張鵬敏,王文秀,孫劍鋒,陳志周,馬倩云,王 頡
(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,河北 保定 071000)
金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)通過(guò)產(chǎn)生耐高溫和耐酸的腸毒素而導(dǎo)致食物中毒,是最常見(jiàn)的食源性致病菌之一。由于S.aureus對(duì)高溫、高鹽等條件具有一定耐受能力,因此常規(guī)滅菌手段難以清除。每年因S.aureus所引發(fā)的食源性疾病在全球多個(gè)國(guó)家和地區(qū)均有暴發(fā)。據(jù)歐洲食品安全局報(bào)道,2021年歐洲境內(nèi)由S.aureus細(xì)菌毒素引起的病例占總體食源性病例的1.5%,位居細(xì)菌毒素感染疾病第2位[1]。美國(guó)國(guó)家監(jiān)測(cè)局報(bào)告指出,2009—2018年間美國(guó)各州食源性疾病暴發(fā)227 321 次,其中由包括S.aureus在內(nèi)的細(xì)菌毒素引起的事件占7.5%[2]。在我國(guó),2020年由S.aureus引起的食物中毒事件占全國(guó)食品中毒事件的1.1%[3]。國(guó)家疾病預(yù)防控制中心也將S.aureus列入引起我國(guó)細(xì)菌性食物中毒事件的主要致病因素之一[4]。因此,如何高效清除S.aureus成為研究熱點(diǎn)。
最近,越來(lái)越多的數(shù)據(jù)表明,光動(dòng)力滅活(photodynamic inactivation,PDI)是一種有前景的冷殺菌技術(shù),可以抑制細(xì)菌、霉菌、病毒和寄生蟲(chóng)等多種微生物生長(zhǎng)[5]。PDI處理的抑菌原理是在特定波長(zhǎng)光照下,光敏劑吸收具有能量的光子并由基態(tài)進(jìn)入激發(fā)態(tài),迫使氧分子發(fā)生電子轉(zhuǎn)移,產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species,ROS),ROS與細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)多種分子相互作用,進(jìn)而抑制細(xì)菌生長(zhǎng)[6]。PDI處理僅需要光敏劑、氧氣和與光敏劑匹配的光源。相比于其他冷殺菌技術(shù)如超聲、射線等具有耗能低、綠色環(huán)保等優(yōu)勢(shì)。目前常見(jiàn)的光敏劑包括5-鹽酸氨酮戊酸[7]、酞菁鋅[8]、亞甲基藍(lán)[9]、玫瑰紅[10]、竹紅菌素[11]、金絲桃素[12]、葉綠素[13]以及姜黃素[14]等。
姜黃素是一種從姜黃根莖中提取的多酚化合物,常作為食品著色劑,具有抗增殖、抗氧化和抗菌等多種生物活性。因此,姜黃素在食品中的研究最為廣泛。姜黃素分子本身具有抗菌活性,對(duì)S.aureus、銅綠假單胞菌[15]和單核細(xì)胞增生李斯特菌[16]等均有抑制作用,但是該抗菌活性效率較低、耗時(shí)長(zhǎng)。研究表明,在400~470 nm激發(fā)波長(zhǎng)下,姜黃素可快速產(chǎn)生具有細(xì)胞毒性的ROS從而清除細(xì)菌。但是,由于ROS半衰期短,光敏劑需盡可能接近目標(biāo)細(xì)胞,從而對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生破壞性損傷。然而在混合液中有約90%的姜黃素不能與細(xì)菌結(jié)合處于游離狀態(tài),導(dǎo)致姜黃素產(chǎn)生的ROS利用度極低[17]。
為改善上述問(wèn)題,本研究擬利用殼聚糖作為連接細(xì)菌和姜黃素的紐帶,增強(qiáng)姜黃素和細(xì)菌的結(jié)合能力。主要基于殼聚糖可作為分子載體[18-20],吸附游離姜黃素;同時(shí)殼聚糖特有的氨基結(jié)構(gòu)可與菌體細(xì)胞壁表面帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)、磷脂等產(chǎn)生靜電吸引[21-23],增加姜黃素特異性附著點(diǎn)數(shù)量,提高ROS的利用率。殼聚糖作為一種生態(tài)友好型生物材料,還具有較強(qiáng)的抗菌活性。此外,本研究制備的殼聚糖/姜黃素抗菌膜具有黑暗/光照雙重抗菌性能。在實(shí)際應(yīng)用中,亟需快速高效滅菌時(shí),可采用光照處理加速滅菌過(guò)程。為了達(dá)到上述目的,本研究首先重點(diǎn)考察了殼聚糖/姜黃素雙重抗菌涂膜對(duì)S.aureus的抑制效果,并從細(xì)胞結(jié)構(gòu)和分子層面揭示其抑菌機(jī)理,旨在為新型冷殺菌技術(shù)在食品安全領(lǐng)域中的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。
姜黃素、殼聚糖、瓊脂粉、2,7-二氯二氫代熒光黃二醋酸(2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFHDA)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量檢測(cè)試劑盒和過(guò)氧化物酶(peroxidase,POD)活性檢測(cè)試劑盒北京索萊寶科技有限公司;S.aureus(ATCC6538)上海士鋒生物科技有限公司;堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)試劑盒、超微量Na+/K+-ATP酶(ATP酶)試劑盒和總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)測(cè)定試劑盒(WST-1法)南京建成生物工程研究所;碘化丙啶(propidium iodide,PI)、羧基熒光素二乙酸酯(carboxyfluorescein diacetate,cFDA)上海麥克林生化科技股份有限公司;安全核酸染料Safe Red 莫納(蘇州)生物科技有限公司;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技(北京)有限公司;LB肉湯 浙江海波生物技術(shù)有限公司;氯化鈉、乙酸 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
