張鵬敏，王文秀，孫劍鋒，陳志周，馬倩云，王 頡

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071000）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）通過(guò)產(chǎn)生耐高溫和耐酸的腸毒素而導(dǎo)致食物中毒，是最常見(jiàn)的食源性致病菌之一。由于S.aureus對(duì)高溫、高鹽等條件具有一定耐受能力，因此常規(guī)滅菌手段難以清除。每年因S.aureus所引發(fā)的食源性疾病在全球多個(gè)國(guó)家和地區(qū)均有暴發(fā)。據(jù)歐洲食品安全局報(bào)道，2021年歐洲境內(nèi)由S.aureus細(xì)菌毒素引起的病例占總體食源性病例的1.5%，位居細(xì)菌毒素感染疾病第2位[1]。美國(guó)國(guó)家監(jiān)測(cè)局報(bào)告指出，2009—2018年間美國(guó)各州食源性疾病暴發(fā)227 321 次，其中由包括S.aureus在內(nèi)的細(xì)菌毒素引起的事件占7.5%[2]。在我國(guó)，2020年由S.aureus引起的食物中毒事件占全國(guó)食品中毒事件的1.1%[3]。國(guó)家疾病預(yù)防控制中心也將S.aureus列入引起我國(guó)細(xì)菌性食物中毒事件的主要致病因素之一[4]。因此，如何高效清除S.aureus成為研究熱點(diǎn)。

最近，越來(lái)越多的數(shù)據(jù)表明，光動(dòng)力滅活（photodynamic inactivation，PDI）是一種有前景的冷殺菌技術(shù)，可以抑制細(xì)菌、霉菌、病毒和寄生蟲(chóng)等多種微生物生長(zhǎng)[5]。PDI處理的抑菌原理是在特定波長(zhǎng)光照下，光敏劑吸收具有能量的光子并由基態(tài)進(jìn)入激發(fā)態(tài)，迫使氧分子發(fā)生電子轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS），ROS與細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)多種分子相互作用，進(jìn)而抑制細(xì)菌生長(zhǎng)[6]。PDI處理僅需要光敏劑、氧氣和與光敏劑匹配的光源。相比于其他冷殺菌技術(shù)如超聲、射線等具有耗能低、綠色環(huán)保等優(yōu)勢(shì)。目前常見(jiàn)的光敏劑包括5-鹽酸氨酮戊酸[7]、酞菁鋅[8]、亞甲基藍(lán)[9]、玫瑰紅[10]、竹紅菌素[11]、金絲桃素[12]、葉綠素[13]以及姜黃素[14]等。

姜黃素是一種從姜黃根莖中提取的多酚化合物，常作為食品著色劑，具有抗增殖、抗氧化和抗菌等多種生物活性。因此，姜黃素在食品中的研究最為廣泛。姜黃素分子本身具有抗菌活性，對(duì)S.aureus、銅綠假單胞菌[15]和單核細(xì)胞增生李斯特菌[16]等均有抑制作用，但是該抗菌活性效率較低、耗時(shí)長(zhǎng)。研究表明，在400～470 nm激發(fā)波長(zhǎng)下，姜黃素可快速產(chǎn)生具有細(xì)胞毒性的ROS從而清除細(xì)菌。但是，由于ROS半衰期短，光敏劑需盡可能接近目標(biāo)細(xì)胞，從而對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生破壞性損傷。然而在混合液中有約90%的姜黃素不能與細(xì)菌結(jié)合處于游離狀態(tài)，導(dǎo)致姜黃素產(chǎn)生的ROS利用度極低[17]。

為改善上述問(wèn)題，本研究擬利用殼聚糖作為連接細(xì)菌和姜黃素的紐帶，增強(qiáng)姜黃素和細(xì)菌的結(jié)合能力。主要基于殼聚糖可作為分子載體[18-20]，吸附游離姜黃素；同時(shí)殼聚糖特有的氨基結(jié)構(gòu)可與菌體細(xì)胞壁表面帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)、磷脂等產(chǎn)生靜電吸引[21-23]，增加姜黃素特異性附著點(diǎn)數(shù)量，提高ROS的利用率。殼聚糖作為一種生態(tài)友好型生物材料，還具有較強(qiáng)的抗菌活性。此外，本研究制備的殼聚糖/姜黃素抗菌膜具有黑暗/光照雙重抗菌性能。在實(shí)際應(yīng)用中，亟需快速高效滅菌時(shí)，可采用光照處理加速滅菌過(guò)程。為了達(dá)到上述目的，本研究首先重點(diǎn)考察了殼聚糖/姜黃素雙重抗菌涂膜對(duì)S.aureus的抑制效果，并從細(xì)胞結(jié)構(gòu)和分子層面揭示其抑菌機(jī)理，旨在為新型冷殺菌技術(shù)在食品安全領(lǐng)域中的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

姜黃素、殼聚糖、瓊脂粉、2,7-二氯二氫代熒光黃二醋酸（2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFHDA）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量檢測(cè)試劑盒和過(guò)氧化物酶（peroxidase，POD）活性檢測(cè)試劑盒北京索萊寶科技有限公司；S.aureus（ATCC6538）上海士鋒生物科技有限公司；堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）試劑盒、超微量Na＋/K＋-ATP酶（ATP酶）試劑盒和總超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測(cè)定試劑盒（WST-1法）南京建成生物工程研究所；碘化丙啶（propidium iodide，PI）、羧基熒光素二乙酸酯（carboxyfluorescein diacetate，cFDA）上海麥克林生化科技股份有限公司；安全核酸染料Safe Red 莫納（蘇州）生物科技有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；LB肉湯 浙江海波生物技術(shù)有限公司；氯化鈉、乙酸 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Guava EasyCyte流式細(xì)胞儀 美國(guó)路名克斯貿(mào)易有限公司；FV1200激光共聚焦顯微鏡 日本奧林巴斯工業(yè)有限公司；420 nm光源 江蘇省吳江區(qū)松陵鎮(zhèn)輝恒燈具商行；TU-180紫外分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；Nicolet iS20傅里葉變換紅外光譜儀美國(guó)賽默飛世爾科技公司；SCIENTZ-1500F超聲波分散儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；MIRA LMS掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）泰思肯（中國(guó)）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 殼聚糖/姜黃素涂膜溶液（chitosan/curcumin solution，CCs15）制備和表征

