巴雅力嘎,巴特,李全,高雷,李芳,曹勝軍

(1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院,內(nèi)蒙古 包頭 014060;2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院燒傷外科·內(nèi)蒙古燒傷醫(yī)學(xué)研究所,內(nèi)蒙古 包頭 014010)

外泌體是由細(xì)胞分泌產(chǎn)生直徑30～150 nm的小囊泡,內(nèi)含各種RNA、DNA、蛋白質(zhì)等,可介導(dǎo)細(xì)胞間信息傳遞及調(diào)控細(xì)胞功能活動(dòng)[1-2]。同一個(gè)體不同細(xì)胞來(lái)源乃至不同病理生理狀態(tài)下,外泌體所含蛋白質(zhì)組及其執(zhí)行的生物學(xué)功能不盡相同[3-4]。蛋白質(zhì)組學(xué)是研究不同蛋白質(zhì)之間相互作用及其在生物體內(nèi)發(fā)揮功能的有效手段,可為疾病的診斷與治療提供一定的理論依據(jù)[5]。

創(chuàng)面修復(fù)與瘢痕防治是燒傷外科學(xué)重點(diǎn)和難點(diǎn)。脂肪干細(xì)胞源性外泌體(adipose stem cell exosomes,ADSC-Exos)具有促進(jìn)創(chuàng)面愈合、重塑及減輕瘢痕過(guò)度增生的作用[5-7],但關(guān)于ADSC-Exos 的蛋白組學(xué)研究鮮有報(bào)道。本研究以深度燒傷痂與正常皮下脂肪組織來(lái)源ADSC-Exos為研究對(duì)象,應(yīng)用非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)譜(label free quantification,LFQ)技術(shù)研究ADSC-Exos 蛋白質(zhì)組表達(dá)水平差異,篩選標(biāo)志蛋白并對(duì)其進(jìn)行分析。

1 試劑與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)主要儀器及試劑 顆粒物粒度分析儀(NanoSight NS300,英國(guó)馬爾文公司);生物型透射電子顯微鏡(Tecnai G2 SpiritBiotwin,美國(guó)FEI公司);智能型高效離心機(jī)(AvantiJXN-30,美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司);質(zhì)譜儀(timsTOF Pro,美國(guó)布魯克公司);液相色譜儀(UltiMate 3000 RSLCnano,丹麥泰爾茂費(fèi)舍爾公司);0.15%Ⅰ型膠原酶(美國(guó)Gibco公司);胎牛血清(美國(guó)Gibco 公司);BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(美國(guó)Sigma公司);成骨、成脂培養(yǎng)基(中國(guó) Cyagen Biosciences Inc.公司);碳支持膜(中國(guó)中鏡科儀公司);10%胎牛血清(美國(guó)Gibco公司);0.25%胰蛋白酶(美國(guó)Gibco公司);兔抗人CD64(日本SAB公司);兔抗人CD81單克隆抗體(日本Epitomics公司); DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司)等。