Guava EasyCyte流式細(xì)胞儀 美國(guó)路名克斯貿(mào)易有限公司;FV1200激光共聚焦顯微鏡 日本奧林巴斯工業(yè)有限公司;420 nm光源 江蘇省吳江區(qū)松陵鎮(zhèn)輝恒燈具商行;TU-180紫外分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;Nicolet iS20傅里葉變換紅外光譜儀美國(guó)賽默飛世爾科技公司;SCIENTZ-1500F超聲波分散儀 寧波新芝生物科技股份有限公司;MIRA LMS掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope,SEM)泰思肯(中國(guó))有限公司。
1.3.1 殼聚糖/姜黃素涂膜溶液(chitosan/curcumin solution,CCs15)制備和表征
殼聚糖溶液(chitosan solution,Cs)的制備參考Rhim等[24]的方法,稍作改動(dòng)。取1.0 g殼聚糖粉末溶解于100 mL 1%(體積分?jǐn)?shù))乙酸水溶液中,并在450 r/min轉(zhuǎn)速條件下,90 ℃加熱10 min,制得Cs。取10 mg姜黃素粉末溶解于4 mL無(wú)水乙醇中,制備姜黃素儲(chǔ)備液。然后,取60 μL姜黃素儲(chǔ)備液于10 mL Cs中混勻,得到CCs15,于4 ℃環(huán)境中保存。
將CCs15、姜黃素水溶液和姜黃素乙酸溶液(curcumin acetic acid solution,Curs)置于光程為1 cm 的比色皿中進(jìn)行紫外-可見(jiàn)光掃描,掃描范圍300~800 nm[25]。將15 mL膜溶液倒置在直徑為90 mm的塑料平板中,置于40 ℃真空干燥箱10 h,待冷卻至室溫后,將膜放置在相對(duì)濕度50%、(24±1)℃條件下24 h,供后續(xù)傅里葉變換紅外光譜測(cè)試。采用KBr壓片法制備測(cè)試樣品,利用反射光譜模式對(duì)涂膜的官能團(tuán)進(jìn)行測(cè)量分析,分辨率4 cm-1,掃描次數(shù)為32,檢測(cè)范圍為400~4 000 cm-1[26]。
1.3.2S.aureus的培養(yǎng)
LB 液體培養(yǎng)基:稱取LB肉湯粉末25.0 g溶解于1 000 mL蒸餾水中混勻,進(jìn)行高壓蒸汽滅菌(121 ℃,15 min)處理,備用。
LB固體培養(yǎng)基:稱取LB肉湯粉末25.0 g和瓊脂粉15.0 g溶解于1 000 mL蒸餾水中混勻,進(jìn)行高壓蒸汽滅菌(121 ℃,15 min)處理,備用。
S.aureus活化與培養(yǎng):將凍存于-80 ℃冰箱中的S.aureus于室溫條件下解凍,然后接種到LB液體培養(yǎng)基中,在恒溫振蕩器(30 ℃、120 r/min)中培養(yǎng)。使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定600 nm波長(zhǎng)處吸光度以確定菌液濃度。
1.3.3 光動(dòng)力涂膜對(duì)S.aureus抑制效果
1.3.3.1 光動(dòng)力涂膜對(duì)S.aureus生長(zhǎng)曲線的影響
參考Zhou Ting等[27]的方法,稍作改動(dòng)。菌液(OD600nm=0.5)、涂膜溶液(生理鹽水、Cs和CCs15)和LB液體培養(yǎng)基以1∶2∶2(V/V)的比例混合;在37 ℃條件下培養(yǎng)10 min。然后將菌懸液在波長(zhǎng)420 nm、光強(qiáng)20 mW/cm2光源處照射5 min。之后在37 ℃條件下培養(yǎng)30 min。孵育結(jié)束后,將200 μL不同處理的菌液分別轉(zhuǎn)移至裝有15 mL新鮮LB液體培養(yǎng)基的錐形瓶中繼續(xù)培養(yǎng)(30 ℃、120 r/min),并在不同時(shí)間點(diǎn)取樣,使用酶標(biāo)儀測(cè)定菌液在600 nm波長(zhǎng)處吸光度。分組如下:菌液與生理鹽水混合培養(yǎng)后,接受光照,記為KB;菌液與Cs混合培養(yǎng)后,接受光照,記為Cs;菌液與CCs15混合培養(yǎng)后,不接受光照,記為CCs/dark;菌液與CCs15混合培養(yǎng)后,接受光照,記為CCs/light。
1.3.3.2 不同涂膜溶液對(duì)S.aureus抑制效果
實(shí)驗(yàn)方案參照1.3.3.1節(jié),涂膜溶液選用生理鹽水、Cs、Curs(姜黃素質(zhì)量濃度為15 mg/L)和CCs15,設(shè)置光照組和無(wú)光照組。光照組記為KB/light、Cs/light、Curs/light和CCs/light;無(wú)光照組記為KB/dark、Cs/dark、Curs/dark和CCs/dark。光照后,在37 ℃培養(yǎng)20 h。孵育結(jié)束后,取100 μL菌懸液稀釋涂布在LB固體培養(yǎng)基平板上,將平板放入恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h。最后,統(tǒng)計(jì)瓊脂平板上的菌落數(shù)(lg(CFU/mL))。
1.3.3.3 姜黃素質(zhì)量濃度對(duì)S.aureus抑制效果的影響
實(shí)驗(yàn)方案參照1.3.3.2節(jié)。姜黃素質(zhì)量濃度梯度為0、5、10、15、20、25 mg/L。不設(shè)置無(wú)光照組。
1.3.3.4 光照時(shí)間對(duì)S.aureus抑制效果的影響
實(shí)驗(yàn)方案參照1.3.3.2節(jié),涂膜溶液選用CCs15,光照時(shí)間梯度為0、1、3、5、7、10 min。
1.3.4 光動(dòng)力處理對(duì)S.aureus細(xì)胞死/活狀態(tài)的影響
