徐金梅, 張利兵, 郁多男

(1. 揚(yáng)州大學(xué)附屬醫(yī)院 兒科, 江蘇 揚(yáng)州, 225009;2. 揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院 江蘇省非編碼RNA基礎(chǔ)與臨床轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇 揚(yáng)州, 225009)

小細(xì)胞性貧血主要是指缺鐵性貧血,多發(fā)于6～12月齡的嬰兒。輕度小細(xì)胞性貧血患兒表現(xiàn)為皮膚、黏膜蒼白或蒼黃,嚴(yán)重者可見(jiàn)頭暈、全身乏力、煩躁不安、食欲不振等,且患兒往往伴有營(yíng)養(yǎng)不良,貧血過(guò)久可導(dǎo)致生長(zhǎng)發(fā)育障礙[1]。慢性感染貧血是慢性病貧血的一種,患者感染、炎癥狀態(tài)持續(xù)1個(gè)月以上,常伴有輕至中度貧血[2]。兒童貧血的原因具有多樣性和復(fù)雜性,實(shí)施有效的科學(xué)干預(yù)是臨床治療該病的重要舉措[3-5]。微小RNA(miRNAs)是一類長(zhǎng)度為18～25個(gè)核苷酸的小分子非編碼RNA[6], 可通過(guò)其種子序列與下游靶基因mRNA 3′非翻譯區(qū)特定位點(diǎn)結(jié)合,從而抑制下游靶基因的mRNA翻譯成蛋白質(zhì)[7]。研究[8]表明,微小RNA-451(miR-451)會(huì)有效破壞小鼠紅細(xì)胞系的穩(wěn)態(tài)性,而紅細(xì)胞數(shù)量是貧血的診斷指標(biāo)之一。研究[9-10]顯示,敲除miR-451后,小鼠會(huì)發(fā)生小細(xì)胞低色素性貧血,且miR-451對(duì)小鼠缺鐵性貧血和β-地中海貧血也存在一定影響。由此可見(jiàn), miR-451或可成為臨床診斷和治療紅細(xì)胞疾病的一種生物學(xué)指標(biāo)。本研究探討miR-451在小細(xì)胞性貧血和慢性感染貧血兒童血清中的表達(dá)及診斷價(jià)值,以期為臨床針對(duì)性治療兒童貧血提供一定的理論依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2021年12月—2022年12月?lián)P州大學(xué)附屬醫(yī)院收治的確診小細(xì)胞性貧血、慢性感染貧血的兒童各80例,分別納入小細(xì)胞性貧血組、慢性感染貧血組,不同類型貧血的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》[11]。納入標(biāo)準(zhǔn): ① 根據(jù)血常規(guī)等實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果和臨床表現(xiàn)確診貧血者; ② 臨床資料完整者; ③ 依從性好者; ④ 對(duì)本研究知情且簽署知情同意書者。排除標(biāo)準(zhǔn): ① 合并惡性腫瘤者; ② 存在肝、腎等重要臟器功能不全者; ③ 合并多種血液系統(tǒng)疾病和免疫源性疾病者; ④ 合并原發(fā)性高血壓、凝血功能障礙者; ⑤合并經(jīng)血液傳播疾病者; ⑥ 存在精神異常、意識(shí)功能障礙者。另選取同期健康兒童80例,納入健康對(duì)照組。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn),所有兒童及家屬對(duì)本研究知情且簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 血常規(guī)檢測(cè): 采集各組兒童空腹靜脈血3.5 mL, 抽血過(guò)程中確保穿刺部位皮膚無(wú)感染及皮疹,常規(guī)消毒后,于肘正中行靜脈穿刺處理, 60 s內(nèi)完成靜脈血采集,置于EDTA抗凝血管內(nèi)充分顛倒混勻。使用日本SySMEX XN-100全自動(dòng)血液分析儀及其相應(yīng)配套試劑檢測(cè)血常規(guī)指標(biāo),包括紅細(xì)胞分布寬度(RDW)、紅細(xì)胞(RBC)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度(MCHC)、血紅蛋白(Hb)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量(MCH)、平均紅細(xì)胞體積(MCV)等。確認(rèn)各參數(shù)的正常參考值范圍, RBC為(3.50～5.80)×1012/L, Hb為110～172 g/L, MCH為27～34 pg, MCV為82～100 fL, MCHC為321～362 g/L, RDW為11.6%～16.0%。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)血清miR-451表達(dá): 首先通過(guò)Trizol法提取總RNA, 檢測(cè)RNA濃度和OD260 nm/OD280 nm, 然后進(jìn)行cDNA的反轉(zhuǎn)錄合成,其反應(yīng)體系為總RNA 1 μg+mRQ Buffer(2×)5 μL+mRQ Enzyme 1.25 μL+無(wú)酶水補(bǔ)至10 μL, 再用PCR擴(kuò)增儀擴(kuò)增獲得cDNA產(chǎn)物。qRT-PCR通過(guò)Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒進(jìn)行操作,反應(yīng)體系為SYBR預(yù)混料Ex Taq Ⅱ 10.0 μL+ROX Reference Dye Ⅱ(50×)0.4 μL+上游引物(10 μmol/L)0.4 μL+下游引物(10 μmol/L)0.4 μL+ CDNA模板1.6 μL+DEPC水7.2 μL, 合計(jì)20 μL。反應(yīng)條件為94 ℃ 5 min, 1個(gè)循環(huán); 94 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s, 70 ℃ 30 s, 40個(gè)循環(huán); 94 ℃ 1 min, 55 ℃ 30 s, 95 ℃ 30 s, 1個(gè)循環(huán)。miR-451上游引物5′-AAACCGTTACCATTACTGAGTT -3′, 下游引物qRT-PCR試劑盒通用引物[12];GAPDH上游引物5′-ACCTGGACCTGGACCTGGACT-3′, 下游引物5′-ACCTGGACCTGGACCTGGGAT-3′。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 3組兒童一般資料比較

