細菌。但是，由于ROS半衰期短，光敏劑需盡可能接近目標細胞，從而對細胞產(chǎn)生破壞性損傷。然而在混合液中有約90%的姜黃素不能與細菌結(jié)合處于游離狀態(tài)，導致姜黃素產(chǎn)生的ROS利用度極低[17]。

為改善上述問題，本研究擬利用殼聚糖作為連接細菌和姜黃素的紐帶，增強姜黃素和細菌的結(jié)合能力。主要基于殼聚糖可作為分子載體[18-20]，吸附游離姜黃素；同時殼聚糖特有的氨基結(jié)構(gòu)可與菌體細胞壁表面帶負電荷的蛋白質(zhì)、磷脂等產(chǎn)生靜電吸引[21-23]，增加姜黃素特異性附著點數(shù)量，提高ROS的利用率。殼聚糖作為一種生態(tài)友好型生物材料，還具有較強的抗菌活性。此外，本研究制備的殼聚糖/姜黃素抗菌膜具有黑暗/光照雙重抗菌性能。在實際應用中，亟需快速高效滅菌時，可采用光照處理加速滅菌過程。為了達到上述目的，本研究首先重點考察了殼聚糖/姜黃素雙重抗菌涂膜對S.aureus的抑制效果，并從細胞結(jié)構(gòu)和分子層面揭示其抑菌機理，旨在為新型冷殺菌技術(shù)在食品安全領(lǐng)域中的應用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

姜黃素、殼聚糖、瓊脂粉、2,7-二氯二氫代熒光黃二醋酸（2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFHDA）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量檢測試劑盒和過氧化物酶（peroxidase，POD）活性檢測試劑盒北京索萊寶科技有限公司；S.aureus（ATCC6538）上海士鋒生物科技有限公司；堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）試劑盒、超微量Na＋/K＋-ATP酶（ATP酶）試劑盒和總超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測定試劑盒（WST-1法）南京建成生物工程研究所；碘化丙啶（propidium iodide，PI）、羧基熒光素二乙酸酯（carboxyfluorescein diacetate，cFDA）上海麥克林生化科技股份有限公司；安全核酸染料Safe Red 莫納（蘇州）生物科技有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；LB肉湯 浙江海波生物技術(shù)有限公司；氯化鈉、乙酸 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Guava EasyCyte流式細胞儀 美國路名克斯貿(mào)易有限公司；FV1200激光共聚焦顯微鏡 日本奧林巴斯工業(yè)有限公司；420 nm光源 江蘇省吳江區(qū)松陵鎮(zhèn)輝恒燈具商行；TU-180紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；Nicolet iS20傅里葉變換紅外光譜儀美國賽默飛世爾科技公司；SCIENTZ-1500F超聲波分散儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；MIRA LMS掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）泰思肯（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 殼聚糖/姜黃素涂膜溶液（chitosan/curcumin solution，CCs15）制備和表征

殼聚糖溶液（chitosan solution，Cs）的制備參考Rhim等[24]的方法，稍作改動。取1.0 g殼聚糖粉末溶解于100 mL 1%（體積分數(shù)）乙酸水溶液中，并在450 r/min轉(zhuǎn)速條件下，90 ℃加熱10 min，制得Cs。取10 mg姜黃素粉末溶解于4 mL無水乙醇中，制備姜黃素儲備液。然后，取60 μL姜黃素儲備液于10 mL Cs中混勻，得到CCs15，于4 ℃環(huán)境中保存。

將CCs15、姜黃素水溶液和姜黃素乙酸溶液（curcumin acetic acid solution，Curs）置于光程為1 cm 的比色皿中進行紫外-可見光掃描，掃描范圍300～800 nm[25]。將15 mL膜溶液倒置在直徑為90 mm的塑料平板中，置于40 ℃真空干燥箱10 h，待冷卻至室溫后，將膜放置在相對濕度50%、（24±1）℃條件下24 h，供后續(xù)傅里葉變換紅外光譜測試。采用KBr壓片法制備測試樣品，利用反射光譜模式對涂膜的官能團進行測量分析，分辨率4 cm-1，掃描次數(shù)為32，檢測范圍為400～4 000 cm-1[26]。

1.3.2S.aureus的培養(yǎng)

LB 液體培養(yǎng)基：稱取LB肉湯粉末25.0 g溶解于1 000 mL蒸餾水中混勻，進行高壓蒸汽滅菌（121 ℃，15 min）處理，備用。

LB固體培養(yǎng)基：稱取LB肉湯粉末25.0 g和瓊脂粉15.0 g溶解于1 000 mL蒸餾水中混勻，進行高壓蒸汽滅菌（121 ℃，15 min）處理，備用。