采用流式細(xì)胞儀分析不同光照時(shí)間對(duì)細(xì)胞狀態(tài)的影響,參考Meng Lingyun等[28]的方法,稍作改動(dòng)。實(shí)驗(yàn)方案參照1.3.3.1節(jié)。涂膜溶液選用生理鹽水和Curs。生理鹽水處理的菌懸液光照為5 min,記為KB。Curs處理的菌懸液分別光照0、0.5、3、5、10 min,依次記為Curs0、Curs0.5、Curs3、Curs5、Curs10。孵育結(jié)束后,每取1 mL待測(cè)樣品加入10 μL質(zhì)量濃度為1 mg/mL PI染料,4 ℃孵育10 min,再加入50 μL質(zhì)量濃度為0.46 mg/mL的cFDA染料,37 ℃孵育15 min,多余染料離心去除。
利用流式細(xì)胞儀對(duì)樣品上機(jī)檢測(cè),選擇488 nm波長(zhǎng)處激光激發(fā),cFDA染料在525 nm波長(zhǎng)處發(fā)射綠色熒光,PI染料620 nm波長(zhǎng)處發(fā)射紅色熒光。低速采集10 000 個(gè)細(xì)胞,測(cè)定樣品中每個(gè)細(xì)胞前向散射(forward scatter,F(xiàn)SC)、側(cè)向散射(side scatter,SSC)以及綠色熒光通道和紅色熒光通道信號(hào),并轉(zhuǎn)化成數(shù)字信號(hào),通過(guò)FlowJo v10軟件對(duì)所獲得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。
1.3.5 光動(dòng)力處理對(duì)S.aureus細(xì)胞內(nèi)ROS含量的影響
采用激光共聚焦顯微鏡測(cè)定不同光照時(shí)間對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS含量的影響,參考Misba等[29]的方法,稍作改動(dòng)。在100 mL LB液體培養(yǎng)基中加入0.1 mL DCFH-DA儲(chǔ)備液,制備含藥培養(yǎng)基。S.aureus菌液離心取菌泥,用含藥培養(yǎng)基重懸,使菌液OD600nm=1.0。孵育30 min后,用生理鹽水洗滌細(xì)胞3 次。用LB培養(yǎng)基制備OD600nm=0.5的菌懸液,供后續(xù)實(shí)驗(yàn)。孵育結(jié)束后,激光共聚焦顯微鏡對(duì)樣品上機(jī)檢測(cè),選擇488 nm波長(zhǎng)激光激發(fā),發(fā)射波長(zhǎng)為525 nm。分組情況和處理?xiàng)l件參照1.3.4節(jié)。
1.3.6 光動(dòng)力涂膜對(duì)S.aureus細(xì)胞膜通透性的影響
1.3.6.1 核酸泄漏
孵育結(jié)束后,將菌液離心(3 000 r/min,10 min),小心取出上清液,稀釋一定倍數(shù)后用紫外分光光度計(jì)測(cè)定260 nm波長(zhǎng)處吸光度檢測(cè)核酸[30]。分組情況和處理?xiàng)l件參照1.3.3.1節(jié)。
1.3.6.2 蛋白質(zhì)泄漏
孵育結(jié)束后,將菌液離心(3 000 r/min,10 min),小心取出上清液,用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定上清液蛋白質(zhì)[31]。取考馬斯亮藍(lán)G-250溶液5 mL,向其中加入上清液1 mL,靜置3 min后,于紫外分光光度計(jì)595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度。分組情況和處理?xiàng)l件參照1.3.3.1節(jié)。
1.3.6.3 MDA含量
采用硫代巴比妥酸法檢測(cè)MDA含量。詳細(xì)操作步驟參照MDA含量試劑盒說(shuō)明書(shū)。分組情況和處理?xiàng)l件參照1.3.3.1節(jié)。
1.3.7 光動(dòng)力涂膜對(duì)S.aureus形態(tài)的影響
采用已報(bào)道的方法[32]利用SEM對(duì)S.aureus形態(tài)進(jìn)行分析。加蓋、噴金后在SEM下放大15 000、20 000 倍觀察。設(shè)置KB、Cs、Curs/light、CCs/dark、CCs/light處理組,處理?xiàng)l件參照1.3.3.1節(jié)。
1.3.8 光動(dòng)力涂膜對(duì)S.aureus內(nèi)源酶活性的影響
從內(nèi)源酶活性(AKP、ATP酶、POD和SOD)變化的角度出發(fā),深層探究光動(dòng)力涂膜對(duì)S.aureus的抑制機(jī)理。孵育結(jié)束后,詳細(xì)操作步驟參照AKP試劑盒、超微量Na+/K+-ATP酶試劑盒、POD活性檢測(cè)試劑盒和SOD活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)。分組情況和處理?xiàng)l件參照1.3.3.1節(jié)。
1.3.9 光動(dòng)力涂膜對(duì)S.aureus細(xì)胞內(nèi)DNA和蛋白質(zhì)的影響
根據(jù)細(xì)菌基因組D N A 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取S.aureus基因組DNA。將基因組DNA加載到1 g/100 mL瓊脂糖凝膠和5 V/cm電壓的電泳設(shè)備上,開(kāi)始DNA電泳分離。電泳30 min后,用Safe Red浸泡染色30 min。在凝膠成像儀下觀察,激發(fā)波長(zhǎng)為305 nm。
采用文獻(xiàn)已報(bào)道的方法[32]對(duì)S.aureus的蛋白質(zhì)質(zhì)量進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)測(cè)試。電泳結(jié)束后,使用考馬斯亮藍(lán)R-250進(jìn)行染色,后用醋酸甲醇的混合溶液脫色,搖床脫色過(guò)夜至膠條背景藍(lán)色消失后即可看見(jiàn)明顯的蛋白條帶。分組情況和處理?xiàng)l件參照1.3.3.1節(jié)。