3組兒童年齡、性別比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05); 小細(xì)胞性貧血組、慢性感染貧血組兒童體質(zhì)量指數(shù)(BMI)均低于健康對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 小細(xì)胞性貧血組兒童的BMI、病程、臨床表現(xiàn)與慢性感染貧血組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), 見(jiàn)表1。

表1 3組兒童一般資料比較

2.2 3組兒童紅細(xì)胞相關(guān)參數(shù)比較

小細(xì)胞性貧血組、慢性感染貧血組兒童RDW均高于健康對(duì)照組, RBC、MCHC、Hb、MCH、MCV均低于健康對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 小細(xì)胞性貧血組兒童Hb、RBC均低于慢性感染貧血組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見(jiàn)表2。

表2 3組兒童紅細(xì)胞相關(guān)參數(shù)比較

2.3 3組兒童血清miR-451表達(dá)水平比較

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,與健康對(duì)照組相比,小細(xì)胞性貧血組、慢性感染貧血組兒童血清miR-451表達(dá)水平降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 小細(xì)胞性貧血組血清miR-451表達(dá)水平與慢性感染貧血組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), 見(jiàn)圖1。

2組比較, *P<0.05; NS表示2組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 血清miR-451與紅細(xì)胞相關(guān)參數(shù)的相關(guān)性

Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示, miR-451與RDW呈負(fù)相關(guān)(r=-0.388,P<0.05), miR-451與Hb、RBC、MCHC、MCH、MCV分別呈正相關(guān)(r=0.402、0.393、0.391、0.360、0.323,P<0.05), 見(jiàn)表3。

表3 血清miR-451表達(dá)與紅細(xì)胞相關(guān)參數(shù)的相關(guān)性分析

2.5 miR-451、紅細(xì)胞相關(guān)參數(shù)對(duì)小細(xì)胞性貧血的診斷價(jià)值

ROC曲線分析結(jié)果顯示, RDW、Hb、RBC、MCHC、MCH、MCV、miR-451診斷小細(xì)胞性貧血的曲線下面積(AUC)分別為0.602、0.633、0.645、0.621、0.633、0.610、0.718, 靈敏度、特異度均較高,其中miR-451的診斷價(jià)值高于6項(xiàng)紅細(xì)胞相關(guān)參數(shù),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見(jiàn)表4、圖2。