S.aureus活化與培養(yǎng)：將凍存于-80 ℃冰箱中的S.aureus于室溫條件下解凍，然后接種到LB液體培養(yǎng)基中，在恒溫振蕩器（30 ℃、120 r/min）中培養(yǎng)。使用紫外分光光度計測定600 nm波長處吸光度以確定菌液濃度。

1.3.3 光動力涂膜對S.aureus抑制效果

1.3.3.1 光動力涂膜對S.aureus生長曲線的影響

參考Zhou Ting等[27]的方法，稍作改動。菌液（OD600nm＝0.5）、涂膜溶液（生理鹽水、Cs和CCs15）和LB液體培養(yǎng)基以1∶2∶2（V/V）的比例混合；在37 ℃條件下培養(yǎng)10 min。然后將菌懸液在波長420 nm、光強20 mW/cm2光源處照射5 min。之后在37 ℃條件下培養(yǎng)30 min。孵育結(jié)束后，將200 μL不同處理的菌液分別轉(zhuǎn)移至裝有15 mL新鮮LB液體培養(yǎng)基的錐形瓶中繼續(xù)培養(yǎng)（30 ℃、120 r/min），并在不同時間點取樣，使用酶標儀測定菌液在600 nm波長處吸光度。分組如下：菌液與生理鹽水混合培養(yǎng)后，接受光照，記為KB；菌液與Cs混合培養(yǎng)后，接受光照，記為Cs；菌液與CCs15混合培養(yǎng)后，不接受光照，記為CCs/dark；菌液與CCs15混合培養(yǎng)后，接受光照，記為CCs/light。

1.3.3.2 不同涂膜溶液對S.aureus抑制效果

實驗方案參照1.3.3.1節(jié)，涂膜溶液選用生理鹽水、Cs、Curs（姜黃素質(zhì)量濃度為15 mg/L）和CCs15，設(shè)置光照組和無光照組。光照組記為KB/light、Cs/light、Curs/light和CCs/light；無光照組記為KB/dark、Cs/dark、Curs/dark和CCs/dark。光照后，在37 ℃培養(yǎng)20 h。孵育結(jié)束后，取100 μL菌懸液稀釋涂布在LB固體培養(yǎng)基平板上，將平板放入恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h。最后，統(tǒng)計瓊脂平板上的菌落數(shù)（lg（CFU/mL））。

1.3.3.3 姜黃素質(zhì)量濃度對S.aureus抑制效果的影響

實驗方案參照1.3.3.2節(jié)。姜黃素質(zhì)量濃度梯度為0、5、10、15、20、25 mg/L。不設(shè)置無光照組。

1.3.3.4 光照時間對S.aureus抑制效果的影響

實驗方案參照1.3.3.2節(jié)，涂膜溶液選用CCs15，光照時間梯度為0、1、3、5、7、10 min。

1.3.4 光動力處理對S.aureus細胞死/活狀態(tài)的影響

采用流式細胞儀分析不同光照時間對細胞狀態(tài)的影響，參考Meng Lingyun等[28]的方法，稍作改動。實驗方案參照1.3.3.1節(jié)。涂膜溶液選用生理鹽水和Curs。生理鹽水處理的菌懸液光照為5 min，記為KB。Curs處理的菌懸液分別光照0、0.5、3、5、10 min，依次記為Curs0、Curs0.5、Curs3、Curs5、Curs10。孵育結(jié)束后，每取1 mL待測樣品加入10 μL質(zhì)量濃度為1 mg/mL PI染料，4 ℃孵育10 min，再加入50 μL質(zhì)量濃度為0.46 mg/mL的cFDA染料，37 ℃孵育15 min，多余染料離心去除。

利用流式細胞儀對樣品上機檢測，選擇488 nm波長處激光激發(fā)，cFDA染料在525 nm波長處發(fā)射綠色熒光，PI染料620 nm波長處發(fā)射紅色熒光。低速采集10 000 個細胞，測定樣品中每個細胞前向散射（forward scatter，F(xiàn)SC）、側(cè)向散射（side scatter，SSC）以及綠色熒光通道和紅色熒光通道信號，并轉(zhuǎn)化成數(shù)字信號，通過FlowJo v10軟件對所獲得數(shù)據(jù)進行分析。