每組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3~5 個(gè)平行,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel軟件進(jìn)行計(jì)算,結(jié)果以表示;以SPSS 26.0軟件進(jìn)行方差分析(最小顯著性差異檢驗(yàn)法),P<0.05表示差異顯著,采用GraphPad Prism 9.0軟件作圖。
通過(guò)繪制細(xì)菌生長(zhǎng)曲線研究光動(dòng)力涂膜對(duì)S.aureus的抑制作用。如圖1A所示,CCs/dark、Cs組與KB組相比延滯期延長(zhǎng)16 h,可能是殼聚糖分子水解肽聚糖、破壞細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)、抑制細(xì)菌生長(zhǎng)引起的。而CCs/light延滯期長(zhǎng)達(dá)28 h,說(shuō)明光動(dòng)力涂膜與無(wú)光照涂膜相比抑菌效果更明顯。該對(duì)比結(jié)果表明,PDI是一種高效的抗菌技術(shù),未來(lái)在控制S.aureus食源性污染方向有巨大應(yīng)用潛力。
圖1 光動(dòng)力涂膜對(duì)S.aureus的抑制作用Fig.1 Effect of PDI treatment on the inactivation of S.aureus
進(jìn)一步對(duì)比了在無(wú)光照和光照條件下,不同涂膜處理后S.aureus的菌落總數(shù),用于分析藍(lán)光和殼聚糖對(duì)光動(dòng)力涂膜抑菌效果的影響。圖1B是不同溶液處理后的S.aureus菌落總數(shù)。數(shù)據(jù)顯示,KB/light組與KB/dark組相比,菌落總數(shù)下降0.31(lg(CFU/mL))。這說(shuō)明僅藍(lán)光處理可以影響S.aureus的生長(zhǎng),但是不能有效抑制細(xì)菌繁殖。這主要與藍(lán)光照射能分解S.aureus表面的腸毒素,降低細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖能力相關(guān)[33]。Curs/light與Curs/dark相比,菌落總數(shù)下降了1.5(lg(CFU/mL));而Cs/light與Cs/dark相比,菌落總數(shù)下降了1.13(lg(CFU/mL))。因?yàn)镻DI處理產(chǎn)生的ROS有抑菌作用,但是由于姜黃素和細(xì)菌結(jié)合松散和ROS壽命短等缺點(diǎn),不能有效發(fā)揮ROS的抑菌作用。而Curs/light、CCs/light與KB/dark相比,菌落總數(shù)分別下降了4.65、6.89(lg(CFU/mL)),說(shuō)明殼聚糖促進(jìn)了姜黃素和細(xì)菌的結(jié)合,增加了ROS利用率。由此可得,殼聚糖在PDI處理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。同時(shí)根據(jù)圖1結(jié)果可知,殼聚糖/姜黃素光動(dòng)力涂膜抑菌過(guò)程中起抑菌作用的因素按抑制效果大小排列依次是:ROS>殼聚糖>姜黃素>藍(lán)光。
圖1C為姜黃素質(zhì)量濃度對(duì)S.aureus抑制效果的影響,與KB組相比,S.aureus經(jīng)PDI處理后菌落總數(shù)明顯減少(P<0.05),并且姜黃素質(zhì)量濃度每增加5 mg/mL,S.aureus菌落總數(shù)會(huì)下降1~1.5(lg(CFU/mL))。這與Wang Ziyuan等[34]的研究結(jié)果一致。因此,姜黃素質(zhì)量濃度是影響PDI抑菌效果的重要因素。當(dāng)姜黃素質(zhì)量濃度達(dá)到25 mg/L時(shí),沒(méi)有觀察到S.aureus菌落。而Górski等[15]的研究中無(wú)光照條件下清除3(lg(CFU/mL))的S.aureus需要姜黃素質(zhì)量濃度達(dá)到39 mg/L。本研究與之相比,姜黃素質(zhì)量濃度降低了14 mg/L。這一結(jié)果說(shuō)明PDI處理抑菌效果更好,在姜黃素低質(zhì)量濃度下就可以達(dá)到明顯的抑菌效果。
在上述研究基礎(chǔ)上,進(jìn)一步探究了光照時(shí)間對(duì)S.aureus抑制效果的影響。如圖1D所示,光照1 min的菌懸液與無(wú)光照組相比,S.aureus菌落總數(shù)下降了1.81(lg(CFU/mL))。隨著光照時(shí)間的延長(zhǎng),S.aureus菌落總數(shù)顯著下降(P<0.05)。這說(shuō)明延長(zhǎng)光照時(shí)間可以增強(qiáng)PDI處理對(duì)S.aureus的抑制作用。另外,對(duì)光照時(shí)間和姜黃素質(zhì)量濃度作方差分析,發(fā)現(xiàn)光照時(shí)間對(duì)S.aureus的抑制作用影響大于姜黃素質(zhì)量濃度。隨著光照時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)(7~10 min),菌落總數(shù)變化不明顯。這一結(jié)果說(shuō)明過(guò)長(zhǎng)的光照時(shí)間對(duì)抑菌效果無(wú)促進(jìn)作用。王洋等[35]研究發(fā)現(xiàn)光照20 min后,菌落總數(shù)隨光照時(shí)間延長(zhǎng)緩慢上升。這一結(jié)果可能與溶液溫度有關(guān),還可能與較長(zhǎng)時(shí)間光照導(dǎo)致姜黃素降解生成阿魏酸和香草醛導(dǎo)致抑菌效果下降有關(guān)[36]。因此,PDI處理時(shí)要避免長(zhǎng)時(shí)間光照。
2.2.1 對(duì)S.aureus細(xì)胞死/活狀態(tài)的影響