殼聚糖溶液（chitosan solution，Cs）的制備參考Rhim等[24]的方法，稍作改動(dòng)。取1.0 g殼聚糖粉末溶解于100 mL 1%（體積分?jǐn)?shù)）乙酸水溶液中，并在450 r/min轉(zhuǎn)速條件下，90 ℃加熱10 min，制得Cs。取10 mg姜黃素粉末溶解于4 mL無(wú)水乙醇中，制備姜黃素儲(chǔ)備液。然后，取60 μL姜黃素儲(chǔ)備液于10 mL Cs中混勻，得到CCs15，于4 ℃環(huán)境中保存。

將CCs15、姜黃素水溶液和姜黃素乙酸溶液（curcumin acetic acid solution，Curs）置于光程為1 cm 的比色皿中進(jìn)行紫外-可見(jiàn)光掃描，掃描范圍300～800 nm[25]。將15 mL膜溶液倒置在直徑為90 mm的塑料平板中，置于40 ℃真空干燥箱10 h，待冷卻至室溫后，將膜放置在相對(duì)濕度50%、（24±1）℃條件下24 h，供后續(xù)傅里葉變換紅外光譜測(cè)試。采用KBr壓片法制備測(cè)試樣品，利用反射光譜模式對(duì)涂膜的官能團(tuán)進(jìn)行測(cè)量分析，分辨率4 cm-1，掃描次數(shù)為32，檢測(cè)范圍為400～4 000 cm-1[26]。

1.3.2S.aureus的培養(yǎng)

LB 液體培養(yǎng)基：稱取LB肉湯粉末25.0 g溶解于1 000 mL蒸餾水中混勻，進(jìn)行高壓蒸汽滅菌（121 ℃，15 min）處理，備用。

LB固體培養(yǎng)基：稱取LB肉湯粉末25.0 g和瓊脂粉15.0 g溶解于1 000 mL蒸餾水中混勻，進(jìn)行高壓蒸汽滅菌（121 ℃，15 min）處理，備用。

S.aureus活化與培養(yǎng)：將凍存于-80 ℃冰箱中的S.aureus于室溫條件下解凍，然后接種到LB液體培養(yǎng)基中，在恒溫振蕩器（30 ℃、120 r/min）中培養(yǎng)。使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定600 nm波長(zhǎng)處吸光度以確定菌液濃度。

1.3.3 光動(dòng)力涂膜對(duì)S.aureus抑制效果

1.3.3.1 光動(dòng)力涂膜對(duì)S.aureus生長(zhǎng)曲線的影響

參考Zhou Ting等[27]的方法，稍作改動(dòng)。菌液（OD600nm＝0.5）、涂膜溶液（生理鹽水、Cs和CCs15）和LB液體培養(yǎng)基以1∶2∶2（V/V）的比例混合；在37 ℃條件下培養(yǎng)10 min。然后將菌懸液在波長(zhǎng)420 nm、光強(qiáng)20 mW/cm2光源處照射5 min。之后在37 ℃條件下培養(yǎng)30 min。孵育結(jié)束后，將200 μL不同處理的菌液分別轉(zhuǎn)移至裝有15 mL新鮮LB液體培養(yǎng)基的錐形瓶中繼續(xù)培養(yǎng)（30 ℃、120 r/min），并在不同時(shí)間點(diǎn)取樣，使用酶標(biāo)儀測(cè)定菌液在600 nm波長(zhǎng)處吸光度。分組如下：菌液與生理鹽水混合培養(yǎng)后，接受光照，記為KB；菌液與Cs混合培養(yǎng)后，接受光照，記為Cs；菌液與CCs15混合培養(yǎng)后，不接受光照，記為CCs/dark；菌液與CCs15混合培養(yǎng)后，接受光照，記為CCs/light。

1.3.3.2 不同涂膜溶液對(duì)S.aureus抑制效果

實(shí)驗(yàn)方案參照1.3.3.1節(jié)，涂膜溶液選用生理鹽水、Cs、Curs（姜黃素質(zhì)量濃度為15 mg/L）和CCs15，設(shè)置光照組和無(wú)光照組。光照組記為KB/light、Cs/light、Curs/light和CCs/light；無(wú)光照組記為KB/dark、Cs/dark、Curs/dark和CCs/dark。光照后，在37 ℃培養(yǎng)20 h。孵育結(jié)束后，取100 μL菌懸液稀釋涂布在LB固體培養(yǎng)基平板上，將平板放入恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h。最后，統(tǒng)計(jì)瓊脂平板上的菌落數(shù)（lg（CFU/mL））。

1.3.3.3 姜黃素質(zhì)量濃度對(duì)S.aureus抑制效果的影響

實(shí)驗(yàn)方案參照1.3.3.2節(jié)。姜黃素質(zhì)量濃度梯度為0、5、10、15、20、25 mg/L。不設(shè)置無(wú)光照組。