1.3.5 光動力處理對S.aureus細胞內(nèi)ROS含量的影響

采用激光共聚焦顯微鏡測定不同光照時間對細胞內(nèi)ROS含量的影響，參考Misba等[29]的方法，稍作改動。在100 mL LB液體培養(yǎng)基中加入0.1 mL DCFH-DA儲備液，制備含藥培養(yǎng)基。S.aureus菌液離心取菌泥，用含藥培養(yǎng)基重懸，使菌液OD600nm＝1.0。孵育30 min后，用生理鹽水洗滌細胞3 次。用LB培養(yǎng)基制備OD600nm＝0.5的菌懸液，供后續(xù)實驗。孵育結(jié)束后，激光共聚焦顯微鏡對樣品上機檢測，選擇488 nm波長激光激發(fā)，發(fā)射波長為525 nm。分組情況和處理條件參照1.3.4節(jié)。

1.3.6 光動力涂膜對S.aureus細胞膜通透性的影響

1.3.6.1 核酸泄漏

孵育結(jié)束后，將菌液離心（3 000 r/min，10 min），小心取出上清液，稀釋一定倍數(shù)后用紫外分光光度計測定260 nm波長處吸光度檢測核酸[30]。分組情況和處理條件參照1.3.3.1節(jié)。

1.3.6.2 蛋白質(zhì)泄漏

孵育結(jié)束后，將菌液離心（3 000 r/min，10 min），小心取出上清液，用考馬斯亮藍法測定上清液蛋白質(zhì)[31]。取考馬斯亮藍G-250溶液5 mL，向其中加入上清液1 mL，靜置3 min后，于紫外分光光度計595 nm波長處測定其吸光度。分組情況和處理條件參照1.3.3.1節(jié)。

1.3.6.3 MDA含量

采用硫代巴比妥酸法檢測MDA含量。詳細操作步驟參照MDA含量試劑盒說明書。分組情況和處理條件參照1.3.3.1節(jié)。

1.3.7 光動力涂膜對S.aureus形態(tài)的影響

采用已報道的方法[32]利用SEM對S.aureus形態(tài)進行分析。加蓋、噴金后在SEM下放大15 000、20 000 倍觀察。設(shè)置KB、Cs、Curs/light、CCs/dark、CCs/light處理組，處理條件參照1.3.3.1節(jié)。

1.3.8 光動力涂膜對S.aureus內(nèi)源酶活性的影響

從內(nèi)源酶活性（AKP、ATP酶、POD和SOD）變化的角度出發(fā)，深層探究光動力涂膜對S.aureus的抑制機理。孵育結(jié)束后，詳細操作步驟參照AKP試劑盒、超微量Na＋/K＋-ATP酶試劑盒、POD活性檢測試劑盒和SOD活性測定試劑盒說明書。分組情況和處理條件參照1.3.3.1節(jié)。

1.3.9 光動力涂膜對S.aureus細胞內(nèi)DNA和蛋白質(zhì)的影響

根據(jù)細菌基因組D N A 提取試劑盒說明書提取S.aureus基因組DNA。將基因組DNA加載到1 g/100 mL瓊脂糖凝膠和5 V/cm電壓的電泳設(shè)備上，開始DNA電泳分離。電泳30 min后，用Safe Red浸泡染色30 min。在凝膠成像儀下觀察，激發(fā)波長為305 nm。

采用文獻已報道的方法[32]對S.aureus的蛋白質(zhì)質(zhì)量進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）測試。電泳結(jié)束后，使用考馬斯亮藍R-250進行染色，后用醋酸甲醇的混合溶液脫色，搖床脫色過夜至膠條背景藍色消失后即可看見明顯的蛋白條帶。分組情況和處理條件參照1.3.3.1節(jié)。

1.4 數(shù)據(jù)處理分析

每組實驗進行3～5 個平行，實驗數(shù)據(jù)采用Excel軟件進行計算，結(jié)果以表示；以SPSS 26.0軟件進行方差分析（最小顯著性差異檢驗法），P＜0.05表示差異顯著，采用GraphPad Prism 9.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 光動力涂膜對S.aureus抑制效果分析

通過繪制細菌生長曲線研究光動力涂膜對S.aureus的抑制作用。如圖1A所示，CCs/dark、Cs組與KB組相比延滯期延長16 h，可能是殼聚糖分子水解肽聚糖、破壞細菌細胞壁結(jié)構(gòu)、抑制細菌生長引起的。而CCs/light延滯期長達28 h，說明光動力涂膜與無光照涂膜相比抑菌效果更明顯。該對比結(jié)果表明，PDI是一種高效的抗菌技術(shù)，未來在控制S.aureus食源性污染方向有巨大應用潛力。

圖1 光動力涂膜對S.aureus的抑制作用Fig.1 Effect of PDI treatment on the inactivation of S.aureus