由圖2可知,不同時(shí)間光動(dòng)力處理后,僅姜黃素孵育的S.aureus有89.8%是活細(xì)胞。這說(shuō)明僅姜黃素處理能影響細(xì)菌生長(zhǎng),但是不能完全殺死細(xì)胞。PDI處理后,活細(xì)胞數(shù)量明顯減少;同時(shí)隨著處理時(shí)間延長(zhǎng),處于活的非可培養(yǎng)(viable but non-culturable,VBNC)狀態(tài)的細(xì)胞數(shù)量逐漸增加。當(dāng)光照時(shí)間為3 min時(shí),處于VBNC狀態(tài)的細(xì)胞達(dá)到36.2%。隨著處理時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng),VBNC狀態(tài)的細(xì)胞數(shù)量減少,死亡細(xì)胞逐漸增多。這說(shuō)明PDI處理短時(shí)間內(nèi)會(huì)促進(jìn)細(xì)菌進(jìn)入VBNC狀態(tài),而適當(dāng)延長(zhǎng)PDI處理時(shí)間可以有效殺滅細(xì)菌。
圖2 光動(dòng)力處理后S.aureus雙染色結(jié)果Fig.2 Results of double staining of S.aureus after PDI treatment
與PDI處理相似,脈沖電場(chǎng)、紫外輻照等多種抗菌方法均會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入VBNC狀態(tài),而且S.aureus進(jìn)入VBNC狀態(tài)與氧化脅迫和ATP含量下降相關(guān)[28,37]。盡管VBNC狀態(tài)的細(xì)菌處于休眠狀態(tài),但它們?nèi)匀簧啥舅?。因此,必須在殺菌過(guò)程中清除VBNC狀態(tài)的細(xì)菌。以上結(jié)果表明,PDI有清除細(xì)菌VBNC狀態(tài)的能力。
2.2.2 對(duì)S.aureus細(xì)胞內(nèi)ROS含量的影響
由圖3可知,僅光照處理,細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)僅有少量ROS產(chǎn)生;無(wú)光照處理組(Curs0),發(fā)現(xiàn)微量綠色熒光,原因可能是S.aureus為抵抗姜黃素影響,細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)源性ROS,隨著光照時(shí)間延長(zhǎng),細(xì)胞內(nèi)ROS含量呈先增多后減少的趨勢(shì),ROS含量在光照3 min時(shí)最高。外源性ROS進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部,而兼性厭氧菌體內(nèi)含有SOD和POD等抗氧化酶,因此細(xì)胞本身具有ROS耐受性,少量ROS不會(huì)嚴(yán)重影響細(xì)胞活性。隨著光照時(shí)間延長(zhǎng),ROS含量超出細(xì)菌耐受極限,防御系統(tǒng)崩潰,致使細(xì)胞死亡,熒光強(qiáng)度下降。
圖3 光動(dòng)力處理對(duì)S.aureus細(xì)胞內(nèi)ROS的影響Fig.3 Effect of PDI treatment on intracellular ROS in S.aureus
結(jié)合圖2結(jié)果可得:隨光照時(shí)間延長(zhǎng),ROS產(chǎn)量逐漸增多,攻擊細(xì)胞;同時(shí)細(xì)胞內(nèi)ROS含量升高,大量細(xì)胞進(jìn)入VBNC狀態(tài);當(dāng)ROS產(chǎn)生量超出細(xì)胞耐受極限時(shí),ROS殺死處于VBNC狀態(tài)的細(xì)胞,細(xì)菌生命活性下降,表現(xiàn)為熒光強(qiáng)度降低。因此,PDI是一個(gè)損傷逐漸積累的過(guò)程,只有ROS達(dá)到一定程度才能起到殺死細(xì)菌的作用。
2.2.3 對(duì)S.aureus細(xì)胞形態(tài)的影響
圖4為流式細(xì)胞儀對(duì)不同光照時(shí)間下S.aureus細(xì)胞形態(tài)的檢測(cè)結(jié)果。理論上FSC與細(xì)胞大小有關(guān),SSC與細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核膜有關(guān)。隨著光照時(shí)間延長(zhǎng),中心區(qū)域不再集中,向左下和右上擴(kuò)散,表現(xiàn)為細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化,大小不均,內(nèi)容物含量差異增加。這說(shuō)明PDI處理改變細(xì)胞形態(tài),破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu),導(dǎo)致細(xì)胞物質(zhì)運(yùn)輸受阻和細(xì)胞內(nèi)容物泄漏。這可能會(huì)導(dǎo)致部分細(xì)胞不能向外運(yùn)輸物質(zhì),細(xì)胞增大;也可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外滲透壓失去平衡,發(fā)生細(xì)胞皺縮現(xiàn)象[38]。細(xì)胞SSC和FSC信號(hào)變小,說(shuō)明ROS致使部分細(xì)菌細(xì)胞膜破裂形成細(xì)小碎片,并伴有內(nèi)容物泄漏[39]。少量細(xì)胞SSC和FSC信號(hào)增強(qiáng),細(xì)胞膜破裂,可能發(fā)生膜黏連現(xiàn)象。因此,PDI處理致使細(xì)胞死亡的原因可能是ROS作用于細(xì)胞膜,致使細(xì)胞膜嚴(yán)重受損或者物質(zhì)運(yùn)輸受阻,最終細(xì)胞因?yàn)椴荒苓M(jìn)行正常生命活動(dòng)而死亡。
圖4 光動(dòng)力處理對(duì)S.aureus細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.4 Effect of PDI treatment on cell morphology of S.aureus
