李偉,江陶,馮雪莉,程吉兵,唐玲

(川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院,1.藥劑科;2.骨科;3.檢驗(yàn)科,四川 南充 637000)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)是在臨床上常見的一種消化系統(tǒng)惡性腫瘤,包括結(jié)腸癌和直腸癌[1]。目前認(rèn)為,其發(fā)生的分子基礎(chǔ)主要是原癌基因和抑癌基因表達(dá)水平的失衡[2]。有研究[3-4]報(bào)道,CRC發(fā)病數(shù)量達(dá)到193萬(wàn)例以上,占這一年確診惡性腫瘤的9.7%,且其發(fā)病率排名第三,致死率排名第二,對(duì)CRC患者的生命造成嚴(yán)重威脅,因此尋找其發(fā)病機(jī)制進(jìn)行具體研究至關(guān)重要[5]。補(bǔ)骨脂是一種中草藥,而巴伐奇寧(bavachinin,BVC)是從補(bǔ)骨脂中提取出的一種活性黃烷酮類物質(zhì),研究[6]發(fā)現(xiàn),BVC具有抗血管生成、抗炎等多種功能。Zhao等[7]研究發(fā)現(xiàn),BVC可以誘導(dǎo)結(jié)腸腫瘤中細(xì)胞的凋亡。已有研究[8]發(fā)現(xiàn),磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信號(hào)通路在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有重要作用。在胃癌中,激活PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路,會(huì)促進(jìn)胃癌的進(jìn)展[9]。因此,本研究基于PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路探究BVC對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞惡性進(jìn)展的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

人結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW480細(xì)胞購(gòu)自北京伊塔生物科技有限公司。

1.2 主要試劑與儀器

RPMI 1640培養(yǎng)基(上海富雨生物科技有限公司,貨號(hào):FY-PLS1368);BVC(艾美捷科技有限公司,貨號(hào):MBS3608190);Ly294002(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司,貨號(hào):KGR0049);740Y-P(武漢博歐特生物科技有限公司,貨號(hào):orb762808);胰蛋白酶(北京索萊寶科技有限公司,貨號(hào):X1020-10);96孔板(上海信帆生物科技有限公司,貨號(hào):XF-P3139);細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8(Cell Counting Kit-8,CCK-8)(艾美捷科技有限公司,貨號(hào):BY-Q50356);PBS(武漢益普生物科技有限公司,貨號(hào):PB180521);AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(上海復(fù)申生物科技有限公司,貨號(hào):556547);6孔板(上海研謹(jǐn)生物科技有限公司,貨號(hào):J-SYA0352);基質(zhì)膠(Matrigel)(上海研卉生物科技有限公司,貨號(hào):354234);Transwell(上海代軒生物科技有限公司,貨號(hào):3422);結(jié)晶紫(北京伊塔生物科技有限公司,貨號(hào):YT8810);蛋白裂解液(上海研謹(jǐn)生物科技有限公司,貨號(hào):RIPA20110527);總蛋白提取試劑盒(上海晶風(fēng)生物科技有限公司,貨號(hào):31013-50T);BCA試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司,貨號(hào):PA115-01];PVDF膜(愛必信(上海)生物科技有限公司,貨號(hào):abs932);脫脂奶粉(上海聯(lián)碩生物科技有限公司,貨號(hào):N/A-433);PI3K(貨號(hào):ab302958)、AKT(貨號(hào):ab278565)、mTOR(貨號(hào):ab109268)、GAPDH(貨號(hào):ab181602)抗體購(gòu)自Abcam;CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱(Eppendorf艾本德中國(guó),型號(hào):000000002);酶標(biāo)儀(美谷分子儀器(上海)有限公司,型號(hào):SpectraMax iD3);流式細(xì)胞儀(賽默飛世爾科技,型號(hào):A24858);倒置顯微鏡(Labcan Scientific,型號(hào):DMi1);凝膠成像儀(上海金鵬分析儀器有限公司,型號(hào):2020031203)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將SW480細(xì)胞接種在RPMI 1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)中,在溫度37 ℃,5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),定期對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行更換(間隔2～3 d),觀察細(xì)胞的顏色以及生長(zhǎng)狀態(tài),并據(jù)此收集細(xì)胞進(jìn)行傳代以及后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