1.3.3.4 光照時(shí)間對(duì)S.aureus抑制效果的影響

實(shí)驗(yàn)方案參照1.3.3.2節(jié)，涂膜溶液選用CCs15，光照時(shí)間梯度為0、1、3、5、7、10 min。

1.3.4 光動(dòng)力處理對(duì)S.aureus細(xì)胞死/活狀態(tài)的影響

采用流式細(xì)胞儀分析不同光照時(shí)間對(duì)細(xì)胞狀態(tài)的影響，參考Meng Lingyun等[28]的方法，稍作改動(dòng)。實(shí)驗(yàn)方案參照1.3.3.1節(jié)。涂膜溶液選用生理鹽水和Curs。生理鹽水處理的菌懸液光照為5 min，記為KB。Curs處理的菌懸液分別光照0、0.5、3、5、10 min，依次記為Curs0、Curs0.5、Curs3、Curs5、Curs10。孵育結(jié)束后，每取1 mL待測(cè)樣品加入10 μL質(zhì)量濃度為1 mg/mL PI染料，4 ℃孵育10 min，再加入50 μL質(zhì)量濃度為0.46 mg/mL的cFDA染料，37 ℃孵育15 min，多余染料離心去除。

利用流式細(xì)胞儀對(duì)樣品上機(jī)檢測(cè)，選擇488 nm波長(zhǎng)處激光激發(fā)，cFDA染料在525 nm波長(zhǎng)處發(fā)射綠色熒光，PI染料620 nm波長(zhǎng)處發(fā)射紅色熒光。低速采集10 000 個(gè)細(xì)胞，測(cè)定樣品中每個(gè)細(xì)胞前向散射（forward scatter，F(xiàn)SC）、側(cè)向散射（side scatter，SSC）以及綠色熒光通道和紅色熒光通道信號(hào)，并轉(zhuǎn)化成數(shù)字信號(hào)，通過(guò)FlowJo v10軟件對(duì)所獲得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.3.5 光動(dòng)力處理對(duì)S.aureus細(xì)胞內(nèi)ROS含量的影響

采用激光共聚焦顯微鏡測(cè)定不同光照時(shí)間對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS含量的影響，參考Misba等[29]的方法，稍作改動(dòng)。在100 mL LB液體培養(yǎng)基中加入0.1 mL DCFH-DA儲(chǔ)備液，制備含藥培養(yǎng)基。S.aureus菌液離心取菌泥，用含藥培養(yǎng)基重懸，使菌液OD600nm＝1.0。孵育30 min后，用生理鹽水洗滌細(xì)胞3 次。用LB培養(yǎng)基制備OD600nm＝0.5的菌懸液，供后續(xù)實(shí)驗(yàn)。孵育結(jié)束后，激光共聚焦顯微鏡對(duì)樣品上機(jī)檢測(cè)，選擇488 nm波長(zhǎng)激光激發(fā)，發(fā)射波長(zhǎng)為525 nm。分組情況和處理?xiàng)l件參照1.3.4節(jié)。

1.3.6 光動(dòng)力涂膜對(duì)S.aureus細(xì)胞膜通透性的影響

1.3.6.1 核酸泄漏

孵育結(jié)束后，將菌液離心（3 000 r/min，10 min），小心取出上清液，稀釋一定倍數(shù)后用紫外分光光度計(jì)測(cè)定260 nm波長(zhǎng)處吸光度檢測(cè)核酸[30]。分組情況和處理?xiàng)l件參照1.3.3.1節(jié)。

1.3.6.2 蛋白質(zhì)泄漏

孵育結(jié)束后，將菌液離心（3 000 r/min，10 min），小心取出上清液，用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定上清液蛋白質(zhì)[31]。取考馬斯亮藍(lán)G-250溶液5 mL，向其中加入上清液1 mL，靜置3 min后，于紫外分光光度計(jì)595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度。分組情況和處理?xiàng)l件參照1.3.3.1節(jié)。

1.3.6.3 MDA含量

采用硫代巴比妥酸法檢測(cè)MDA含量。詳細(xì)操作步驟參照MDA含量試劑盒說(shuō)明書(shū)。分組情況和處理?xiàng)l件參照1.3.3.1節(jié)。

1.3.7 光動(dòng)力涂膜對(duì)S.aureus形態(tài)的影響

采用已報(bào)道的方法[32]利用SEM對(duì)S.aureus形態(tài)進(jìn)行分析。加蓋、噴金后在SEM下放大15 000、20 000 倍觀察。設(shè)置KB、Cs、Curs/light、CCs/dark、CCs/light處理組，處理?xiàng)l件參照1.3.3.1節(jié)。

1.3.8 光動(dòng)力涂膜對(duì)S.aureus內(nèi)源酶活性的影響

從內(nèi)源酶活性（AKP、ATP酶、POD和SOD）變化的角度出發(fā)，深層探究光動(dòng)力涂膜對(duì)S.aureus的抑制機(jī)理。孵育結(jié)束后，詳細(xì)操作步驟參照AKP試劑盒、超微量Na＋/K＋-ATP酶試劑盒、POD活性檢測(cè)試劑盒和SOD活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)。分組情況和處理?xiàng)l件參照1.3.3.1節(jié)。

1.3.9 光動(dòng)力涂膜對(duì)S.aureus細(xì)胞內(nèi)DNA和蛋白質(zhì)的影響

根據(jù)細(xì)菌基因組D N A 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取S.aureus基因組DNA。將基因組DNA加載到1 g/100 mL瓊脂糖凝膠和5 V/cm電壓的電泳設(shè)備上，開(kāi)始DNA電泳分離。電泳30 min后，用Safe Red浸泡染色30 min。在凝膠成像儀下觀察，激發(fā)波長(zhǎng)為305 nm。