1.1.2 取材對(duì)象 實(shí)驗(yàn)組選?、蠖葻齻?10%體表面積的痂下脂肪組織,患者年齡36～54歲;對(duì)照組選取整形外科患者,取腹部抽脂術(shù)中廢棄的皮下脂肪組織,年齡38～52歲。兩種來(lái)源的脂肪組織肉眼觀察呈淡黃色,質(zhì)地均勻、光滑、富有彈性,無(wú)明顯液化、碳化、硬結(jié)。手術(shù)過(guò)程中的脂肪組織均選取肉眼觀察健康的脂肪組織,對(duì)獲取脂肪干細(xì)胞(adipose stem cell,ADSC)進(jìn)行分離與傳代,對(duì)初代ADSC-Exos進(jìn)行蛋白組學(xué)分析。兩組患者年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 樣本定量結(jié)果取log2,采用雙樣本雙尾T檢驗(yàn)的方法計(jì)算P值。 以P<0.05且差異表達(dá)量變化>1.5或<0.67分別作為顯著上調(diào)及下調(diào)的閾值。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 ADSC的分離、傳代及鑒定 將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組脂肪使用含雙抗的磷酸鹽緩沖液沖洗,除去多余組織,將脂肪組織剪碎,加入I型膠原酶消化外基質(zhì),使用濾網(wǎng)將溶解的脂肪組織從緩沖液中分離,在4 ℃條件下300×g離心除去其余夾雜細(xì)胞,棄去上清液及脂滴,獲得初代ADSC[8]。將獲得的細(xì)胞染色,光鏡下進(jìn)行觀察,拍照記錄。采用Western blot法將培養(yǎng)基中初代細(xì)胞離心后收集蛋白質(zhì),將得到的蛋白質(zhì)電泳分離,轉(zhuǎn)移至膜上,測(cè)定CD29、CD34、CD105表達(dá)水平。使用成骨、成脂培養(yǎng)基誘導(dǎo) ADSC向成骨、成脂細(xì)胞分化,染色結(jié)果為鑒定ADSC提供參考[8]。

1.2.2 ADSC-Exos的分離與鑒定 取ADSC,用胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng),待細(xì)胞融合后用胎牛血清反復(fù)清洗,將培養(yǎng)基更換為不含胎牛血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)36～48 h,收集培養(yǎng)基上清液,采用差速離心法4 000×g離心40 min除去細(xì)胞碎片及較大囊泡,獲得外泌體濃縮液。將外泌體濃縮液移至濃度30%蔗糖/重水密度墊上,離心管100 000×g 離心2 h,收集底部外泌體[8]。取20 μL外泌體懸液滴至電子顯微鏡銅網(wǎng)狀柵中等待,負(fù)染、固定,晾干后拍照觀察。使用去離子水溶液倒入20 μL外泌體濃縮液稀釋至1 000 μL,上樣,用Nanosight顆粒粒度分析儀檢測(cè)ADSC-Exos的粒徑和濃度,評(píng)估性質(zhì)和質(zhì)量。Western blot法測(cè)定 ADSC-Exos 表面標(biāo)志物 CD81、CD64 表達(dá)水平[8]。

1.2.3 利用LFQ技術(shù)檢測(cè)ADSC-Exos蛋白組學(xué) (1)樣品處理:向ADSC-Exos中加入裂解液充分混勻,進(jìn)行組織勻漿離心,取上清。沉淀蛋白。將蛋白沉淀復(fù)溶,加入二硫蘇糖醇孵育,加入碘乙酰胺進(jìn)行烷基化反應(yīng)。利用 Bradford 法測(cè)定蛋白濃度。向還原、烷基化樣品中加入100 mmol/L Tris-HCl 溶液,將 Urea 濃度稀釋至 <2 mol/L,以酶與蛋白 1∶50質(zhì)量比加入胰蛋白酶,37 ℃孵育振蕩酶切。第2天加入三氟乙酸(trifluoroacetic acid,TFA )終止酶切,取上清進(jìn)行脫鹽,抽干-20 ℃凍存待用。(2)質(zhì)譜檢測(cè):樣品進(jìn)樣與分離通過(guò)質(zhì)譜儀在線液相色譜儀進(jìn)行。肽段樣品通過(guò)自動(dòng)進(jìn)樣器吸入,結(jié)合至補(bǔ)集柱(trap column,TC),洗脫至分析柱進(jìn)行分離。利用兩個(gè)流動(dòng)相建立分析梯度60 min。肽段進(jìn)入質(zhì)譜進(jìn)行數(shù)據(jù)依賴采集模式(data dependent acquisition,DDA)掃描。(3)數(shù)據(jù)分析:質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過(guò)MaxQuant (V1.6.6) 軟件進(jìn)行檢索,數(shù)據(jù)庫(kù)檢索算法為Andromeda,使用Uniprot中Human的蛋白質(zhì)組參考數(shù)據(jù)庫(kù)[9]。