2.3.1 光動(dòng)力涂膜對(duì)細(xì)胞膜通透性的影響
首先,研究不同溶液處理對(duì)S.aureus細(xì)胞膜通透性的影響。DNA作為遺傳物質(zhì),存在于S.aureus細(xì)胞內(nèi)部,最大吸光度在260 nm波長(zhǎng)處;當(dāng)細(xì)胞膜和細(xì)胞壁受到破壞時(shí),其內(nèi)部核酸物質(zhì)泄漏,泄漏程度與細(xì)胞膜通透性相關(guān),因此用上清液中核酸含量評(píng)價(jià)細(xì)胞膜通透性。如圖5a所示,Cs、CCs/dark、和CCs/light組OD260nm與空白組相比分別上升了14.18%、19.15%和25.33%。可能是因?yàn)镾.aureus細(xì)胞膜被殼聚糖、姜黃素和ROS破壞,核酸物質(zhì)從細(xì)胞內(nèi)泄漏到培養(yǎng)基中。因此,殼聚糖、姜黃素和ROS皆可引起S.aureus細(xì)胞膜通透性增加。而且CCs/light組中產(chǎn)有外源性ROS,對(duì)細(xì)胞膜通透性影響最顯著(P<0.01)。S.aureus死亡和細(xì)胞膜通透性增加直接相關(guān)。進(jìn)一步通過(guò)蛋白質(zhì)泄漏實(shí)驗(yàn)評(píng)估PDI處理對(duì)細(xì)胞膜通透性的影響。如圖5b所示,CCs/light組上清液中蛋白質(zhì)量濃度極顯著提高(P<0.01),說(shuō)明ROS與殼聚糖和姜黃素相比有更強(qiáng)的破壞作用,這與路振康等[40]的結(jié)果一致。蛋白質(zhì)泄漏情況與核酸泄漏情況相似,進(jìn)一步說(shuō)明PDI處理能夠增加細(xì)菌細(xì)胞膜通透性。
圖5 光動(dòng)力涂膜對(duì)S.aureus細(xì)胞膜的影響Fig.5 Effect of PDI treatment on cell membrane of S.aureus
如圖5c所示,與空白相比,經(jīng)CCs/light處理的細(xì)菌MDA濃度極顯著增加(P<0.01)。MDA是細(xì)菌脂質(zhì)膜過(guò)氧化的最典型產(chǎn)物之一。MDA濃度升高是細(xì)胞膜上磷脂分子氧化所導(dǎo)致的,磷脂分子的過(guò)度氧化會(huì)改變細(xì)胞膜通透性,這說(shuō)明ROS通過(guò)氧化細(xì)胞膜磷脂分子進(jìn)而影響細(xì)胞膜通透性。
2.3.2 光動(dòng)力涂膜對(duì)S.aureus微觀形態(tài)的影響
盡管通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)定已經(jīng)證明PDI處理會(huì)導(dǎo)致部分細(xì)胞形態(tài)變化,但具體結(jié)果尚不清晰。為進(jìn)一步明確結(jié)構(gòu)微觀變化,研究采用SEM揭示PDI處理后S.aureus細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)層面的變化。如圖6a所示,KB組S.aureus表現(xiàn)出正常的細(xì)胞形態(tài),呈球形或橢圓形,大小均一、形態(tài)完整、表面光滑。在Cs組中,經(jīng)殼聚糖涂膜溶液處理后細(xì)菌表面附著大量殼聚糖顆粒(圖6b),表明殼聚糖可以吸附于細(xì)菌細(xì)胞壁表面。此外,細(xì)胞表面粗糙、出現(xiàn)褶皺和裂痕,少量細(xì)胞表面出現(xiàn)孔洞,但大部分細(xì)胞仍維持原有形態(tài)。這是由于殼聚糖與S.aureus表面蛋白質(zhì)、磷脂等發(fā)生靜電吸引作用,改變了細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)[22]。經(jīng)CCs/dark處理的S.aureus表面也吸附了大量顆粒(圖6d),而與Cs、Curs/light處理相比(圖6b、c),CCs組表面顆粒大小明顯高于兩組,說(shuō)明殼聚糖的存在增加了姜黃素在細(xì)胞表面的吸附量。為了進(jìn)一步驗(yàn)證該結(jié)果,采用紫外-可見(jiàn)全光譜掃描測(cè)定了殼聚糖對(duì)姜黃素的吸附效果,結(jié)果如圖6f所示。由姜黃素的最大吸光度可知,姜黃素在蒸餾水和乙酸溶液中溶解度較差,而在Cs中溶解度明顯高于二者,這是由于殼聚糖分子載體作用[18-20]。為了揭示二者的相互作用,測(cè)定二者的傅里葉變換紅外光譜。結(jié)果表明,殼聚糖和姜黃素之間未產(chǎn)生新的化學(xué)鍵,但是羥基(3 283.96 cm-1)的強(qiáng)度和波數(shù)發(fā)生了變化(圖6g),這是由非共價(jià)相互作用和氫鍵共同作用的結(jié)果,該結(jié)果與Roy等[18]研究結(jié)果相同。上述結(jié)果表明,殼聚糖發(fā)揮了紐帶作用,增強(qiáng)姜黃素和細(xì)菌的結(jié)合能力。結(jié)合之后的CCs,經(jīng)PDI處理后,S.aureus細(xì)胞呈現(xiàn)嚴(yán)重?fù)p傷,細(xì)胞膜遭到破壞,細(xì)胞內(nèi)容物大面積泄漏,失去細(xì)胞正常形態(tài),形成很多碎片和空殼(圖6e),該結(jié)果與Yuan Yuan等[41]的報(bào)道相似。與Curs/light結(jié)果對(duì)比說(shuō)明,殼聚糖增強(qiáng)了姜黃素對(duì)細(xì)菌的PDI效果,同時(shí)也說(shuō)明對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不可逆損傷,最終造成細(xì)胞破裂是殼聚糖、姜黃素和ROS共同作用于細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的結(jié)果,其中ROS影響最大。圖6結(jié)果在驗(yàn)證上述核酸、蛋白質(zhì)和MDA測(cè)定結(jié)果的同時(shí),說(shuō)明殼聚糖在連接姜黃素和細(xì)菌過(guò)程中發(fā)揮重要作用,同時(shí)也論證了PDI處理破壞細(xì)菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性的結(jié)論。