進一步對比了在無光照和光照條件下，不同涂膜處理后S.aureus的菌落總數(shù)，用于分析藍光和殼聚糖對光動力涂膜抑菌效果的影響。圖1B是不同溶液處理后的S.aureus菌落總數(shù)。數(shù)據(jù)顯示，KB/light組與KB/dark組相比，菌落總數(shù)下降0.31（lg（CFU/mL））。這說明僅藍光處理可以影響S.aureus的生長，但是不能有效抑制細菌繁殖。這主要與藍光照射能分解S.aureus表面的腸毒素，降低細菌生長繁殖能力相關(guān)[33]。Curs/light與Curs/dark相比，菌落總數(shù)下降了1.5（lg（CFU/mL））；而Cs/light與Cs/dark相比，菌落總數(shù)下降了1.13（lg（CFU/mL））。因為PDI處理產(chǎn)生的ROS有抑菌作用，但是由于姜黃素和細菌結(jié)合松散和ROS壽命短等缺點，不能有效發(fā)揮ROS的抑菌作用。而Curs/light、CCs/light與KB/dark相比，菌落總數(shù)分別下降了4.65、6.89（lg（CFU/mL）），說明殼聚糖促進了姜黃素和細菌的結(jié)合，增加了ROS利用率。由此可得，殼聚糖在PDI處理過程中發(fā)揮重要作用。同時根據(jù)圖1結(jié)果可知，殼聚糖/姜黃素光動力涂膜抑菌過程中起抑菌作用的因素按抑制效果大小排列依次是：ROS＞殼聚糖＞姜黃素＞藍光。

圖1C為姜黃素質(zhì)量濃度對S.aureus抑制效果的影響，與KB組相比，S.aureus經(jīng)PDI處理后菌落總數(shù)明顯減少（P＜0.05），并且姜黃素質(zhì)量濃度每增加5 mg/mL，S.aureus菌落總數(shù)會下降1～1.5（lg（CFU/mL））。這與Wang Ziyuan等[34]的研究結(jié)果一致。因此，姜黃素質(zhì)量濃度是影響PDI抑菌效果的重要因素。當姜黃素質(zhì)量濃度達到25 mg/L時，沒有觀察到S.aureus菌落。而Górski等[15]的研究中無光照條件下清除3（lg（CFU/mL））的S.aureus需要姜黃素質(zhì)量濃度達到39 mg/L。本研究與之相比，姜黃素質(zhì)量濃度降低了14 mg/L。這一結(jié)果說明PDI處理抑菌效果更好，在姜黃素低質(zhì)量濃度下就可以達到明顯的抑菌效果。

在上述研究基礎(chǔ)上，進一步探究了光照時間對S.aureus抑制效果的影響。如圖1D所示，光照1 min的菌懸液與無光照組相比，S.aureus菌落總數(shù)下降了1.81（lg（CFU/mL））。隨著光照時間的延長，S.aureus菌落總數(shù)顯著下降（P＜0.05）。這說明延長光照時間可以增強PDI處理對S.aureus的抑制作用。另外，對光照時間和姜黃素質(zhì)量濃度作方差分析，發(fā)現(xiàn)光照時間對S.aureus的抑制作用影響大于姜黃素質(zhì)量濃度。隨著光照時間繼續(xù)延長（7～10 min），菌落總數(shù)變化不明顯。這一結(jié)果說明過長的光照時間對抑菌效果無促進作用。王洋等[35]研究發(fā)現(xiàn)光照20 min后，菌落總數(shù)隨光照時間延長緩慢上升。這一結(jié)果可能與溶液溫度有關(guān)，還可能與較長時間光照導致姜黃素降解生成阿魏酸和香草醛導致抑菌效果下降有關(guān)[36]。因此，PDI處理時要避免長時間光照。

2.2 光動力處理對S.aureus細胞的影響

2.2.1 對S.aureus細胞死/活狀態(tài)的影響

由圖2可知，不同時間光動力處理后，僅姜黃素孵育的S.aureus有89.8%是活細胞。這說明僅姜黃素處理能影響細菌生長，但是不能完全殺死細胞。PDI處理后，活細胞數(shù)量明顯減少；同時隨著處理時間延長，處于活的非可培養(yǎng)（viable but non-culturable，VBNC）狀態(tài)的細胞數(shù)量逐漸增加。當光照時間為3 min時，處于VBNC狀態(tài)的細胞達到36.2%。隨著處理時間繼續(xù)延長，VBNC狀態(tài)的細胞數(shù)量減少，死亡細胞逐漸增多。這說明PDI處理短時間內(nèi)會促進細菌進入VBNC狀態(tài)，而適當延長PDI處理時間可以有效殺滅細菌。

圖2 光動力處理后S.aureus雙染色結(jié)果Fig.2 Results of double staining of S.aureus after PDI treatment

