張永卓 王 叨 劉煒青 劉玉峰 李 白 蘇淑芳

在生命過程中,從分子、細(xì)胞到機(jī)體、群體各個(gè)層次上的活動(dòng)都有顯著的生物節(jié)律現(xiàn)象,并受控于生物鐘基因[1]。生物鐘基因調(diào)控生物節(jié)律的機(jī)制及其相關(guān)疾病的研究已成為當(dāng)前生物醫(yī)學(xué)的新興領(lǐng)域和研究熱點(diǎn)[2]。Bmal1和Per2是生物鐘體系的核心鐘基因,現(xiàn)已研究證實(shí)Bmal1[3]和Per2[4]在多種腫瘤細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)節(jié)律性表達(dá),二者在體外環(huán)境下培養(yǎng)的血液腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)節(jié)律如何,相關(guān)的研究報(bào)道鮮見。本研究以淋巴系及髓系白血病細(xì)胞株,即人伯基特淋巴瘤Raji細(xì)胞株,人皮膚T細(xì)胞淋巴瘤Hut-78細(xì)胞株,彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤OCI-LY8細(xì)胞株,髓系白血病HL-60細(xì)胞株等為研究對(duì)象,通過RT-PCR法對(duì)生物鐘基因Bmal1和Per2 mRNA進(jìn)行實(shí)時(shí)定量檢測,觀察其在血液腫瘤細(xì)胞中是否存在晝夜節(jié)律波動(dòng),為根據(jù)血液腫瘤細(xì)胞自身生物節(jié)律采取時(shí)辰療法強(qiáng)化療效提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

Raji細(xì)胞、Hut-78細(xì)胞、OCI-LY8細(xì)胞由鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院張毅教授惠贈(zèng),HL-60細(xì)胞由鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院岳保紅教授惠贈(zèng);1640培養(yǎng)基(北京索萊寶科技有限公司);精制胎牛血清(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司);TRIZOL(上海生工生物工程有限公司);RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Omega公司);熒光定量PCR試劑盒(美國Omega公司);核酸分析儀、Realtime PCR儀(美國ABI公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與節(jié)律誘導(dǎo) 參照Hiroaki Taniguchi的血清休克方法誘導(dǎo)細(xì)胞生物節(jié)律[5]。4種細(xì)胞系分別接種于含10%胎牛血清的RIPA1640培養(yǎng)基,并在5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng),間隔2～3天換液。細(xì)胞生長穩(wěn)定時(shí)(對(duì)數(shù)期內(nèi))更換含0.5%胎牛血清的RIPA1640培養(yǎng)基進(jìn)行饑餓培養(yǎng)2天,饑餓培養(yǎng)后更換培養(yǎng)基為50%胎牛血清的PIRA1640培養(yǎng)基培養(yǎng)進(jìn)行血清休克誘導(dǎo)同步節(jié)律的產(chǎn)生,并將此時(shí)刻記為ZT0,2小時(shí)后更換無血清培養(yǎng)基。按照時(shí)間順序,將ZT0時(shí)刻后4小時(shí)計(jì)為ZT4,8小時(shí)后計(jì)為ZT8,以此類推。

1.2.2 目的基因及內(nèi)參引物 從NCBI數(shù)據(jù)庫中查找人Bmal1、Per2的DNA序列,應(yīng)用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物,由上海生工生物工程有限公司合成引物序列。設(shè)計(jì)如下:Bmal1:上游5'-ACTGTGCTAAGGATGGCTGTTC、下游5'-TGGTTTGTAGTTTGCTTCTGTG;Per2:上游5'-AACTGCCCCTGGACTAAGAAAT、下游5'-GTTTGACCCGCTTGGACTT;內(nèi)參β-actin:上游5'-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG、下游5'-ACTGTGCTAAGGATGGCTGTTC。