2 結(jié)果

2.1 ADSC 的分離、培養(yǎng)與鑒定

兩組患者初代ADSC體積較小,呈多形性,細(xì)胞形態(tài)分散。第2代ADSC保持較小的細(xì)胞體積和多形性,形態(tài)更為均勻、黏附性和增殖能力進(jìn)一步增強(qiáng)。第3代ADSC細(xì)胞體積和形態(tài)更加統(tǒng)一,細(xì)胞的黏附性和增殖能力進(jìn)一步增加光鏡下呈纖維樣、漩渦狀或放射狀生長(zhǎng),偶見多角形、紡錘形。細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)ADSC 表面標(biāo)志物CD29、CD105,未表達(dá)CD34(造血系分子標(biāo)志物)。成骨誘導(dǎo)的細(xì)胞進(jìn)行茜素紅染色,鏡下見成骨細(xì)胞特征性紅色密集的鈣結(jié)節(jié)。成脂誘導(dǎo)的細(xì)胞胞漿內(nèi)有大量透亮、折光性好的脂滴,油紅O染色呈紅色。見圖1。

2.2 ADSC-Exos分離與鑒定

透射電鏡下可見分布較集中的外泌體,分散良好,直徑30～150 nm,大小均一,呈雙膜性結(jié)構(gòu)的圓形或類圓形,中央較邊緣電子密度稍低。Western blot檢測(cè)顯示,ADSC-Exos穩(wěn)定表達(dá)表面標(biāo)志物CD63、CD81。 NanoSight納米顆粒跟蹤分析表明,外泌體均勻?qū)ΨQ分布,純度較高,大部分直徑30～150 nm,符合外泌體正常的粒徑范圍。見圖2。

2.3 ADSC-Exos差異蛋白分析

基于LFQ技術(shù),實(shí)驗(yàn)組/對(duì)照組差異倍數(shù)>1.5或<0.67,通過(guò)MaxQuant (V1.6.6)軟件篩選出表達(dá)差異蛋白184個(gè),篩選上調(diào)蛋白前10位絲裂原活化蛋白激酶3(mitogen-activated protein kinase 3,MAPK3)、絲裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase 1,MAPK1)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β-1(transforming growth factor beta-1,TGF-β1)、細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)因子BAX(apoptosis regulator BAX,BAX)、熱休克蛋白HSP 90α(heat shock protein 90-alpha,HSP 90α)、微管蛋白α-1B鏈(tubulin alpha-1B chain,Tα-1B)、腺病毒E1B19kDa相互作用蛋白2(adenovirus E1B 19kDa interacting protein 2,AEIP2)、鈣調(diào)素3(calmodulin-3,Clam3)、熱休克蛋白HSP 90β(heat shock protein 90-beta,HSP 90β)、蛋白激酶Cβ型(protein kinase C beta type,PKCβ),下調(diào)蛋白前10位激肽源B1(kallikrein B1,KLKB1)、激肽源1(kininogen 1,KNG1)、補(bǔ)體C3(complement C3,C3)、補(bǔ)體C1q C鏈(complement C1q C chain,C1q C)、補(bǔ)體C1q B鏈(complement C1qB chain,C1qB)、補(bǔ)體C5(complement C5,C5)、補(bǔ)體C1q A鏈(complement C1q A chain,C1q A)、補(bǔ)體C4B(complement C4B,C4B)、補(bǔ)體C4A(complement C4A,C4A)、補(bǔ)體C9(complement C9,C9)進(jìn)行分析。見表1。