圖2 miR-451、紅細(xì)胞相關(guān)參數(shù)診斷小細(xì)胞性貧血的ROC曲線

表4 miR-451、紅細(xì)胞相關(guān)參數(shù)對(duì)小細(xì)胞性貧血的診斷效能

2.6 miR-451、紅細(xì)胞相關(guān)參數(shù)對(duì)慢性感染貧血的診斷價(jià)值

ROC曲線分析結(jié)果顯示, RDW、Hb、RBC、MCHC、MCH、MCV、miR-451診斷慢性感染貧血的AUC分別為0.600、0.612、0.633、0.602、0.614、0.618、0.735, 靈敏度、特異度均較高,其中miR-451的診斷價(jià)值高于6項(xiàng)紅細(xì)胞相關(guān)參數(shù),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見(jiàn)圖3、表5。

圖3 miR-451、紅細(xì)胞相關(guān)參數(shù)診斷慢性感染貧血的ROC曲線

表5 miR-451、紅細(xì)胞相關(guān)參數(shù)對(duì)慢性感染貧血的診斷效能

2.7 小細(xì)胞性貧血影響因素的多因素Logistic回歸分析

多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示,年齡、性別不是兒童發(fā)生小細(xì)胞性貧血的影響因素(P>0.05), BMI、RDW、Hb、RBC、MCHC、MCH、MCV、miR-451均為兒童發(fā)生小細(xì)胞性貧血的影響因素(P<0.05), 見(jiàn)表6。

表6 小細(xì)胞性貧血影響因素的多因素Logisitic回歸分析

2.8 慢性感染貧血影響因素的多因素Logistic回歸分析

多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示,年齡、性別不是兒童發(fā)生慢性感染貧血的影響因素(P>0.05), BMI、RDW、Hb、RBC、MCHC、MCH、MCV、miR-451均為兒童發(fā)生慢性感染貧血的影響因素(P<0.05), 見(jiàn)表7。

表7 慢性感染貧血影響因素的多因素Logisitic回歸分析

2.9 血清miR-451表達(dá)對(duì)貧血嚴(yán)重程度的診斷價(jià)值

根據(jù)Hb水平的不同將160例貧血兒童劃分為輕度組(Hb>90～120 g/L,n=45, 占28.12%)、中度組(Hb>60～90 g/L,n=68, 占42.50%)和重度組(Hb為30～60 g/L,n=47, 占29.38%)。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,中度組、重度組血清miR-451表達(dá)水平均低于輕度組,且重度組低于中度組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 表明隨著兒童貧血程度的加重,血清miR-451表達(dá)水平逐漸降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見(jiàn)圖4。ROC曲線分析結(jié)果顯示,隨著貧血程度的加重, miR-451的AUC、特異度逐漸增加(P<0.05), 表明血清miR-451水平對(duì)兒童貧血嚴(yán)重程度具有較高的診斷價(jià)值,見(jiàn)表8。

