李慎謨 單中杰

鄭州人民醫(yī)院泌尿外科,河南省鄭州市 450000

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一,近年來其發(fā)病率呈逐年上升趨勢。在我國膀胱癌發(fā)病率居泌尿系統(tǒng)腫瘤首位,其中非肌層浸潤性膀胱癌(Non muscle invasive bladder cancer, NMIBC)患者約占初發(fā)膀胱癌的75%[1-2]。目前,臨床上關(guān)于膀胱癌的診斷主要采用膀胱鏡和尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查,但具有微創(chuàng)或靈敏度不高等特點(diǎn),導(dǎo)致其在臨床應(yīng)用均具有一定的局限性[3]。因此,尋找早期診斷和判斷預(yù)后的新指標(biāo)對于膀胱癌的早期診斷和復(fù)發(fā)的監(jiān)測具有重要意義。

NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(nucleotide binding oligomerization like receptor family pyrin domain containing3, NLRP3)是近年來發(fā)現(xiàn)的先天性免疫受體NLRs家族的重要成員,主要分布于細(xì)胞間質(zhì)和細(xì)胞膜中[4]。NLRP3與凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis associated apeck-like protein containing a CARD domain, ASC)、半胱天冬氨酸酶-1等蛋白質(zhì)分子組裝形成多聚復(fù)合物——炎癥小體,在免疫和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[5]。研究表明,NLRP3炎癥小體的異?；罨c多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[6-7]。本研究主要是對膀胱癌患者外周血細(xì)胞及尿沉渣中NLRP3基因的表達(dá)水平進(jìn)行檢測,以探討其對膀胱癌的早期診斷和復(fù)發(fā)的監(jiān)測價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年1月—2017年12月我院收治的初發(fā)膀胱癌患者68例為膀胱癌組。納入標(biāo)準(zhǔn)：均為初發(fā)膀胱癌;行經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù);術(shù)后病理證實(shí)為非肌層浸潤性膀胱癌。其中男48例,女20例,平均年齡(59.44±7.69)歲,根據(jù)2004 WHO分類進(jìn)行腫瘤分級,中低度惡性潛能乳頭狀尿路上皮腫瘤16例,低級別乳頭狀尿路上皮癌23例,高級別乳頭狀尿路上皮癌29例,按照2009 TNM分期系統(tǒng)確定腫瘤分期分為Ta期30例,T1期38例。選取同期來我院治療的泌尿系統(tǒng)良性病變(膀胱炎、膀胱結(jié)石、前列腺增生等)患者60例為良性病變組,其中男39例,女21例,平均年齡(57.63±7.67)歲。選取同期來我院健康體檢的健康人60例為對照組,即血常規(guī)、尿常規(guī)檢查無異常,無其他泌尿系統(tǒng)及免疫性疾病。其中男42例,女18例,平均年齡(58.93±7.83)歲。三組一般資料比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),具有可比性。所有受試者均對本研究知情同意并簽署知情同意書,且本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

1.2.1 資料收集及隨訪。收集所有受試者的臨床資料,包括年齡、性別、膀胱癌的分級及TNM分期等。同時(shí)對膀胱癌患者進(jìn)行術(shù)后隨訪：術(shù)后采用電話或門診定期進(jìn)行隨訪,術(shù)后1年內(nèi)每個(gè)月1次,此后每3個(gè)月1次,隨訪截止至2019年12月。無進(jìn)展生存時(shí)間為手術(shù)日至膀胱癌復(fù)發(fā)、死亡或隨訪截止日。

1.2.2 樣本采集。所有受試者留取尿液前1周內(nèi)均未接受膀胱鏡檢查或?qū)蛐g(shù)等刺激性操作。采集膀胱癌患者手術(shù)當(dāng)日空腹靜脈血和晨起中段尿各5～10mL,良性病變和健康者檢查或體檢當(dāng)日空腹靜脈血和晨起中段尿5～10mL。