與PDI處理相似，脈沖電場、紫外輻照等多種抗菌方法均會誘導細胞進入VBNC狀態(tài)，而且S.aureus進入VBNC狀態(tài)與氧化脅迫和ATP含量下降相關(guān)[28,37]。盡管VBNC狀態(tài)的細菌處于休眠狀態(tài)，但它們?nèi)匀簧啥舅?。因此，必須在殺菌過程中清除VBNC狀態(tài)的細菌。以上結(jié)果表明，PDI有清除細菌VBNC狀態(tài)的能力。

2.2.2 對S.aureus細胞內(nèi)ROS含量的影響

由圖3可知，僅光照處理，細菌細胞內(nèi)僅有少量ROS產(chǎn)生；無光照處理組（Curs0），發(fā)現(xiàn)微量綠色熒光，原因可能是S.aureus為抵抗姜黃素影響，細胞產(chǎn)生內(nèi)源性ROS，隨著光照時間延長，細胞內(nèi)ROS含量呈先增多后減少的趨勢，ROS含量在光照3 min時最高。外源性ROS進入細胞內(nèi)部，而兼性厭氧菌體內(nèi)含有SOD和POD等抗氧化酶，因此細胞本身具有ROS耐受性，少量ROS不會嚴重影響細胞活性。隨著光照時間延長，ROS含量超出細菌耐受極限，防御系統(tǒng)崩潰，致使細胞死亡，熒光強度下降。

圖3 光動力處理對S.aureus細胞內(nèi)ROS的影響Fig.3 Effect of PDI treatment on intracellular ROS in S.aureus

結(jié)合圖2結(jié)果可得：隨光照時間延長，ROS產(chǎn)量逐漸增多，攻擊細胞；同時細胞內(nèi)ROS含量升高，大量細胞進入VBNC狀態(tài)；當ROS產(chǎn)生量超出細胞耐受極限時，ROS殺死處于VBNC狀態(tài)的細胞，細菌生命活性下降，表現(xiàn)為熒光強度降低。因此，PDI是一個損傷逐漸積累的過程，只有ROS達到一定程度才能起到殺死細菌的作用。

2.2.3 對S.aureus細胞形態(tài)的影響

圖4為流式細胞儀對不同光照時間下S.aureus細胞形態(tài)的檢測結(jié)果。理論上FSC與細胞大小有關(guān)，SSC與細胞膜、細胞質(zhì)、細胞核膜有關(guān)。隨著光照時間延長，中心區(qū)域不再集中，向左下和右上擴散，表現(xiàn)為細胞形態(tài)發(fā)生變化，大小不均，內(nèi)容物含量差異增加。這說明PDI處理改變細胞形態(tài)，破壞細胞膜結(jié)構(gòu)，導致細胞物質(zhì)運輸受阻和細胞內(nèi)容物泄漏。這可能會導致部分細胞不能向外運輸物質(zhì)，細胞增大；也可能導致細胞內(nèi)外滲透壓失去平衡，發(fā)生細胞皺縮現(xiàn)象[38]。細胞SSC和FSC信號變小，說明ROS致使部分細菌細胞膜破裂形成細小碎片，并伴有內(nèi)容物泄漏[39]。少量細胞SSC和FSC信號增強，細胞膜破裂，可能發(fā)生膜黏連現(xiàn)象。因此，PDI處理致使細胞死亡的原因可能是ROS作用于細胞膜，致使細胞膜嚴重受損或者物質(zhì)運輸受阻，最終細胞因為不能進行正常生命活動而死亡。

圖4 光動力處理對S.aureus細胞形態(tài)的影響Fig.4 Effect of PDI treatment on cell morphology of S.aureus

2.3 光動力涂膜對S.aureus的抑菌機理分析

2.3.1 光動力涂膜對細胞膜通透性的影響

首先，研究不同溶液處理對S.aureus細胞膜通透性的影響。DNA作為遺傳物質(zhì)，存在于S.aureus細胞內(nèi)部，最大吸光度在260 nm波長處；當細胞膜和細胞壁受到破壞時，其內(nèi)部核酸物質(zhì)泄漏，泄漏程度與細胞膜通透性相關(guān)，因此用上清液中核酸含量評價細胞膜通透性。如圖5a所示，Cs、CCs/dark、和CCs/light組OD260nm與空白組相比分別上升了14.18%、19.15%和25.33%?？赡苁且驗镾.aureus細胞膜被殼聚糖、姜黃素和ROS破壞，核酸物質(zhì)從細胞內(nèi)泄漏到培養(yǎng)基中。因此，殼聚糖、姜黃素和ROS皆可引起S.aureus細胞膜通透性增加。而且CCs/light組中產(chǎn)有外源性ROS，對細胞膜通透性影響最顯著（P＜0.01）。S.aureus死亡和細胞膜通透性增加直接相關(guān)。進一步通過蛋白質(zhì)泄漏實驗評估PDI處理對細胞膜通透性的影響。如圖5b所示，CCs/light組上清液中蛋白質(zhì)量濃度極顯著提高（P＜0.01），說明ROS與殼聚糖和姜黃素相比有更強的破壞作用，這與路振康等[40]的結(jié)果一致。蛋白質(zhì)泄漏情況與核酸泄漏情況相似，進一步說明PDI處理能夠增加細菌細胞膜通透性。