采用文獻(xiàn)已報(bào)道的方法[32]對(duì)S.aureus的蛋白質(zhì)質(zhì)量進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）測(cè)試。電泳結(jié)束后，使用考馬斯亮藍(lán)R-250進(jìn)行染色，后用醋酸甲醇的混合溶液脫色，搖床脫色過(guò)夜至膠條背景藍(lán)色消失后即可看見(jiàn)明顯的蛋白條帶。分組情況和處理?xiàng)l件參照1.3.3.1節(jié)。

1.4 數(shù)據(jù)處理分析

每組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3～5 個(gè)平行，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel軟件進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果以表示；以SPSS 26.0軟件進(jìn)行方差分析（最小顯著性差異檢驗(yàn)法），P＜0.05表示差異顯著，采用GraphPad Prism 9.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 光動(dòng)力涂膜對(duì)S.aureus抑制效果分析

通過(guò)繪制細(xì)菌生長(zhǎng)曲線研究光動(dòng)力涂膜對(duì)S.aureus的抑制作用。如圖1A所示，CCs/dark、Cs組與KB組相比延滯期延長(zhǎng)16 h，可能是殼聚糖分子水解肽聚糖、破壞細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)、抑制細(xì)菌生長(zhǎng)引起的。而CCs/light延滯期長(zhǎng)達(dá)28 h，說(shuō)明光動(dòng)力涂膜與無(wú)光照涂膜相比抑菌效果更明顯。該對(duì)比結(jié)果表明，PDI是一種高效的抗菌技術(shù)，未來(lái)在控制S.aureus食源性污染方向有巨大應(yīng)用潛力。

圖1 光動(dòng)力涂膜對(duì)S.aureus的抑制作用Fig.1 Effect of PDI treatment on the inactivation of S.aureus

進(jìn)一步對(duì)比了在無(wú)光照和光照條件下，不同涂膜處理后S.aureus的菌落總數(shù)，用于分析藍(lán)光和殼聚糖對(duì)光動(dòng)力涂膜抑菌效果的影響。圖1B是不同溶液處理后的S.aureus菌落總數(shù)。數(shù)據(jù)顯示，KB/light組與KB/dark組相比，菌落總數(shù)下降0.31（lg（CFU/mL））。這說(shuō)明僅藍(lán)光處理可以影響S.aureus的生長(zhǎng)，但是不能有效抑制細(xì)菌繁殖。這主要與藍(lán)光照射能分解S.aureus表面的腸毒素，降低細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖能力相關(guān)[33]。Curs/light與Curs/dark相比，菌落總數(shù)下降了1.5（lg（CFU/mL））；而Cs/light與Cs/dark相比，菌落總數(shù)下降了1.13（lg（CFU/mL））。因?yàn)镻DI處理產(chǎn)生的ROS有抑菌作用，但是由于姜黃素和細(xì)菌結(jié)合松散和ROS壽命短等缺點(diǎn)，不能有效發(fā)揮ROS的抑菌作用。而Curs/light、CCs/light與KB/dark相比，菌落總數(shù)分別下降了4.65、6.89（lg（CFU/mL）），說(shuō)明殼聚糖促進(jìn)了姜黃素和細(xì)菌的結(jié)合，增加了ROS利用率。由此可得，殼聚糖在PDI處理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。同時(shí)根據(jù)圖1結(jié)果可知，殼聚糖/姜黃素光動(dòng)力涂膜抑菌過(guò)程中起抑菌作用的因素按抑制效果大小排列依次是：ROS＞殼聚糖＞姜黃素＞藍(lán)光。

圖1C為姜黃素質(zhì)量濃度對(duì)S.aureus抑制效果的影響，與KB組相比，S.aureus經(jīng)PDI處理后菌落總數(shù)明顯減少（P＜0.05），并且姜黃素質(zhì)量濃度每增加5 mg/mL，S.aureus菌落總數(shù)會(huì)下降1～1.5（lg（CFU/mL））。這與Wang Ziyuan等[34]的研究結(jié)果一致。因此，姜黃素質(zhì)量濃度是影響PDI抑菌效果的重要因素。當(dāng)姜黃素質(zhì)量濃度達(dá)到25 mg/L時(shí)，沒(méi)有觀察到S.aureus菌落。而Górski等[15]的研究中無(wú)光照條件下清除3（lg（CFU/mL））的S.aureus需要姜黃素質(zhì)量濃度達(dá)到39 mg/L。本研究與之相比，姜黃素質(zhì)量濃度降低了14 mg/L。這一結(jié)果說(shuō)明PDI處理抑菌效果更好，在姜黃素低質(zhì)量濃度下就可以達(dá)到明顯的抑菌效果。

在上述研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探究了光照時(shí)間對(duì)S.aureus抑制效果的影響。如圖1D所示，光照1 min的菌懸液與無(wú)光照組相比，S.aureus菌落總數(shù)下降了1.81（lg（CFU/mL））。隨著光照時(shí)間的延長(zhǎng)，S.aureus菌落總數(shù)顯著下降（P＜0.05）。這說(shuō)明延長(zhǎng)光照時(shí)間可以增強(qiáng)PDI處理對(duì)S.aureus的抑制作用。另外，對(duì)光照時(shí)間和姜黃素質(zhì)量濃度作方差分析，發(fā)現(xiàn)光照時(shí)間對(duì)S.aureus的抑制作用影響大于姜黃素質(zhì)量濃度。隨著光照時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)（7～10 min），菌落總數(shù)變化不明顯。這一結(jié)果說(shuō)明過(guò)長(zhǎng)的光照時(shí)間對(duì)抑菌效果無(wú)促進(jìn)作用。王洋等[35]研究發(fā)現(xiàn)光照20 min后，菌落總數(shù)隨光照時(shí)間延長(zhǎng)緩慢上升。這一結(jié)果可能與溶液溫度有關(guān)，還可能與較長(zhǎng)時(shí)間光照導(dǎo)致姜黃素降解生成阿魏酸和香草醛導(dǎo)致抑菌效果下降有關(guān)[36]。因此，PDI處理時(shí)要避免長(zhǎng)時(shí)間光照。