細(xì)胞膜作為細(xì)胞屏障,其完整性是細(xì)胞生長(zhǎng)、繁殖和其他生理活動(dòng)的基礎(chǔ),細(xì)胞膜破損程度,直接影響細(xì)胞生命活性[42-43]。PDI處理通過(guò)作用于細(xì)胞膜,破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞壁結(jié)構(gòu),促使細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、多糖等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)泄漏。隨著破壞程度增強(qiáng),細(xì)胞內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量降低,將無(wú)法維持細(xì)胞正常生命活動(dòng)。
圖6 SEM觀察光動(dòng)力涂膜處理后S.aureus微觀形態(tài)和涂膜溶液表征Fig.6 Microscopic morphology of S.aureus after PDI treatment observed by SEM and characterization of CCs
2.3.3 光動(dòng)力涂膜對(duì)S.aureus細(xì)胞內(nèi)源酶活性的影響
AKP在微生物體內(nèi)可直接參與磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移和代謝,存在于細(xì)胞壁和細(xì)胞膜之間。細(xì)胞壁受損時(shí),AKP由胞內(nèi)滲出,細(xì)菌磷酸基團(tuán)代謝途徑受到影響。如圖7a所示,經(jīng)Cs處理后,S.aureusAKP活性極顯著高于KB組(P<0.01)。這是因?yàn)闅ぞ厶欠肿釉黾恿薙.aureus細(xì)胞壁通透性,使AKP從細(xì)胞膜中泄漏出來(lái)。而CCs/light處理后S.aureus較Cs組AKP活性下降。這是因?yàn)镽OS非靶向攻擊蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu),影響二級(jí)結(jié)構(gòu)形成,破壞AKP完整性,促使AKP活性位點(diǎn)消失,進(jìn)而使S.aureusAKP活性下降。AKP活性改變,說(shuō)明ROS能破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu),同時(shí)攻擊細(xì)胞內(nèi)源酶,破壞細(xì)胞正常代謝途徑。
圖7 光動(dòng)力涂膜對(duì)S.aureus酶活性的影響Fig.7 Effect of PDI treatment on enzyme activities in S.aureus
ATP存在于細(xì)菌細(xì)胞膜中,通過(guò)糖酵解過(guò)程產(chǎn)生。細(xì)菌細(xì)胞膜上有多種酶可以促進(jìn)ATP生成和代謝。ATP酶是這種機(jī)制中最重要的酶之一,其主要是利用ATP水解產(chǎn)生的能量對(duì)Na+、K+、Ca2+、Mg2+等進(jìn)行由低濃度至高濃度運(yùn)輸,保持膜內(nèi)外離子濃度的平衡,維持正常生命活動(dòng),因此能夠通過(guò)ATP酶活性變化分析PDI處理對(duì)菌體細(xì)胞的影響。如圖7b所示,Cs、CCs/dark、與KB組相比ATP酶活性下降,CCs/light組極顯著低于KB組(P<0.01)。這是因?yàn)闅ぞ厶呛徒S素破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu),誘導(dǎo)質(zhì)子動(dòng)力勢(shì)(proton-motive force,PMF)崩潰。PMF是由Δψ和ΔpH組成的電化學(xué)梯度,PMF驅(qū)動(dòng)膜運(yùn)輸系統(tǒng)促進(jìn)ATP合成和離子及其他代謝物的積累[44]。細(xì)胞膜內(nèi)外PMF崩潰導(dǎo)致ATP酶合成相應(yīng)減少。而CCs/light組ATP酶活性最低,殼聚糖的存在使ROS更容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并作用于ATP酶,導(dǎo)致ATP酶活性進(jìn)一步下降。ATP酶失活使細(xì)胞無(wú)法通過(guò)分解ATP實(shí)現(xiàn)能量轉(zhuǎn)移以維持生命活動(dòng),最終導(dǎo)致S.aureus死亡。
圖7c、d分別是不同處理?xiàng)l件下S.aureus細(xì)胞內(nèi)SOD、POD活性。CCs/light處理組與KB組相比S.aureus細(xì)胞內(nèi)SOD和POD活性極顯著增加(P<0.01)。這是因?yàn)镻DI處理產(chǎn)生的ROS進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部,細(xì)菌防御機(jī)制啟動(dòng),以SOD、POD為代表的抗氧化酶大量表達(dá)以維持內(nèi)部ROS平衡并保護(hù)細(xì)胞免受損傷。SOD將ROS催化為H2O2,隨著H2O2含量升高,細(xì)胞快速轉(zhuǎn)錄翻譯,產(chǎn)生POD將H2O2降解為H2O。因此,SOD和POD活性升高是細(xì)菌為了應(yīng)對(duì)高ROS環(huán)境做出的反應(yīng)。該結(jié)果與楊璟[45]的研究結(jié)果相似。
總之,PDI處理產(chǎn)生的ROS會(huì)引發(fā)細(xì)菌防御機(jī)制啟動(dòng),SOD、POD活性升高。隨著細(xì)胞壁被破壞,大量ROS進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。最后,因?yàn)镽OS和H2O2含量過(guò)高,細(xì)胞內(nèi)SOD、POD和其他抗氧化酶不能將其恢復(fù)到正常水平,進(jìn)而影響AKP和ATP酶活性。結(jié)果導(dǎo)致S.aureus生物合成、磷酸轉(zhuǎn)移、能量運(yùn)輸途徑受阻,從而抑制S.aureus的生長(zhǎng)。