1.2.3 總RNA的提取 參照Trizol試劑盒說明操作,在ZT(0、4、8、12、16、20、24)時(shí)間點(diǎn)分別提取各細(xì)胞株的總RNA,紫外分光光度計(jì)在A260 nm、A280 nm處測定RNA濃度及純度,-80 ℃冰箱保存。

1.2.4 RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng) 參照RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,獲取cDNA,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件: 96 ℃ 2 min,95 ℃變性3 s,60 ℃退火30 s,40個(gè)循環(huán),60 ℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后,由PE 5700軟件分析結(jié)果,自動(dòng)計(jì)算定量數(shù)值。將目的基因的Ct值與內(nèi)參基因Ct值的差值△Ct反映各基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 生物鐘基因Bmal1、Per2在不同時(shí)間點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄水平

血清休克法節(jié)律誘導(dǎo)后,24小時(shí)內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)檢測到Bmal1 mRNA在OCI-LY8、Hut-78、HL-60細(xì)胞株中轉(zhuǎn)錄水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而在Raji細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Per2 mRNA在Raji、OCI-LY8、Hut-78、HL-60細(xì)胞株中24小時(shí)內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄水平均存在差異,且均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表1、表2。

表1 Bmal1 mRNA在血液腫瘤細(xì)胞中各時(shí)間點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄水平變化

表2 Per2 mRNA在血液腫瘤細(xì)胞株中各時(shí)間點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄水平變化

2.2 應(yīng)用余弦分析軟件及CronoLab軟件進(jìn)行余弦方程擬合

對(duì)目的基因mRNA表達(dá)具有明顯差異的組別,分別以時(shí)間(h)為橫坐標(biāo),以鐘基因的△Ct值為縱坐標(biāo),應(yīng)用ChronoLab軟件獲取△Ct值波動(dòng)的節(jié)律性參數(shù),并以方程F(t)=M+Acos(ωt+φ)進(jìn)行余弦函數(shù)擬合,做出△Ct值的余弦節(jié)律波動(dòng)圖(Bmal1見圖1,Per2見圖2)。通過余弦函數(shù)可知,OCI-LY8的Bmal1基因轉(zhuǎn)錄水平大致以24 h為波動(dòng)周期,其峰時(shí)和谷時(shí)分別是ZT0和ZT12,Per2基因的轉(zhuǎn)錄水平大致以16 h為波動(dòng)周期,其峰時(shí)和谷時(shí)分別是ZT12和ZT4;Hut-78細(xì)胞的Bmal1基因轉(zhuǎn)錄水平大致以8 h為波動(dòng)周期,其峰時(shí)和谷時(shí)分別是ZT4和ZT8,Per2基因的轉(zhuǎn)錄水平大致以24 h為波動(dòng)周期,其峰時(shí)和谷時(shí)分別是ZT12和ZT0;HL-60細(xì)胞Bmal1基因的轉(zhuǎn)錄水平大致以16 h為波動(dòng)周期,其峰值時(shí)段和谷值時(shí)段分別位于ZT0和ZT8,Per2基因的轉(zhuǎn)錄水平大致以24 h為波動(dòng)周期,其峰值時(shí)段和谷值時(shí)段分別位于ZT8和ZT20;Raji細(xì)胞Per2基因的轉(zhuǎn)錄水平大致以24 h為波動(dòng)周期,其峰時(shí)和谷時(shí)分別是ZT12和ZT0。

圖1 Bmal1mRNA在OCI-LY8、Hut-78、HL-60細(xì)胞株中的晝夜表達(dá)節(jié)律

圖2 Per2 mRNA在Raji、OCI-LY8、Hut-78、HL-60細(xì)胞株中的晝夜表達(dá)節(jié)律

3 討論

隨著生物科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,在90年代末和21世紀(jì)初,一批控制著生物節(jié)律的基因被相繼發(fā)現(xiàn),并命名為生物鐘基因,其中,哺乳動(dòng)物中具有代表性的生物鐘基因有per、bmal、tim、clock基因等[6]。近年有研究發(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展與生物鐘基因的關(guān)系非常密切[7]。鐘基因具有調(diào)控細(xì)胞周期控制基因,抑制原癌基因,調(diào)控DNA損傷修復(fù)基因等作用[8],而鐘基因的失活將導(dǎo)致上述基因失去周期節(jié)律性控制而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[9]。