2.2 光動(dòng)力處理對(duì)S.aureus細(xì)胞的影響

2.2.1 對(duì)S.aureus細(xì)胞死/活狀態(tài)的影響

由圖2可知，不同時(shí)間光動(dòng)力處理后，僅姜黃素孵育的S.aureus有89.8%是活細(xì)胞。這說(shuō)明僅姜黃素處理能影響細(xì)菌生長(zhǎng)，但是不能完全殺死細(xì)胞。PDI處理后，活細(xì)胞數(shù)量明顯減少；同時(shí)隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，處于活的非可培養(yǎng)（viable but non-culturable，VBNC）狀態(tài)的細(xì)胞數(shù)量逐漸增加。當(dāng)光照時(shí)間為3 min時(shí)，處于VBNC狀態(tài)的細(xì)胞達(dá)到36.2%。隨著處理時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，VBNC狀態(tài)的細(xì)胞數(shù)量減少，死亡細(xì)胞逐漸增多。這說(shuō)明PDI處理短時(shí)間內(nèi)會(huì)促進(jìn)細(xì)菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)，而適當(dāng)延長(zhǎng)PDI處理時(shí)間可以有效殺滅細(xì)菌。

圖2 光動(dòng)力處理后S.aureus雙染色結(jié)果Fig.2 Results of double staining of S.aureus after PDI treatment

與PDI處理相似，脈沖電場(chǎng)、紫外輻照等多種抗菌方法均會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入VBNC狀態(tài)，而且S.aureus進(jìn)入VBNC狀態(tài)與氧化脅迫和ATP含量下降相關(guān)[28,37]。盡管VBNC狀態(tài)的細(xì)菌處于休眠狀態(tài)，但它們?nèi)匀簧啥舅?。因此，必須在殺菌過(guò)程中清除VBNC狀態(tài)的細(xì)菌。以上結(jié)果表明，PDI有清除細(xì)菌VBNC狀態(tài)的能力。

2.2.2 對(duì)S.aureus細(xì)胞內(nèi)ROS含量的影響

由圖3可知，僅光照處理，細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)僅有少量ROS產(chǎn)生；無(wú)光照處理組（Curs0），發(fā)現(xiàn)微量綠色熒光，原因可能是S.aureus為抵抗姜黃素影響，細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)源性ROS，隨著光照時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)ROS含量呈先增多后減少的趨勢(shì)，ROS含量在光照3 min時(shí)最高。外源性ROS進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，而兼性厭氧菌體內(nèi)含有SOD和POD等抗氧化酶，因此細(xì)胞本身具有ROS耐受性，少量ROS不會(huì)嚴(yán)重影響細(xì)胞活性。隨著光照時(shí)間延長(zhǎng)，ROS含量超出細(xì)菌耐受極限，防御系統(tǒng)崩潰，致使細(xì)胞死亡，熒光強(qiáng)度下降。

圖3 光動(dòng)力處理對(duì)S.aureus細(xì)胞內(nèi)ROS的影響Fig.3 Effect of PDI treatment on intracellular ROS in S.aureus

結(jié)合圖2結(jié)果可得：隨光照時(shí)間延長(zhǎng)，ROS產(chǎn)量逐漸增多，攻擊細(xì)胞；同時(shí)細(xì)胞內(nèi)ROS含量升高，大量細(xì)胞進(jìn)入VBNC狀態(tài)；當(dāng)ROS產(chǎn)生量超出細(xì)胞耐受極限時(shí)，ROS殺死處于VBNC狀態(tài)的細(xì)胞，細(xì)菌生命活性下降，表現(xiàn)為熒光強(qiáng)度降低。因此，PDI是一個(gè)損傷逐漸積累的過(guò)程，只有ROS達(dá)到一定程度才能起到殺死細(xì)菌的作用。

2.2.3 對(duì)S.aureus細(xì)胞形態(tài)的影響

圖4為流式細(xì)胞儀對(duì)不同光照時(shí)間下S.aureus細(xì)胞形態(tài)的檢測(cè)結(jié)果。理論上FSC與細(xì)胞大小有關(guān)，SSC與細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核膜有關(guān)。隨著光照時(shí)間延長(zhǎng)，中心區(qū)域不再集中，向左下和右上擴(kuò)散，表現(xiàn)為細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，大小不均，內(nèi)容物含量差異增加。這說(shuō)明PDI處理改變細(xì)胞形態(tài)，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞物質(zhì)運(yùn)輸受阻和細(xì)胞內(nèi)容物泄漏。這可能會(huì)導(dǎo)致部分細(xì)胞不能向外運(yùn)輸物質(zhì)，細(xì)胞增大；也可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外滲透壓失去平衡，發(fā)生細(xì)胞皺縮現(xiàn)象[38]。細(xì)胞SSC和FSC信號(hào)變小，說(shuō)明ROS致使部分細(xì)菌細(xì)胞膜破裂形成細(xì)小碎片，并伴有內(nèi)容物泄漏[39]。少量細(xì)胞SSC和FSC信號(hào)增強(qiáng)，細(xì)胞膜破裂，可能發(fā)生膜黏連現(xiàn)象。因此，PDI處理致使細(xì)胞死亡的原因可能是ROS作用于細(xì)胞膜，致使細(xì)胞膜嚴(yán)重受損或者物質(zhì)運(yùn)輸受阻，最終細(xì)胞因?yàn)椴荒苓M(jìn)行正常生命活動(dòng)而死亡。

圖4 光動(dòng)力處理對(duì)S.aureus細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.4 Effect of PDI treatment on cell morphology of S.aureus