2.3.4 光動(dòng)力涂膜對(duì)S.aureus細(xì)胞內(nèi)DNA和蛋白質(zhì)的影響
通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定光動(dòng)力涂膜對(duì)S.aureus基因組DNA的影響。如圖8a所示,空白對(duì)照組DNA電泳條帶亮度高,圖像清晰;而CCs/light組的基因組DNA條帶亮度降低,清晰度降低。ROS氧化作用是導(dǎo)致細(xì)胞DNA損傷的主要因素之一[46]。外源性ROS滲透和內(nèi)部抗氧化防御系統(tǒng)崩潰導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS含量急劇上升,進(jìn)而損傷DNA[47]。另外,外源性ROS可直接與核酸物質(zhì)反應(yīng),DNA發(fā)生氧化損傷,如單鏈或雙鏈切割、交聯(lián)和堿基序列變化。DNA損傷導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄過(guò)程中斷或破壞,進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。同時(shí),ROS、殼聚糖和姜黃素可作用于參與DNA修復(fù)的酶(如DNA聚合酶),導(dǎo)致酶失活或功能改變,造成DNA損傷無(wú)法修復(fù)[48]。細(xì)胞中產(chǎn)生的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物,如MDA,也可以導(dǎo)致DNA和蛋白質(zhì)交聯(lián),引起DNA損傷[49]。
圖8 光動(dòng)力涂膜對(duì)S.aureus核酸和全細(xì)胞蛋白質(zhì)的影響Fig.8 Effect of nucleic acid and whole cell proteins in S.aureus after PDI treatment
通過(guò)SDS-PAGE測(cè)定光動(dòng)力涂膜對(duì)S.aureus蛋白質(zhì)的影響。觀察電泳圖像發(fā)現(xiàn),與KB組相比,Cs和CCs/dark組在70 kDa左右的條帶亮度下降,80 kDa左右的條帶亮度提高(圖8b),可能和細(xì)菌的應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)。而CCs/light組的蛋白質(zhì)條帶嚴(yán)重降解,說(shuō)明ROS在細(xì)胞內(nèi)部非定向氧化,使得細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)分子氧化變性,喪失原本的結(jié)構(gòu)。Dosselli等[50]的研究同樣證明了ROS攻擊蛋白質(zhì)使得一級(jí)結(jié)構(gòu)破壞,喪失生物活性;并且芳香族氨基酸容易受到ROS的攻擊[51]。部分胞內(nèi)酶由蛋白質(zhì)構(gòu)成,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)損傷也是影響酶活性的重要原因。另外,基因組DNA損傷影響RNA轉(zhuǎn)錄翻譯,細(xì)菌蛋白質(zhì)合成能力下降是蛋白質(zhì)條帶降解的重要原因。
綜上所述,ROS通過(guò)破壞細(xì)胞膜致使細(xì)胞內(nèi)ROS含量急速增加,最后因細(xì)胞內(nèi)ROS含量過(guò)高導(dǎo)致細(xì)胞防御系統(tǒng)崩潰,損傷細(xì)菌基因組DNA和蛋白質(zhì)等生物大分子。因此,PDI清除S.aureus是多靶點(diǎn)致死效應(yīng)導(dǎo)致的結(jié)果,而ROS破壞細(xì)菌體內(nèi)DNA和蛋白質(zhì)導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生不可逆損傷,是造成S.aureus死亡的重要因素。
為促進(jìn)姜黃素與細(xì)菌的結(jié)合,改善PDI處理時(shí)姜黃素利用率低的問(wèn)題,本研究利用殼聚糖的細(xì)菌黏附性特點(diǎn)制備了殼聚糖/姜黃素光動(dòng)力涂膜以增強(qiáng)PDI抑菌效果。在此基礎(chǔ)上,探究了影響涂膜抑菌效率的關(guān)鍵因素及PDI抑菌機(jī)理。結(jié)果顯示,PDI處理對(duì)S.aureus有優(yōu)異的抑制作用,姜黃素質(zhì)量濃度為25 mg/L的殼聚糖涂膜溶液在波長(zhǎng)為420 nm藍(lán)光處光照僅5 min,對(duì)S.aureus可達(dá)到99.9%以上的滅活效果。殼聚糖的加入增強(qiáng)了姜黃素和細(xì)菌的結(jié)合,有利于PDI處理產(chǎn)生的ROS直接作用于細(xì)胞膜,破壞細(xì)菌第一層屏障,進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),致使細(xì)菌細(xì)胞形態(tài)改變,蛋白質(zhì)和DNA泄漏。同時(shí),ROS作用于AKP、ATP酶、POD和SOD等內(nèi)源酶,進(jìn)而破壞細(xì)胞內(nèi)生物合成、能量轉(zhuǎn)化和細(xì)胞防御系統(tǒng),并且影響細(xì)胞內(nèi)DNA和蛋白質(zhì)等生物大分子,影響RNA轉(zhuǎn)錄、DNA自我修復(fù)、酶的合成和細(xì)胞膜修復(fù),最終導(dǎo)致S.aureus死亡。綜上,PDI是一種損傷逐漸積累的多靶點(diǎn)殺菌技術(shù)。本研究結(jié)果可為PDI在食品安全領(lǐng)域中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。