李麗品, 馬素艷, 安入征

(河北省石家莊市平安醫(yī)院腫瘤科, 河北 石家莊 050000)

宮頸癌是婦女最常見的癌癥之一,其發(fā)病率和死亡率在女性惡性腫瘤中排名第四。由于其持續(xù)耐藥和反復(fù)復(fù)發(fā),患者預(yù)后較差[1]。因此尋求新的治療藥物對(duì)宮頸癌的治療至關(guān)重要。近年來(lái),中草藥在癌癥治療中被廣泛研究,槐耳(Trametes robiniophila Murr)作為一種傳統(tǒng)中草藥被廣泛應(yīng)用于許多疾病,近年來(lái),槐耳被廣泛應(yīng)用于抗腫瘤藥物的研究,槐耳多糖(Huaier polysaccharide,HP)是槐耳提取物,可增強(qiáng)機(jī)體免疫、抗氧化、抗炎反應(yīng),其在胃癌、乳腺癌等多種癌癥中可促進(jìn)細(xì)胞凋亡,表現(xiàn)出良好的抗腫瘤作用[2],但其在宮頸癌中抗癌作用及機(jī)制尚不清楚。1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate,S1P)是鞘脂代謝的中心分子,決定細(xì)胞的命運(yùn),由鞘脂苷通過(guò)兩種酶(鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase 1,SPHK1),鞘氨醇激酶2(sphingosine kinase 2,SPHK2)產(chǎn)生,S1P與5種G蛋白偶聯(lián)受體(S1PR1-5s)結(jié)合,在調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、遷移等過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用[3]。研究顯示SPHK-S1P-S1PRs信號(hào)通路在細(xì)胞增殖生長(zhǎng)中發(fā)揮作用,SPHK1的過(guò)度激活可能促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[4-5]。宮頸癌中SPHK1高表達(dá),沉默SPHK1宮頸癌細(xì)胞細(xì)胞活性、增殖能力顯著降低,細(xì)胞凋亡率顯著升高。槐耳多糖影響宮頸癌發(fā)生機(jī)制是否與SPHK1/S1P/S1PR3信號(hào)通路有關(guān)尚不清楚。本研究基于SPHK1/S1P/S1PR3信號(hào)通路,探究槐耳多糖對(duì)宮頸癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響及機(jī)制,為宮頸癌治療提供理論參考。

1 材料與方法

1.1材料:人宮頸癌細(xì)胞HeLa(CL-0101)購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司;槐耳多糖(Huaier polysaccharide,HP)(S28138)購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司;SPHK1激活劑K6PC-5(E1218)購(gòu)自Selleck公司;RPMI 1640培養(yǎng)基(11875176)購(gòu)自賽默飛公司;MTT試劑盒(CT0002)購(gòu)自山東思科捷生物技術(shù)有限公司;Edu細(xì)胞增殖試劑盒(E-CK-A377)購(gòu)自武漢伊萊瑞特公司;一抗Snail(A5243)、N-cadherin(A3045)、E-cadherin(A3044)、SPHK1(A0139)、S1PR3(A1404)、GAPDH(AC001)購(gòu)自ABclonal公司;一抗S1P(ab59870)及二抗山羊抗兔IgG(ab205718)購(gòu)自Abcam公司。

1.2方 法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及MTT檢測(cè)細(xì)胞活力:HeLa細(xì)胞于RPMI 1640培養(yǎng)基(添加10%胎牛血清)中培養(yǎng)(37℃,5% CO2),并進(jìn)行消化傳代,當(dāng)細(xì)胞合流度達(dá)到90%時(shí),進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞接種于96孔板。孵育過(guò)夜后,用不同濃度(0μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL)的槐耳多糖溶液替換培養(yǎng)基,24、48和72h后加入MTT溶液,孵育4h。隨后,每孔中的溶液小心用DMSO替換10min。在酶標(biāo)儀中490nm波長(zhǎng)下讀取吸光度值,并計(jì)算細(xì)胞活力。

1.2.2分組及處理:將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞分為對(duì)照組(Control組)、槐耳多糖低、中、高濃度組(HP-L、HP-M、HP-H組)和槐耳多糖高濃度+SPHK1激活劑K6PC-5組(HP-H+K6PC-5組)。HP-L、HP-M、HP-H組分別使用50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL槐耳多糖溶液處理細(xì)胞24h,HP-H+K6PC-5組使用200μg/mL槐耳多糖溶液和10μM的K6PC-5共處理細(xì)胞24h。