1.2.3 血細(xì)胞和尿沉渣總RNA的提取。采用Ficoll-Hypaque密度分離法提取外周血單核細(xì)胞。將尿液標(biāo)本在4℃下3 000r/min離心10min,收集沉淀。將分離得到的單核細(xì)胞及尿沉渣采用PBS洗滌后,加入300μL裂解緩沖液,采用BIOG細(xì)胞RNA提取試劑盒提取外周血單核細(xì)胞及尿沉渣中總RNA,嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。以總RNA為模板,按照TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法(RT-qPCR)檢測NLRP3 mRNA的表達(dá)。采用Primer5.0設(shè)計(jì)引物,序列如下：NLRP3 上游引物：5’-CGGGGCCTCTTTTCAGTTCT-3’,下游引物：5’-CCCCAACCACAATCTCCGAA-3’;β-actin 上游引物：5’-ATCGTGCGTGACATTAAGGAG-3’;下游引物：5’-AGGAAGGAAGGCTGGAAGAG-3’,由上海生工生物工程公司合成。以β-actin為內(nèi)參,采用SYBR Green ER qPCR SuperMix(Applied Biosystems,USA)試劑盒進(jìn)行qRT-PCR檢測NLRP3 mRNA的表達(dá)。反應(yīng)條件為：95℃ 5min,95℃ 30s,55℃ 30s,40個(gè)循環(huán);最后72℃延伸5min。采用2-ΔΔCt計(jì)算NLRP3 mRNA的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 外周血單核細(xì)胞和尿沉渣NLRP3 mRNA的表達(dá) 如表1所示,三組受試者外周血單核細(xì)胞及尿沉渣NLRP3 mRNA的表達(dá)量具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。組間兩兩比較,膀胱癌組和良性病變組患者外周血單核細(xì)胞及尿沉渣NLRP3 mRNA的表達(dá)量明顯高于對照組;膀胱癌組尿沉渣NLRP3 mRNA的表達(dá)水平明顯高于良性病變組,而外周血單核細(xì)胞NLRP3 mRNA的表達(dá)水平在兩組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表1 三組患者血細(xì)胞及尿沉渣NLRP3 mRNA的表達(dá)水平

2.2 NLRP3對膀胱癌的診斷效能 采用ROC曲線分析外周血單核細(xì)胞及尿沉渣中NLRP3的表達(dá)水平對膀胱癌的診斷效能。外周血單核細(xì)胞及尿沉渣中NLRP3診斷膀胱癌的ROC曲線下面積(AUC)分別為0.754和0.922,外周血單核細(xì)胞NLRP3診斷的敏感性高于尿沉渣NLRP3,而特異性顯著低于尿沉渣NLRP3。見圖1和表2。

圖1 ROC曲線分析血細(xì)胞及尿沉渣中NLRP3表達(dá)水平對膀胱癌的診斷價(jià)值

表2 ROC曲線分析結(jié)果

2.3 NLRP3與膀胱癌患者臨床資料的相關(guān)性 根據(jù)ROC曲線分析結(jié)果,以外周血單核細(xì)胞NLRP3的表達(dá)水平1.20為最佳界限值,將膀胱癌患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組,比較兩亞組間膀胱癌患者的臨床特征資料,見表3。結(jié)果發(fā)現(xiàn),兩組患者在年齡、性別方面無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),但在膀胱癌分級及TNM分期方面具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。同樣以尿沉渣NLRP3的表達(dá)水平1.23為最佳界限值將膀胱癌患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組,結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn),尿沉渣NLRP3的表達(dá)水平與膀胱癌的分級及TNM分期具有明顯的相關(guān)性(P<0.05)。

表3 NLRP3與膀胱癌患者臨床資料的相關(guān)性[n(%)]

2.4 NLRP3與膀胱癌患者預(yù)后的相關(guān)性 所有膀胱癌患者術(shù)后進(jìn)行隨訪,隨訪時(shí)間為12～48個(gè)月,中位隨訪時(shí)間為33.5個(gè)月。隨訪期間共有18例膀胱癌患者復(fù)發(fā)或死亡,無進(jìn)展生存率為73.5%。進(jìn)一步采用Kaplan-Maier方法分析NLRP3的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系,見圖2。結(jié)果發(fā)現(xiàn),外周血單核細(xì)胞NLRP3低表達(dá)組患者的無進(jìn)展生存率為85.7%,而高表達(dá)組的無進(jìn)展生存率為70.4%,兩組間無明顯差異(χ2=2.127,P=0.145)。而尿沉渣NLRP3低表達(dá)組患者的無進(jìn)展生存率為90.5%,高表達(dá)組的無進(jìn)展生存率為66.0%,組間具有顯著差異(χ2=4.239,P=0.040)。