圖5 光動力涂膜對S.aureus細胞膜的影響Fig.5 Effect of PDI treatment on cell membrane of S.aureus

如圖5c所示，與空白相比，經(jīng)CCs/light處理的細菌MDA濃度極顯著增加（P＜0.01）。MDA是細菌脂質(zhì)膜過氧化的最典型產(chǎn)物之一。MDA濃度升高是細胞膜上磷脂分子氧化所導致的，磷脂分子的過度氧化會改變細胞膜通透性，這說明ROS通過氧化細胞膜磷脂分子進而影響細胞膜通透性。

2.3.2 光動力涂膜對S.aureus微觀形態(tài)的影響

盡管通過流式細胞儀測定已經(jīng)證明PDI處理會導致部分細胞形態(tài)變化，但具體結(jié)果尚不清晰。為進一步明確結(jié)構(gòu)微觀變化，研究采用SEM揭示PDI處理后S.aureus細胞微觀結(jié)構(gòu)層面的變化。如圖6a所示，KB組S.aureus表現(xiàn)出正常的細胞形態(tài)，呈球形或橢圓形，大小均一、形態(tài)完整、表面光滑。在Cs組中，經(jīng)殼聚糖涂膜溶液處理后細菌表面附著大量殼聚糖顆粒（圖6b），表明殼聚糖可以吸附于細菌細胞壁表面。此外，細胞表面粗糙、出現(xiàn)褶皺和裂痕，少量細胞表面出現(xiàn)孔洞，但大部分細胞仍維持原有形態(tài)。這是由于殼聚糖與S.aureus表面蛋白質(zhì)、磷脂等發(fā)生靜電吸引作用，改變了細胞壁結(jié)構(gòu)[22]。經(jīng)CCs/dark處理的S.aureus表面也吸附了大量顆粒（圖6d），而與Cs、Curs/light處理相比（圖6b、c），CCs組表面顆粒大小明顯高于兩組，說明殼聚糖的存在增加了姜黃素在細胞表面的吸附量。為了進一步驗證該結(jié)果，采用紫外-可見全光譜掃描測定了殼聚糖對姜黃素的吸附效果，結(jié)果如圖6f所示。由姜黃素的最大吸光度可知，姜黃素在蒸餾水和乙酸溶液中溶解度較差，而在Cs中溶解度明顯高于二者，這是由于殼聚糖分子載體作用[18-20]。為了揭示二者的相互作用，測定二者的傅里葉變換紅外光譜。結(jié)果表明，殼聚糖和姜黃素之間未產(chǎn)生新的化學鍵，但是羥基（3 283.96 cm-1）的強度和波數(shù)發(fā)生了變化（圖6g），這是由非共價相互作用和氫鍵共同作用的結(jié)果，該結(jié)果與Roy等[18]研究結(jié)果相同。上述結(jié)果表明，殼聚糖發(fā)揮了紐帶作用，增強姜黃素和細菌的結(jié)合能力。結(jié)合之后的CCs，經(jīng)PDI處理后，S.aureus細胞呈現(xiàn)嚴重損傷，細胞膜遭到破壞，細胞內(nèi)容物大面積泄漏，失去細胞正常形態(tài)，形成很多碎片和空殼（圖6e），該結(jié)果與Yuan Yuan等[41]的報道相似。與Curs/light結(jié)果對比說明，殼聚糖增強了姜黃素對細菌的PDI效果，同時也說明對細胞產(chǎn)生不可逆損傷，最終造成細胞破裂是殼聚糖、姜黃素和ROS共同作用于細胞膜和細胞壁的結(jié)果，其中ROS影響最大。圖6結(jié)果在驗證上述核酸、蛋白質(zhì)和MDA測定結(jié)果的同時，說明殼聚糖在連接姜黃素和細菌過程中發(fā)揮重要作用，同時也論證了PDI處理破壞細菌細胞結(jié)構(gòu)完整性的結(jié)論。細胞膜作為細胞屏障，其完整性是細胞生長、繁殖和其他生理活動的基礎(chǔ)，細胞膜破損程度，直接影響細胞生命活性[42-43]。PDI處理通過作用于細胞膜，破壞細胞膜和細胞壁結(jié)構(gòu)，促使細胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、多糖等營養(yǎng)物質(zhì)泄漏。隨著破壞程度增強，細胞內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)含量降低，將無法維持細胞正常生命活動。