1.2.3Edu檢測(cè)細(xì)胞增殖:按照1.2.2中的分組處理細(xì)胞,并接種于96孔板(4.0×104/孔)培養(yǎng)24h,去除培養(yǎng)基后,用Edu處理2h。丟棄含有Edu的培養(yǎng)基后,用4%甲醛和0.5% Triton X-100溶液固定細(xì)胞透化細(xì)胞,DAPI對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色,熒光顯微鏡下觀察Edu陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),并計(jì)算Edu陽(yáng)性細(xì)胞率。

1.2.4細(xì)胞遷移和侵襲能力檢測(cè):將各組細(xì)胞接種于24孔板中,當(dāng)細(xì)胞達(dá)到約90%匯合時(shí),用移液管吸頭刮擦細(xì)胞單層以形成均勻劃痕,用無(wú)血清磷酸鹽緩沖液沖洗后將在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)。光學(xué)顯微鏡下拍照觀察0h和24h劃痕的融合情況,并計(jì)算細(xì)胞劃痕愈合率。使用24孔Transwell裝置進(jìn)行體外侵襲試驗(yàn),上腔接種各組細(xì)胞(1×104/mL),下腔為10%胎牛血清的培養(yǎng)基。1d后,通過(guò)多聚甲醛和結(jié)晶紫對(duì)下室的侵襲的細(xì)胞進(jìn)行固定、染色,光學(xué)顯微鏡拍照觀察,并計(jì)算侵襲細(xì)胞數(shù)量。

1.2.5Western blot檢測(cè)蛋白水平:收集處理后的細(xì)胞,裂解緩沖液中裂解。經(jīng)10% SDS-PAGE電泳分離、轉(zhuǎn)膜、封閉后,與一抗SPHK1、S1P、S1PR3、Snail、N-cadherin、E-cadherin及GAPDH過(guò)夜孵育(4℃)。后與相應(yīng)二抗孵育1h(室溫)。ECL進(jìn)行顯影,Image J計(jì)算蛋白條帶灰度值。

2 結(jié) 果

2.1槐耳多糖對(duì)宮頸癌細(xì)胞活力的影響:不同濃度HP處理宮頸癌細(xì)胞24、48、72h后,細(xì)胞活力逐漸降低,除25μg/mL處理濃度外,其與各濃度處理的細(xì)胞活力顯著降低(P<0.05)。為保證一定存活率,選擇50、100、200μg/mL的HP用于后續(xù)研究。見圖1。

圖1 槐耳多糖對(duì)宮頸癌細(xì)胞活力的影響

2.2槐耳多糖對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖的影響:與Control組比較,HP-L組、HP-M組和HP-H組細(xì)胞Edu陽(yáng)性率依次降低(P<0.05)。與HP-H組比較,HP-H+K6PC-5組細(xì)胞Edu陽(yáng)性率顯著升高(P<0.05),見圖2、3。

圖2 Edu檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況(×200)

圖3 槐耳多糖對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖的影響

2.3槐耳多糖對(duì)宮頸癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響:與Control組比較,HP-L組、HP-M組和HP-H組細(xì)胞侵襲數(shù)、劃痕愈合率依次降低(P<0.05)。與HP-H組比較,HP-H+K6PC-5組細(xì)胞侵襲數(shù)、劃痕愈合率顯著升高(P<0.05),見圖4、圖5、圖6。

圖4 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞遷移能力

圖5 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞侵襲能力(×200)

圖6 槐耳多糖對(duì)宮頸癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響

2.4槐耳多糖對(duì)宮頸癌細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin、Snail蛋白水平的影響:與Control組比較,HP-L組、HP-M組和HP-H組E-cadherin水平依次升高,N-cadherin、Snail水平依次降低(P<0.05)。與HP-H組比較,HP-H+K6PC-5組E-cadherin水平顯著降低,N-cadherin、Snail水平顯著升高(P<0.05),見圖7、8。

圖7 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白水平

圖8 槐耳多糖對(duì)宮頸癌細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin、Snail蛋白水平的影響