2.3 光動(dòng)力涂膜對(duì)S.aureus的抑菌機(jī)理分析

2.3.1 光動(dòng)力涂膜對(duì)細(xì)胞膜通透性的影響

首先，研究不同溶液處理對(duì)S.aureus細(xì)胞膜通透性的影響。DNA作為遺傳物質(zhì)，存在于S.aureus細(xì)胞內(nèi)部，最大吸光度在260 nm波長(zhǎng)處；當(dāng)細(xì)胞膜和細(xì)胞壁受到破壞時(shí)，其內(nèi)部核酸物質(zhì)泄漏，泄漏程度與細(xì)胞膜通透性相關(guān)，因此用上清液中核酸含量評(píng)價(jià)細(xì)胞膜通透性。如圖5a所示，Cs、CCs/dark、和CCs/light組OD260nm與空白組相比分別上升了14.18%、19.15%和25.33%。可能是因?yàn)镾.aureus細(xì)胞膜被殼聚糖、姜黃素和ROS破壞，核酸物質(zhì)從細(xì)胞內(nèi)泄漏到培養(yǎng)基中。因此，殼聚糖、姜黃素和ROS皆可引起S.aureus細(xì)胞膜通透性增加。而且CCs/light組中產(chǎn)有外源性ROS，對(duì)細(xì)胞膜通透性影響最顯著（P＜0.01）。S.aureus死亡和細(xì)胞膜通透性增加直接相關(guān)。進(jìn)一步通過(guò)蛋白質(zhì)泄漏實(shí)驗(yàn)評(píng)估PDI處理對(duì)細(xì)胞膜通透性的影響。如圖5b所示，CCs/light組上清液中蛋白質(zhì)量濃度極顯著提高（P＜0.01），說(shuō)明ROS與殼聚糖和姜黃素相比有更強(qiáng)的破壞作用，這與路振康等[40]的結(jié)果一致。蛋白質(zhì)泄漏情況與核酸泄漏情況相似，進(jìn)一步說(shuō)明PDI處理能夠增加細(xì)菌細(xì)胞膜通透性。

圖5 光動(dòng)力涂膜對(duì)S.aureus細(xì)胞膜的影響Fig.5 Effect of PDI treatment on cell membrane of S.aureus

如圖5c所示，與空白相比，經(jīng)CCs/light處理的細(xì)菌MDA濃度極顯著增加（P＜0.01）。MDA是細(xì)菌脂質(zhì)膜過(guò)氧化的最典型產(chǎn)物之一。MDA濃度升高是細(xì)胞膜上磷脂分子氧化所導(dǎo)致的，磷脂分子的過(guò)度氧化會(huì)改變細(xì)胞膜通透性，這說(shuō)明ROS通過(guò)氧化細(xì)胞膜磷脂分子進(jìn)而影響細(xì)胞膜通透性。

2.3.2 光動(dòng)力涂膜對(duì)S.aureus微觀形態(tài)的影響

盡管通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)定已經(jīng)證明PDI處理會(huì)導(dǎo)致部分細(xì)胞形態(tài)變化，但具體結(jié)果尚不清晰。為進(jìn)一步明確結(jié)構(gòu)微觀變化，研究采用SEM揭示PDI處理后S.aureus細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)層面的變化。如圖6a所示，KB組S.aureus表現(xiàn)出正常的細(xì)胞形態(tài)，呈球形或橢圓形，大小均一、形態(tài)完整、表面光滑。在Cs組中，經(jīng)殼聚糖涂膜溶液處理后細(xì)菌表面附著大量殼聚糖顆粒（圖6b），表明殼聚糖可以吸附于細(xì)菌細(xì)胞壁表面。此外，細(xì)胞表面粗糙、出現(xiàn)褶皺和裂痕，少量細(xì)胞表面出現(xiàn)孔洞，但大部分細(xì)胞仍維持原有形態(tài)。這是由于殼聚糖與S.aureus表面蛋白質(zhì)、磷脂等發(fā)生靜電吸引作用，改變了細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)[22]。經(jīng)CCs/dark處理的S.aureus表面也吸附了大量顆粒（圖6d），而與Cs、Curs/light處理相比（圖6b、c），CCs組表面顆粒大小明顯高于兩組，說(shuō)明殼聚糖的存在增加了姜黃素在細(xì)胞表面的吸附量。為了進(jìn)一步驗(yàn)證該結(jié)果，采用紫外-可見(jiàn)全光譜掃描測(cè)定了殼聚糖對(duì)姜黃素的吸附效果，結(jié)果如圖6f所示。由姜黃素的最大吸光度可知，姜黃素在蒸餾水和乙酸溶液中溶解度較差，而在Cs中溶解度明顯高于二者，這是由于殼聚糖分子載體作用[18-20]。為了揭示二者的相互作用，測(cè)定二者的傅里葉變換紅外光譜。結(jié)果表明，殼聚糖和姜黃素之間未產(chǎn)生新的化學(xué)鍵，但是羥基（3 283.96 cm-1）的強(qiáng)度和波數(shù)發(fā)生了變化（圖6g），這是由非共價(jià)相互作用和氫鍵共同作用的結(jié)果，該結(jié)果與Roy等[18]研究結(jié)果相同。上述結(jié)果表明，殼聚糖發(fā)揮了紐帶作用，增強(qiáng)姜黃素和細(xì)菌的結(jié)合能力。結(jié)合之后的CCs，經(jīng)PDI處理后，S.aureus細(xì)胞呈現(xiàn)嚴(yán)重?fù)p傷，細(xì)胞膜遭到破壞，細(xì)胞內(nèi)容物大面積泄漏，失去細(xì)胞正常形態(tài)，形成很多碎片和空殼（圖6e），該結(jié)果與Yuan Yuan等[41]的報(bào)道相似。與Curs/light結(jié)果對(duì)比說(shuō)明，殼聚糖增強(qiáng)了姜黃素對(duì)細(xì)菌的PDI效果，同時(shí)也說(shuō)明對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不可逆損傷，最終造成細(xì)胞破裂是殼聚糖、姜黃素和ROS共同作用于細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的結(jié)果，其中ROS影響最大。圖6結(jié)果在驗(yàn)證上述核酸、蛋白質(zhì)和MDA測(cè)定結(jié)果的同時(shí)，說(shuō)明殼聚糖在連接姜黃素和細(xì)菌過(guò)程中發(fā)揮重要作用，同時(shí)也論證了PDI處理破壞細(xì)菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性的結(jié)論。細(xì)胞膜作為細(xì)胞屏障，其完整性是細(xì)胞生長(zhǎng)、繁殖和其他生理活動(dòng)的基礎(chǔ)，細(xì)胞膜破損程度，直接影響細(xì)胞生命活性[42-43]。PDI處理通過(guò)作用于細(xì)胞膜，破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，促使細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、多糖等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)泄漏。隨著破壞程度增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量降低，將無(wú)法維持細(xì)胞正常生命活動(dòng)。