圖6 SEM觀察光動力涂膜處理后S.aureus微觀形態(tài)和涂膜溶液表征Fig.6 Microscopic morphology of S.aureus after PDI treatment observed by SEM and characterization of CCs

2.3.3 光動力涂膜對S.aureus細胞內(nèi)源酶活性的影響

AKP在微生物體內(nèi)可直接參與磷酸基團的轉(zhuǎn)移和代謝，存在于細胞壁和細胞膜之間。細胞壁受損時，AKP由胞內(nèi)滲出，細菌磷酸基團代謝途徑受到影響。如圖7a所示，經(jīng)Cs處理后，S.aureusAKP活性極顯著高于KB組（P＜0.01）。這是因為殼聚糖分子增加了S.aureus細胞壁通透性，使AKP從細胞膜中泄漏出來。而CCs/light處理后S.aureus較Cs組AKP活性下降。這是因為ROS非靶向攻擊蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)，影響二級結(jié)構(gòu)形成，破壞AKP完整性，促使AKP活性位點消失，進而使S.aureusAKP活性下降。AKP活性改變，說明ROS能破壞細胞壁結(jié)構(gòu)，同時攻擊細胞內(nèi)源酶，破壞細胞正常代謝途徑。

圖7 光動力涂膜對S.aureus酶活性的影響Fig.7 Effect of PDI treatment on enzyme activities in S.aureus

ATP存在于細菌細胞膜中，通過糖酵解過程產(chǎn)生。細菌細胞膜上有多種酶可以促進ATP生成和代謝。ATP酶是這種機制中最重要的酶之一，其主要是利用ATP水解產(chǎn)生的能量對Na＋、K＋、Ca2＋、Mg2＋等進行由低濃度至高濃度運輸，保持膜內(nèi)外離子濃度的平衡，維持正常生命活動，因此能夠通過ATP酶活性變化分析PDI處理對菌體細胞的影響。如圖7b所示，Cs、CCs/dark、與KB組相比ATP酶活性下降，CCs/light組極顯著低于KB組（P＜0.01）。這是因為殼聚糖和姜黃素破壞細胞壁結(jié)構(gòu)，誘導質(zhì)子動力勢（proton-motive force，PMF）崩潰。PMF是由Δψ和ΔpH組成的電化學梯度，PMF驅(qū)動膜運輸系統(tǒng)促進ATP合成和離子及其他代謝物的積累[44]。細胞膜內(nèi)外PMF崩潰導致ATP酶合成相應減少。而CCs/light組ATP酶活性最低，殼聚糖的存在使ROS更容易進入細胞內(nèi)并作用于ATP酶，導致ATP酶活性進一步下降。ATP酶失活使細胞無法通過分解ATP實現(xiàn)能量轉(zhuǎn)移以維持生命活動，最終導致S.aureus死亡。

圖7c、d分別是不同處理條件下S.aureus細胞內(nèi)SOD、POD活性。CCs/light處理組與KB組相比S.aureus細胞內(nèi)SOD和POD活性極顯著增加（P＜0.01）。這是因為PDI處理產(chǎn)生的ROS進入細胞內(nèi)部，細菌防御機制啟動，以SOD、POD為代表的抗氧化酶大量表達以維持內(nèi)部ROS平衡并保護細胞免受損傷。SOD將ROS催化為H2O2，隨著H2O2含量升高，細胞快速轉(zhuǎn)錄翻譯，產(chǎn)生POD將H2O2降解為H2O。因此，SOD和POD活性升高是細菌為了應對高ROS環(huán)境做出的反應。該結(jié)果與楊璟[45]的研究結(jié)果相似。

總之，PDI處理產(chǎn)生的ROS會引發(fā)細菌防御機制啟動，SOD、POD活性升高。隨著細胞壁被破壞，大量ROS進入細胞內(nèi)部。最后，因為ROS和H2O2含量過高，細胞內(nèi)SOD、POD和其他抗氧化酶不能將其恢復到正常水平，進而影響AKP和ATP酶活性。結(jié)果導致S.aureus生物合成、磷酸轉(zhuǎn)移、能量運輸途徑受阻，從而抑制S.aureus的生長。