圖2 各組生存曲線的比較

3 討論

研究表明,炎癥反應(yīng)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用,而NLRP3炎癥小體作為目前研究最為廣泛的炎癥蛋白,一方面能夠促進(jìn)IL-1β、IL-18等炎性因子的分泌及細(xì)胞凋亡的發(fā)生,另一方面也可以介導(dǎo)抗腫瘤的免疫應(yīng)答反應(yīng),在多種疾病的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后中具有重要作用[5,8-9]。國內(nèi)學(xué)者鄭娟紅等[10]發(fā)現(xiàn)在重癥潰瘍性結(jié)腸炎患者血清中NLRP3 mRNA表達(dá)水平顯著升高,參與其臨床病理過程。在結(jié)直腸癌組織中,NLRP3的表達(dá)上調(diào),與TNM分期、遠(yuǎn)期轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)陽性及預(yù)后有關(guān),是結(jié)直腸癌預(yù)后的生物標(biāo)志物也是其潛在治療靶點(diǎn)[11]。何登等[12]研究發(fā)現(xiàn),NLRP3炎癥小體在宮頸癌組織中表達(dá)量異常增高,與腫瘤增殖、侵襲基因的表達(dá)有關(guān),過表達(dá)NLRP3可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲,影響宮頸癌病程的進(jìn)展。國內(nèi)學(xué)者張惟等[13]研究也發(fā)現(xiàn)膀胱癌組織和細(xì)胞系中NLRP3的表達(dá)升高,其表達(dá)水平與膀胱癌患者的病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分級相關(guān)。國外研究也指出在膀胱癌患者尿沉渣中炎癥小體表達(dá)升高[14]。目前國內(nèi)外的研究大多集中于研究NLRP3炎癥小體的激活與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系及其可能的機(jī)制,但關(guān)于NLRP3在膀胱癌中表達(dá)的相關(guān)研究較少,其臨床意義仍不夠明確。

本研究結(jié)果顯示,膀胱癌組和良性病變組患者外周血單核細(xì)胞及尿沉渣NLRP3 mRNA的表達(dá)量明顯高于對照組,且膀胱癌組尿沉渣NLRP3 mRNA的表達(dá)水平明顯高于良性病變組,提示尿沉渣NLRP3可能在慢性炎癥發(fā)展為腫瘤的過程中發(fā)揮了一定的作用。ROC曲線分析發(fā)現(xiàn),外周血單核細(xì)胞及尿沉渣NLRP3診斷膀胱癌的AUC分別為0.754和0.922,且尿沉渣NLRP3的診斷特異性顯著高于外周血單核細(xì)胞NLRP3,提示NLRP3可能是膀胱癌臨床診斷的新的腫瘤標(biāo)記物,與汪曉巍等[15]的研究結(jié)果較為一致。但聯(lián)合檢測外周血單核細(xì)胞和尿沉渣中NLRP3的表達(dá),能夠進(jìn)一步提高膀胱癌臨床診斷的靈敏度。同時(shí)本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn),外周血單核細(xì)胞及尿沉渣NLRP3的表達(dá)水平與膀胱癌的分級及TNM分期具有明顯的相關(guān)性,提示NLRP3的表達(dá)水平與膀胱癌的進(jìn)展有關(guān),與現(xiàn)有研究結(jié)果較為一致[13]。進(jìn)一步的Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn),外周血單核細(xì)胞NLRP3低表達(dá)組和高表達(dá)組的無進(jìn)展生存率分別為87.5%和70.4%,無明顯差異(P>0.05),而尿沉渣NLRP3 mRNA低表達(dá)組的無進(jìn)展生存率為90.5%,顯著高于高表達(dá)組的66.0%(P<0.05),提示尿沉渣NLRP3對膀胱癌的預(yù)后具有一定的預(yù)測價(jià)值。

綜上所述,NLRP3在膀胱癌患者的外周血細(xì)胞及尿沉渣中高表達(dá),與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后均具有一定的相關(guān)性,提示NLRP3可能是一個(gè)潛在的膀胱癌臨床診斷的候選腫瘤標(biāo)記物,并且對膀胱癌的預(yù)后均具有一定的預(yù)測作用。但仍需要大樣本、多中心的研究及進(jìn)一步明確NLRP3的診斷價(jià)值,為膀胱癌的診斷及復(fù)發(fā)監(jiān)測提供新的方法。