目前研究顯示,腫瘤細(xì)胞擁有與宿主不同的生物鐘節(jié)律表達(dá)[10],所以在節(jié)律中樞視交叉上核(suprachiasmatic nucleus,SCN)的調(diào)節(jié)下,表現(xiàn)出了和宿主正常細(xì)胞所不一樣的細(xì)胞代謝生長節(jié)律特點(diǎn)。流行病學(xué)調(diào)查顯示生物鐘節(jié)律的紊亂與腫瘤的發(fā)病率有較大的相關(guān)性[11]。研究并揭示腫瘤細(xì)胞內(nèi)生物鐘基因的表達(dá)規(guī)律,有利于我們更好地理解腫瘤的發(fā)病機(jī)制,并利用腫瘤細(xì)胞的生物鐘節(jié)律,為時(shí)辰治療提供理論數(shù)據(jù)。

近年來研究報(bào)道核心生物鐘基因Bmal1與Per2與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[12]。目前國內(nèi)外尚未見有關(guān)Bmal1和Per2在血液系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)規(guī)律的研究報(bào)道。本研究以4種血液腫瘤細(xì)胞株為研究對(duì)象,通過RT-PCR法定時(shí)檢測Bmal1 mRNA和Per2 mRNA 24小時(shí)內(nèi)的轉(zhuǎn)錄水平變化,以揭示Bmal1與Per2在不同血液腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)規(guī)律。由于體外培養(yǎng)條件下腫瘤細(xì)胞內(nèi)生物基因轉(zhuǎn)錄水平較低且晝夜波動(dòng)現(xiàn)象不明顯,為了進(jìn)行體外培養(yǎng)條件下細(xì)胞內(nèi)生物鐘基因表達(dá)規(guī)律的研究,需對(duì)細(xì)胞節(jié)律進(jìn)行統(tǒng)一誘導(dǎo)。本研究采用血清休克法誘導(dǎo)Bmal1 mRNA及Per2 mRNA節(jié)律表達(dá),經(jīng)RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)Per2在4種細(xì)胞內(nèi)均呈節(jié)律性表達(dá),Bmal1僅在OCI-LY8、Hut-78、HL-60細(xì)胞內(nèi)呈節(jié)律性表達(dá),多數(shù)表現(xiàn)為超日節(jié)律(<20 h),Raji細(xì)胞內(nèi)Bmal1表達(dá)水平未見明顯周期性變化。進(jìn)一步對(duì)比分析發(fā)現(xiàn),不同細(xì)胞來源的腫瘤細(xì)胞具有不同的表達(dá)周期規(guī)律。

早在1985年,William Hrushesky等就報(bào)道過腫瘤細(xì)胞對(duì)抗癌藥物具有一定的時(shí)間敏感性,表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞在某一時(shí)間內(nèi)對(duì)抗癌藥物相對(duì)敏感,而另一時(shí)間則相對(duì)不敏感[13]。因此,以生物節(jié)律理論為基礎(chǔ)的時(shí)辰治療可以增加化療藥物療效、減輕藥物相關(guān)的毒副作用,是一種新的腫瘤治療策略,并已在臨床試驗(yàn)中取得顯著的療效[14]。本研究充分揭示了調(diào)控生物節(jié)律的核心鐘基因Bmal1和Per2在4種不同血液腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)節(jié)律,進(jìn)一步研究在不同鐘基因表達(dá)量的時(shí)間點(diǎn)上細(xì)胞對(duì)藥物的不同敏感性,可為個(gè)體化治療及不同時(shí)點(diǎn)用藥提供理論基礎(chǔ)。