2.3.4 光動力涂膜對S.aureus細胞內(nèi)DNA和蛋白質(zhì)的影響

通過瓊脂糖凝膠電泳測定光動力涂膜對S.aureus基因組DNA的影響。如圖8a所示，空白對照組DNA電泳條帶亮度高，圖像清晰；而CCs/light組的基因組DNA條帶亮度降低，清晰度降低。ROS氧化作用是導致細胞DNA損傷的主要因素之一[46]。外源性ROS滲透和內(nèi)部抗氧化防御系統(tǒng)崩潰導致細胞內(nèi)ROS含量急劇上升，進而損傷DNA[47]。另外，外源性ROS可直接與核酸物質(zhì)反應，DNA發(fā)生氧化損傷，如單鏈或雙鏈切割、交聯(lián)和堿基序列變化。DNA損傷導致轉(zhuǎn)錄過程中斷或破壞，進而導致細胞死亡。同時，ROS、殼聚糖和姜黃素可作用于參與DNA修復的酶（如DNA聚合酶），導致酶失活或功能改變，造成DNA損傷無法修復[48]。細胞中產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，如MDA，也可以導致DNA和蛋白質(zhì)交聯(lián)，引起DNA損傷[49]。

圖8 光動力涂膜對S.aureus核酸和全細胞蛋白質(zhì)的影響Fig.8 Effect of nucleic acid and whole cell proteins in S.aureus after PDI treatment

通過SDS-PAGE測定光動力涂膜對S.aureus蛋白質(zhì)的影響。觀察電泳圖像發(fā)現(xiàn)，與KB組相比，Cs和CCs/dark組在70 kDa左右的條帶亮度下降，80 kDa左右的條帶亮度提高（圖8b），可能和細菌的應激反應相關(guān)。而CCs/light組的蛋白質(zhì)條帶嚴重降解，說明ROS在細胞內(nèi)部非定向氧化，使得細胞內(nèi)蛋白質(zhì)分子氧化變性，喪失原本的結(jié)構(gòu)。Dosselli等[50]的研究同樣證明了ROS攻擊蛋白質(zhì)使得一級結(jié)構(gòu)破壞，喪失生物活性；并且芳香族氨基酸容易受到ROS的攻擊[51]。部分胞內(nèi)酶由蛋白質(zhì)構(gòu)成，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)損傷也是影響酶活性的重要原因。另外，基因組DNA損傷影響RNA轉(zhuǎn)錄翻譯，細菌蛋白質(zhì)合成能力下降是蛋白質(zhì)條帶降解的重要原因。

綜上所述，ROS通過破壞細胞膜致使細胞內(nèi)ROS含量急速增加，最后因細胞內(nèi)ROS含量過高導致細胞防御系統(tǒng)崩潰，損傷細菌基因組DNA和蛋白質(zhì)等生物大分子。因此，PDI清除S.aureus是多靶點致死效應導致的結(jié)果，而ROS破壞細菌體內(nèi)DNA和蛋白質(zhì)導致細菌產(chǎn)生不可逆損傷，是造成S.aureus死亡的重要因素。

3 結(jié)論

為促進姜黃素與細菌的結(jié)合，改善PDI處理時姜黃素利用率低的問題，本研究利用殼聚糖的細菌黏附性特點制備了殼聚糖/姜黃素光動力涂膜以增強PDI抑菌效果。在此基礎(chǔ)上，探究了影響涂膜抑菌效率的關(guān)鍵因素及PDI抑菌機理。結(jié)果顯示，PDI處理對S.aureus有優(yōu)異的抑制作用，姜黃素質(zhì)量濃度為25 mg/L的殼聚糖涂膜溶液在波長為420 nm藍光處光照僅5 min，對S.aureus可達到99.9%以上的滅活效果。殼聚糖的加入增強了姜黃素和細菌的結(jié)合，有利于PDI處理產(chǎn)生的ROS直接作用于細胞膜，破壞細菌第一層屏障，進入細胞內(nèi)，致使細菌細胞形態(tài)改變，蛋白質(zhì)和DNA泄漏。同時，ROS作用于AKP、ATP酶、POD和SOD等內(nèi)源酶，進而破壞細胞內(nèi)生物合成、能量轉(zhuǎn)化和細胞防御系統(tǒng)，并且影響細胞內(nèi)DNA和蛋白質(zhì)等生物大分子，影響RNA轉(zhuǎn)錄、DNA自我修復、酶的合成和細胞膜修復，最終導致S.aureus死亡。綜上，PDI是一種損傷逐漸積累的多靶點殺菌技術(shù)。本研究結(jié)果可為PDI在食品安全領(lǐng)域中的應用提供理論基礎(chǔ)。