1.3.2 細(xì)胞分組 將細(xì)胞在RPMI1640培養(yǎng)基(15%胎牛血清)中正常培養(yǎng),未做任何處理的SW480細(xì)胞作為對(duì)照組,用10 μmol/L濃度BVC處理的培養(yǎng)基培養(yǎng)的SW480細(xì)胞為低劑量巴伐奇寧組(L-BVC組),用20 μmol/L濃度BVC處理的培養(yǎng)基培養(yǎng)的SW480細(xì)胞為中劑量巴伐奇寧組(M-BVC組),用40 μmol/L濃度BVC處理的培養(yǎng)基培養(yǎng)的SW480細(xì)胞為高劑量巴伐奇寧組(H-BVC組),用濃度為25 μmol/L PI3K抑制劑Ly294002處理的培養(yǎng)基培養(yǎng)的SW480細(xì)胞作為L(zhǎng)y294002組,用濃度為30 μmol/L BVC和10 μmol/L PI3K激活劑740Y-P共同處理的培養(yǎng)基培養(yǎng)的SW480細(xì)胞作為H-BVC+740Y-P組。

1.4 CCK-8試劑盒檢測(cè)SW480細(xì)胞活性

收集1.3.2中各組培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW480細(xì)胞,用胰蛋白酶進(jìn)行消化后接種在96孔板中,并加入CCK-8溶液,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱(37 ℃,5% CO2)中進(jìn)行培養(yǎng),48 h后,用酶標(biāo)儀對(duì)各組細(xì)胞的吸光值(OD450 nm值)進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SW480細(xì)胞凋亡

收集1.3.2中各組培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW480細(xì)胞,加入胰蛋白酶消化,消化后用預(yù)冷的PBS清洗,離心取沉淀,加入結(jié)合緩沖液對(duì)沉淀中的細(xì)胞濃度進(jìn)行一定的調(diào)整,加入AnnexinV-FITC和PI,避光孵育10 min,用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SW480細(xì)胞遷移能力

收集1.3.2中各組培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW480細(xì)胞,將其分別接種于6孔板中培養(yǎng),培養(yǎng)24 h后使用槍頭的尖端輕輕劃動(dòng)6孔板,繼續(xù)培養(yǎng),24 h后取出。分別在倒置顯微鏡下觀察0 h和24 h的劃痕,并觀察細(xì)胞遷移情況,計(jì)算劃痕愈合率(%)。

1.7 Transwell法檢測(cè)SW480細(xì)胞侵襲能力

先取少量的經(jīng)過(guò)4 ℃融化的基質(zhì)膠(Matrigel)加入Transwell中進(jìn)行預(yù)包被。收集1.3.2中各組培養(yǎng)的SW480細(xì)胞用培養(yǎng)基(不含血清)進(jìn)行重懸,再加入Transwell上室中(已包被基質(zhì)膠),在Transwell下室加入培養(yǎng)基(含10%胎牛血清),置于細(xì)胞培養(yǎng)箱(37 ℃,5% CO2)中培養(yǎng)24 h,多聚甲醛固定30 min,0.1%結(jié)晶紫染色,在顯微鏡下觀察并拍照計(jì)算侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.8 Western blot檢測(cè)細(xì)胞中PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況

收集1.3.2中各組培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW480細(xì)胞,加入蛋白裂解液在冰上進(jìn)行30 min裂解,裂解后離心取上清,對(duì)各組細(xì)胞提取總蛋白(總蛋白提取試劑盒),測(cè)定蛋白總量(BCA試劑盒)。將得到的蛋白質(zhì)提取物利用SDS-PAGE凝膠電泳進(jìn)行分離,轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,冰上反應(yīng)1 h,清洗,5%的脫脂奶粉封閉30 min,清洗,分別加入(PI3K、AKT、mTOR、p-PI3K、p-AKT、p-mTOR和GAPDH)抗體,4 ℃過(guò)夜;加入二抗,室溫孵育2 h。用凝膠成像儀對(duì)蛋白表達(dá)情況進(jìn)行觀察。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 BVC對(duì)SW480細(xì)胞增殖的影響

與對(duì)照組比較,L-BVC組、M-BVC組、H-BVC組、Ly294002組的OD值均降低,且隨著BVC劑量的增加,OD值逐漸降低(P<0.05);與H-BVC組比較,H-BVC+740Y-P組的OD值顯著增加(P<0.05)。見表1。

表1 BVC對(duì)SW480細(xì)胞增殖的影響

2.2 BVC對(duì)SW480細(xì)胞凋亡的影響

與對(duì)照組比較,L-BVC組、M-BVC組、H-BVC組、Ly294002組的細(xì)胞凋亡率均升高,且隨著BVC劑量的增加,細(xì)胞凋亡率逐漸升高(P<0.05);與H-BVC組比較,H-BVC+740Y-P組的細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。見圖1及表2。

表2 BVC對(duì)SW480細(xì)胞凋亡的影響

2.3 BVC對(duì)SW480細(xì)胞遷移的影響

與對(duì)照組比較,L-BVC組、M-BVC組、H-BVC組、Ly294002組的劃痕愈合率降低,且隨著BVC劑量的增加,劃痕愈合率逐漸降低(P<0.05);與H-BVC組比較,H-BVC+740Y-P組的劃痕愈合率顯著升高(P<0.05)。見圖2和表3。