圖6 SEM觀察光動(dòng)力涂膜處理后S.aureus微觀形態(tài)和涂膜溶液表征Fig.6 Microscopic morphology of S.aureus after PDI treatment observed by SEM and characterization of CCs

2.3.3 光動(dòng)力涂膜對(duì)S.aureus細(xì)胞內(nèi)源酶活性的影響

AKP在微生物體內(nèi)可直接參與磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移和代謝，存在于細(xì)胞壁和細(xì)胞膜之間。細(xì)胞壁受損時(shí)，AKP由胞內(nèi)滲出，細(xì)菌磷酸基團(tuán)代謝途徑受到影響。如圖7a所示，經(jīng)Cs處理后，S.aureusAKP活性極顯著高于KB組（P＜0.01）。這是因?yàn)闅ぞ厶欠肿釉黾恿薙.aureus細(xì)胞壁通透性，使AKP從細(xì)胞膜中泄漏出來(lái)。而CCs/light處理后S.aureus較Cs組AKP活性下降。這是因?yàn)镽OS非靶向攻擊蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)，影響二級(jí)結(jié)構(gòu)形成，破壞AKP完整性，促使AKP活性位點(diǎn)消失，進(jìn)而使S.aureusAKP活性下降。AKP活性改變，說(shuō)明ROS能破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，同時(shí)攻擊細(xì)胞內(nèi)源酶，破壞細(xì)胞正常代謝途徑。

圖7 光動(dòng)力涂膜對(duì)S.aureus酶活性的影響Fig.7 Effect of PDI treatment on enzyme activities in S.aureus

ATP存在于細(xì)菌細(xì)胞膜中，通過(guò)糖酵解過(guò)程產(chǎn)生。細(xì)菌細(xì)胞膜上有多種酶可以促進(jìn)ATP生成和代謝。ATP酶是這種機(jī)制中最重要的酶之一，其主要是利用ATP水解產(chǎn)生的能量對(duì)Na＋、K＋、Ca2＋、Mg2＋等進(jìn)行由低濃度至高濃度運(yùn)輸，保持膜內(nèi)外離子濃度的平衡，維持正常生命活動(dòng)，因此能夠通過(guò)ATP酶活性變化分析PDI處理對(duì)菌體細(xì)胞的影響。如圖7b所示，Cs、CCs/dark、與KB組相比ATP酶活性下降，CCs/light組極顯著低于KB組（P＜0.01）。這是因?yàn)闅ぞ厶呛徒S素破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)質(zhì)子動(dòng)力勢(shì)（proton-motive force，PMF）崩潰。PMF是由Δψ和ΔpH組成的電化學(xué)梯度，PMF驅(qū)動(dòng)膜運(yùn)輸系統(tǒng)促進(jìn)ATP合成和離子及其他代謝物的積累[44]。細(xì)胞膜內(nèi)外PMF崩潰導(dǎo)致ATP酶合成相應(yīng)減少。而CCs/light組ATP酶活性最低，殼聚糖的存在使ROS更容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并作用于ATP酶，導(dǎo)致ATP酶活性進(jìn)一步下降。ATP酶失活使細(xì)胞無(wú)法通過(guò)分解ATP實(shí)現(xiàn)能量轉(zhuǎn)移以維持生命活動(dòng)，最終導(dǎo)致S.aureus死亡。

圖7c、d分別是不同處理?xiàng)l件下S.aureus細(xì)胞內(nèi)SOD、POD活性。CCs/light處理組與KB組相比S.aureus細(xì)胞內(nèi)SOD和POD活性極顯著增加（P＜0.01）。這是因?yàn)镻DI處理產(chǎn)生的ROS進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，細(xì)菌防御機(jī)制啟動(dòng)，以SOD、POD為代表的抗氧化酶大量表達(dá)以維持內(nèi)部ROS平衡并保護(hù)細(xì)胞免受損傷。SOD將ROS催化為H2O2，隨著H2O2含量升高，細(xì)胞快速轉(zhuǎn)錄翻譯，產(chǎn)生POD將H2O2降解為H2O。因此，SOD和POD活性升高是細(xì)菌為了應(yīng)對(duì)高ROS環(huán)境做出的反應(yīng)。該結(jié)果與楊璟[45]的研究結(jié)果相似。