表1 不同來(lái)源ADSC-Exos蛋白表達(dá)水平差異

3 討論

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell, MSC)作為一類多能非造血成體干細(xì)胞,骨髓、肌肉、肺、肝、胰腺、脂肪等組織中均可分離培養(yǎng),來(lái)源廣泛,具有向多種細(xì)胞分化、免疫調(diào)節(jié)、自我更新、抗炎及創(chuàng)面修復(fù)的能力[10-11]。ADSC隸屬于MSC,易于獲取且具有較強(qiáng)的遷移能力,可快速集聚于受傷部位,并能夠分化為真皮成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞等,因此在創(chuàng)傷修復(fù)、組織工程、皮膚及器官移植等研究領(lǐng)域具有較廣泛的應(yīng)用潛力[12-13]。但ADSC保存及運(yùn)輸較困難,移植異體ADSC易誘發(fā)較強(qiáng)的排斥反應(yīng)、并存在潛在致瘤風(fēng)險(xiǎn)、倫理學(xué)等問(wèn)題,其在燒、創(chuàng)傷患者救治中的臨床應(yīng)用受限[1,12]。胞吐是細(xì)胞執(zhí)行生物學(xué)功能的重要途徑,外泌體是細(xì)胞胞吐后的重要成分[14-15],且外泌體在無(wú)活體細(xì)胞的情況下仍可發(fā)揮與母細(xì)胞相似的生理功能[5-6]。因此,ADSC-Exos無(wú)免疫原性,與母細(xì)胞功能高度同源且特異性較強(qiáng),在內(nèi)環(huán)境中較穩(wěn)定,并易于量化、保存方便,可彌補(bǔ)ADSC臨床應(yīng)用的缺陷[16-17]。本研究利用高速離心法分離出直徑30～150nm細(xì)胞外泌體,分別通過(guò)電鏡觀察、Western blot、納米顆粒跟蹤分析儀證實(shí)其為ADSC-Exos,證明實(shí)驗(yàn)獲取的外泌體具有一定的穩(wěn)定性和可靠性。

蛋白組學(xué)研究可為ADSC-Exos在燒、創(chuàng)傷中實(shí)現(xiàn)創(chuàng)面愈合、瘢痕過(guò)度增生及其它分子機(jī)制提供重要參考。本研究對(duì)不同來(lái)源外泌體行蛋白質(zhì)組學(xué)分析,篩選出表達(dá)差異蛋白184個(gè),分析其功能主要集中在參與創(chuàng)面修復(fù)、減輕瘢痕過(guò)度增生、抗炎及機(jī)體免疫作用等方面。MAPK3與MAPK1可調(diào)節(jié)磷酸化下游靶點(diǎn)蛋白,是重要的細(xì)胞分化、增殖誘導(dǎo)信號(hào)分子[18-19];HSP90AA1可激活相關(guān)信號(hào)通路抑制皮膚細(xì)胞凋亡[20-22],可能與促進(jìn)局部創(chuàng)面修復(fù)密切相關(guān)。細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)因子BAX為促凋亡基因激活物,BNIP2為抗凋亡基因激活物,兩者通過(guò)級(jí)聯(lián)反應(yīng)致調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡[23-24],可能與創(chuàng)面修復(fù)和減輕創(chuàng)面過(guò)度增生相關(guān)。PRKCB表達(dá)與炎癥、感染及細(xì)胞自噬相互聯(lián)系[25-26],KLKB1與KNG1下調(diào)可減少血管擴(kuò)張[27]。另外,補(bǔ)體家族蛋白與機(jī)體感染免疫均有一定聯(lián)系,以上蛋白下調(diào)可有效減少機(jī)體局部炎癥反應(yīng),改善局部微環(huán)境,在抗炎及調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[28]。

外泌體蛋白組學(xué)研究近年來(lái)逐漸成為生命科學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)的熱點(diǎn)領(lǐng)域。本研究通過(guò)對(duì)不同來(lái)源 ADSC-Exos 的蛋白組學(xué)進(jìn)行差異分析,初步篩選了表達(dá)水平差異蛋白,發(fā)現(xiàn)差異蛋白不僅參與創(chuàng)面修復(fù)及減輕瘢痕過(guò)度增生等作用,在抗炎、免疫、抗感染方面也有積極作用,為靶向治療藥物研發(fā)提供了有效的理論依據(jù),但具體分子機(jī)制還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)來(lái)闡明。