表3 BVC對(duì)SW480細(xì)胞遷移的影響

2.4 BVC對(duì)SW480細(xì)胞侵襲的影響

與對(duì)照組比較,L-BVC組、M-BVC組、H-BVC組、Ly294002組的侵襲細(xì)胞數(shù)減少,且隨著BVC劑量的增加,侵襲細(xì)胞數(shù)逐漸減少(P<0.05);與H-BVC組比較,H-BVC+740Y-P組的侵襲細(xì)胞數(shù)顯著增加(P<0.05)。見圖3及表4。

表4 BVC對(duì)SW480細(xì)胞侵襲的影響

2.5 BVC對(duì)SW480細(xì)胞中PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的影響

與對(duì)照組比較,L-BVC組、M-BVC組、H-BVC組、Ly294002組p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR /mTOR比值均降低,且隨著BVC劑量的增加,p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR比值逐漸降低(P<0.05);與H-BVC組比較,H-BVC+740Y-P組的p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR比值顯著升高(P<0.05)。見圖4及表5。

表5 各組SW480細(xì)胞中PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白水平

3 討論

目前,CRC的發(fā)病率呈現(xiàn)不斷增加的趨勢(shì),給患者家庭及醫(yī)療衛(wèi)生系統(tǒng)帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)[10-11]。臨床上常用的治療方式是以手術(shù)切除為主,靶向治療以及化療為輔,以此來(lái)提高患者的生存期[12]。隨著社會(huì)的發(fā)展,手術(shù)技術(shù)不斷提高以及化療等輔助治療方面也在不斷進(jìn)步,CRC患者的5年生存率也由原來(lái)的50%提高至65%,但仍未達(dá)到預(yù)期效果,需要進(jìn)一步深入研究[13]。CRC發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制還不明確,因此,需要深入研究其發(fā)生發(fā)展涉及的相關(guān)機(jī)制,為CRC的早期診斷以及治療提供理論依據(jù)。BVC是從中草藥中提取得到的一種物質(zhì),已有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),BVC也可誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌中細(xì)胞的凋亡[14-15]。本研究中,使用不同濃度的BVC處理SW480細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)BVC可以逐漸降低SW480細(xì)胞的OD值、劃痕愈合率、侵襲細(xì)胞數(shù),升高細(xì)胞凋亡率,表明BVC可以促進(jìn)SW480細(xì)胞的凋亡,抑制細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

PI3K是存在于胞質(zhì)內(nèi)的磷脂酰肌醇激酶,容易被一些刺激所激活,AKT是一種絲氨酸激酶,在細(xì)胞的生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮作用[16]。PI3K的激活會(huì)引起PI3K磷酸化的發(fā)生,AKT是PI3K的活化受體,會(huì)被磷酸化的PI3K招募并轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞膜上,AKT在多種酶的作用下,進(jìn)行磷酸化,并參與細(xì)胞的調(diào)節(jié),mTOR是PI3K/AKT的下游靶點(diǎn),會(huì)被磷酸化的AKT激活,從而參與細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)控[17]。Fattahi等[18]研究發(fā)現(xiàn),激活的PI3K會(huì)促使AKT的磷酸化,AKT磷酸化后進(jìn)一步激活mTOR的磷酸化,從而參與腫瘤的發(fā)展。Han等[19]研究發(fā)現(xiàn),激活PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路,可影響細(xì)胞自噬、凋亡以及相關(guān)炎癥因子的表達(dá)。Deng等[20]研究發(fā)現(xiàn),利用一定的藥物對(duì)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路進(jìn)行抑制,會(huì)促進(jìn)食道癌細(xì)胞的自噬及凋亡。本研究發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,BVC處理后SW480細(xì)胞的p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR比值均顯著降低,表明BVC可以激活PI3K,促進(jìn)其磷酸化,進(jìn)而促進(jìn)AKT、mTOR磷酸化的發(fā)生,其作用與PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路抑制劑Ly294002保持一致。隨后進(jìn)一步用PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路激活劑740Y-P進(jìn)行回補(bǔ)實(shí)驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn),H-BVC+740Y-P組OD值、劃痕愈合率、侵襲細(xì)胞數(shù)顯著升高,細(xì)胞凋亡率顯著降低,同時(shí)740Y-P的加入也促進(jìn)了PI3K/AKT/mTOR通路蛋白的磷酸化。由此推測(cè)BVC對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞惡性進(jìn)展的抑制可能與PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路被抑制有關(guān)。

綜上,BVC對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞惡性進(jìn)展的抑制可能是通過(guò)抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。