總之，PDI處理產(chǎn)生的ROS會(huì)引發(fā)細(xì)菌防御機(jī)制啟動(dòng)，SOD、POD活性升高。隨著細(xì)胞壁被破壞，大量ROS進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。最后，因?yàn)镽OS和H2O2含量過(guò)高，細(xì)胞內(nèi)SOD、POD和其他抗氧化酶不能將其恢復(fù)到正常水平，進(jìn)而影響AKP和ATP酶活性。結(jié)果導(dǎo)致S.aureus生物合成、磷酸轉(zhuǎn)移、能量運(yùn)輸途徑受阻，從而抑制S.aureus的生長(zhǎng)。

2.3.4 光動(dòng)力涂膜對(duì)S.aureus細(xì)胞內(nèi)DNA和蛋白質(zhì)的影響

通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定光動(dòng)力涂膜對(duì)S.aureus基因組DNA的影響。如圖8a所示，空白對(duì)照組DNA電泳條帶亮度高，圖像清晰；而CCs/light組的基因組DNA條帶亮度降低，清晰度降低。ROS氧化作用是導(dǎo)致細(xì)胞DNA損傷的主要因素之一[46]。外源性ROS滲透和內(nèi)部抗氧化防御系統(tǒng)崩潰導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS含量急劇上升，進(jìn)而損傷DNA[47]。另外，外源性ROS可直接與核酸物質(zhì)反應(yīng)，DNA發(fā)生氧化損傷，如單鏈或雙鏈切割、交聯(lián)和堿基序列變化。DNA損傷導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄過(guò)程中斷或破壞，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。同時(shí)，ROS、殼聚糖和姜黃素可作用于參與DNA修復(fù)的酶（如DNA聚合酶），導(dǎo)致酶失活或功能改變，造成DNA損傷無(wú)法修復(fù)[48]。細(xì)胞中產(chǎn)生的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，如MDA，也可以導(dǎo)致DNA和蛋白質(zhì)交聯(lián)，引起DNA損傷[49]。

圖8 光動(dòng)力涂膜對(duì)S.aureus核酸和全細(xì)胞蛋白質(zhì)的影響Fig.8 Effect of nucleic acid and whole cell proteins in S.aureus after PDI treatment

通過(guò)SDS-PAGE測(cè)定光動(dòng)力涂膜對(duì)S.aureus蛋白質(zhì)的影響。觀察電泳圖像發(fā)現(xiàn)，與KB組相比，Cs和CCs/dark組在70 kDa左右的條帶亮度下降，80 kDa左右的條帶亮度提高（圖8b），可能和細(xì)菌的應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)。而CCs/light組的蛋白質(zhì)條帶嚴(yán)重降解，說(shuō)明ROS在細(xì)胞內(nèi)部非定向氧化，使得細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)分子氧化變性，喪失原本的結(jié)構(gòu)。Dosselli等[50]的研究同樣證明了ROS攻擊蛋白質(zhì)使得一級(jí)結(jié)構(gòu)破壞，喪失生物活性；并且芳香族氨基酸容易受到ROS的攻擊[51]。部分胞內(nèi)酶由蛋白質(zhì)構(gòu)成，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)損傷也是影響酶活性的重要原因。另外，基因組DNA損傷影響RNA轉(zhuǎn)錄翻譯，細(xì)菌蛋白質(zhì)合成能力下降是蛋白質(zhì)條帶降解的重要原因。

綜上所述，ROS通過(guò)破壞細(xì)胞膜致使細(xì)胞內(nèi)ROS含量急速增加，最后因細(xì)胞內(nèi)ROS含量過(guò)高導(dǎo)致細(xì)胞防御系統(tǒng)崩潰，損傷細(xì)菌基因組DNA和蛋白質(zhì)等生物大分子。因此，PDI清除S.aureus是多靶點(diǎn)致死效應(yīng)導(dǎo)致的結(jié)果，而ROS破壞細(xì)菌體內(nèi)DNA和蛋白質(zhì)導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生不可逆損傷，是造成S.aureus死亡的重要因素。

3 結(jié)論

為促進(jìn)姜黃素與細(xì)菌的結(jié)合，改善PDI處理時(shí)姜黃素利用率低的問(wèn)題，本研究利用殼聚糖的細(xì)菌黏附性特點(diǎn)制備了殼聚糖/姜黃素光動(dòng)力涂膜以增強(qiáng)PDI抑菌效果。在此基礎(chǔ)上，探究了影響涂膜抑菌效率的關(guān)鍵因素及PDI抑菌機(jī)理。結(jié)果顯示，PDI處理對(duì)S.aureus有優(yōu)異的抑制作用，姜黃素質(zhì)量濃度為25 mg/L的殼聚糖涂膜溶液在波長(zhǎng)為420 nm藍(lán)光處光照僅5 min，對(duì)S.aureus可達(dá)到99.9%以上的滅活效果。殼聚糖的加入增強(qiáng)了姜黃素和細(xì)菌的結(jié)合，有利于PDI處理產(chǎn)生的ROS直接作用于細(xì)胞膜，破壞細(xì)菌第一層屏障，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，致使細(xì)菌細(xì)胞形態(tài)改變，蛋白質(zhì)和DNA泄漏。同時(shí)，ROS作用于AKP、ATP酶、POD和SOD等內(nèi)源酶，進(jìn)而破壞細(xì)胞內(nèi)生物合成、能量轉(zhuǎn)化和細(xì)胞防御系統(tǒng)，并且影響細(xì)胞內(nèi)DNA和蛋白質(zhì)等生物大分子，影響RNA轉(zhuǎn)錄、DNA自我修復(fù)、酶的合成和細(xì)胞膜修復(fù)，最終導(dǎo)致S.aureus死亡。綜上，PDI是一種損傷逐漸積累的多靶點(diǎn)殺菌技術(shù)。本研究結(jié)果可為PDI在食品安全領(lǐng)域中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。