2.5槐耳多糖對(duì)宮頸癌細(xì)胞SPHK1、S1P、S1PR3蛋白水平的影響:與Control組比較,HP-L組、HP-M組和HP-H組SPHK1、S1P、S1PR3蛋白水平依次降低(P<0.05)。與HP-H組比較,HP-H+K6PC-5組SPHK1、S1P、S1PR3蛋白水平顯著升高(P<0.05),見圖9、10。

圖9 Western blot檢測(cè)通路相關(guān)蛋白水平

圖10 槐耳多糖對(duì)宮頸癌細(xì)胞SPHK1、S1P、S1PR3蛋白水平的影響

3 討 論

宮頸癌是全世界婦女癌癥死亡的第四大原因,由于其高發(fā)病率和死亡率,對(duì)有效的診斷、治療和預(yù)防藥物的需求未得到滿足,雖然放療和化療等方式在宮頸癌上取得了較好的治療效果,但耐藥性的產(chǎn)生使患者預(yù)后較差[6]。

槐耳多糖是一種由6個(gè)單糖和18個(gè)氨基酸組成的活性成分,是中草藥槐耳的主要提取物,對(duì)癌細(xì)胞具有抑制作用[7]。本研究結(jié)果顯示槐耳多糖處理HeLa細(xì)胞后,細(xì)胞活力、增殖能力均降低,與前人研究結(jié)果相似[8]。表明槐耳多糖具有抑癌作用,可降低宮頸癌細(xì)胞活力,抑制其增殖。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)在癌癥的進(jìn)展、侵襲、遷移中起著關(guān)鍵作用,上皮細(xì)胞通過(guò)失去細(xì)胞極性和上皮標(biāo)記物(E-cadherin)的表達(dá)發(fā)生表型轉(zhuǎn)換,通過(guò)獲得間充質(zhì)標(biāo)記物(N-cadherin,Snail)的表達(dá)成為間充質(zhì)細(xì)胞,表現(xiàn)出細(xì)胞間粘連減少和運(yùn)動(dòng)性增加,因此E-鈣粘蛋白的丟失,是EMT過(guò)渡過(guò)程中的關(guān)鍵步驟[9]。有研究表明槐耳多糖可通過(guò)抑制EMT抑制癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲[10]。本研究中槐耳多糖處理后HeLa細(xì)胞N-cadherin、Snail水平降低,E-cadherin蛋白上調(diào),其遷移及侵襲能力受到抑制,與雷蕾等研究結(jié)果相似[11]。表明槐耳多糖可能通過(guò)抑制EMT進(jìn)展抑制宮頸癌細(xì)胞的侵襲和遷移。

據(jù)報(bào)道SPHK1/S1P/S1RP3信號(hào)通路在癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移及腫瘤血管生成中起重要作用[12]。有研究表明SPHK1在大多數(shù)癌癥中普遍表達(dá),SPHK1的過(guò)度激活促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展,SPHK1是S1P合成的主要酶,控制著S1P的水平,在癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和腫瘤血管生成中起重要作用[13]。Zhang[14]等研究表明SPHK1/2的過(guò)度表達(dá)和/或過(guò)度激活在宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展中具有重要作用,通過(guò)抑制SPHK表達(dá)能抑制細(xì)胞活力、集落形成、增殖、遷移及細(xì)胞周期進(jìn)展。本研究中細(xì)胞SPHK1、S1P、S1PR3水平隨著槐耳多糖濃度的增加依次降低,同時(shí)其增殖、遷移、侵襲能力受到抑制。而激活劑K6PC-5逆轉(zhuǎn)了槐耳多糖對(duì)細(xì)胞增殖、侵襲、遷移及SPHK1/S1P/S1RP3信號(hào)通路的抑制作用。表明槐耳多糖能抑制宮頸癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的發(fā)生,其機(jī)制可能與抑制SPHK1/S1P/S1RP3信號(hào)通路傳導(dǎo)有關(guān)。

綜上所述,槐耳多糖對(duì)宮頸癌細(xì)胞有顯著抑制作用,其作用機(jī)制可能與抑制SPHK1/S1P/S1RP3信號(hào)通路傳導(dǎo)有關(guān)。本文初步探究了槐耳多糖對(duì)宮頸癌細(xì)胞的影響,其機(jī)制復(fù)雜,且本研究未在體內(nèi)進(jìn)行驗(yàn)證,今后仍需進(jìn)行深入研究并在體內(nèi)進(jìn)行驗(yàn)證,為槐耳多糖在宮頸癌的治療應(yīng)用上提供參考。