與輕度組比較, *P<0.05; 與中度組比較, #P<0.05。

表8 miR-451對(duì)貧血嚴(yán)重程度的診斷效能

3 討 論

小細(xì)胞性貧血是指機(jī)體紅細(xì)胞因缺乏某些必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(如鐵等)而不能正常合成引起的貧血現(xiàn)象[13-14], 臨床發(fā)病率較高,但經(jīng)合理治療后,患者一般預(yù)后良好[15-16]。慢性感染貧血是慢性病貧血的一種類型,其發(fā)病原因之一是微生物入侵直接造成骨髓造血組織被破壞,另一原因是細(xì)菌產(chǎn)生的內(nèi)外毒素引起間接性作用[17-18], 最終導(dǎo)致感染患者血細(xì)胞減少及骨髓再生功能障礙,臨床表現(xiàn)為網(wǎng)織紅細(xì)胞增多,紅細(xì)胞壽命縮短,機(jī)體存在不同程度溶血現(xiàn)象[19]。盡管臨床醫(yī)師可以鑒別小細(xì)胞性貧血和慢性感染貧血,但目前關(guān)于小細(xì)胞性貧血、慢性感染貧血臨床特征的比較研究仍較少。本研究結(jié)果顯示, 3組兒童年齡、性別無(wú)顯著差異,但2組貧血兒童的BMI顯著低于健康對(duì)照組兒童,此外小細(xì)胞性貧血組、慢性感染貧血組的BMI、病程、臨床表現(xiàn)(乏力、食欲不振、頭暈)無(wú)顯著差異,與既往研究[20-21]結(jié)果相近。目前貧血類型的臨床診斷大多通過(guò)溶血篩查,血常規(guī)指標(biāo)中具有代表意義的紅細(xì)胞相關(guān)參數(shù)包括RBC、RDW、Hb和MCV, 檢驗(yàn)過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)單,可為貧血診斷提供可靠依據(jù)[22-24]。本研究結(jié)果顯示,與健康對(duì)照組相比, 2組貧血患兒的RDW顯著升高, RBC、MCHC、Hb、MCH、MCV則顯著降低,且小細(xì)胞性貧血組患兒Hb、RBC顯著低于慢性感染貧血組,表明貧血患兒紅細(xì)胞相關(guān)參數(shù)存在明顯異常,與既往研究[23-24]結(jié)論一致。

miR-451基因位于第11號(hào)染色體上,與miR-144基因來(lái)自同一基因簇[25-26]。研究[27-28]表明, miR-451在斑馬魚、小鼠及人類紅細(xì)胞中的表達(dá)存在顯著差異。血液miR-451、miR-144表達(dá)與貧血類型密切相關(guān),例如地中海貧血患者血液miR-451、miR-144表達(dá)顯著低于健康對(duì)照者,提示miR-451、miR-144表達(dá)與此類患者紅細(xì)胞生成存在關(guān)聯(lián)[10-11]。相關(guān)研究[29]在斑馬魚的紅細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)一些造血相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子,其可以激活miR-451、miR-144的表達(dá),從而調(diào)控紅細(xì)胞的分化和生成。小鼠模型中,慢性病毒載體可抑制miR-451的表達(dá),使紅細(xì)胞氧化應(yīng)激能力增強(qiáng),導(dǎo)致貧血程度加重,提示miR-451在原始紅細(xì)胞的分化過(guò)程中起著關(guān)鍵作用[13, 30-32]。

本研究發(fā)現(xiàn),與健康對(duì)照組相比,小細(xì)胞性貧血組和慢性感染貧血組患兒外周血中miR-451表達(dá)顯著降低,提示miR-451與貧血的病理進(jìn)程存在關(guān)聯(lián)。Pearson相關(guān)分析顯示,貧血兒童miR-451與RDW呈負(fù)相關(guān),與Hb、RBC、MCHC、MCH、MCV分別呈正相關(guān),即隨著血清miR-451表達(dá)水平的升高, RDW水平逐漸降低, Hb、RBC、MCHC、MCH、MCV水平逐漸升高。由此提示, miR-451表達(dá)水平可在一定程度上預(yù)測(cè)機(jī)體紅細(xì)胞相關(guān)參數(shù),進(jìn)而預(yù)測(cè)貧血的發(fā)生。本研究中, ROC曲線分析結(jié)果顯示, miR-451診斷小細(xì)胞性貧血、慢性感染貧血的AUC均顯著大于RDW、Hb、RBC、MCHC、MCH、MCV, 多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示, BMI、RDW、Hb、RBC、MCHC、MCH、MCV、miR-451均為兒童發(fā)生小細(xì)胞性貧血、慢性感染貧血的影響因素,即較低的BMI、Hb、RBC、MCHC、MCH、MCV、miR-451水平和較高的RDW水平均會(huì)增加兒童發(fā)生小細(xì)胞性貧血、慢性感染貧血的概率。本研究結(jié)果還顯示,隨著兒童貧血程度的加重,血清miR-451表達(dá)水平顯著降低,進(jìn)一步行ROC曲線分析發(fā)現(xiàn),血清miR-451水平對(duì)兒童貧血嚴(yán)重程度具有較高的診斷價(jià)值。

綜上所述, miR-451在小細(xì)胞性貧血、慢性感染貧血兒童血清中表達(dá)降低,且其表達(dá)水平與紅細(xì)胞相關(guān)參數(shù)具有相關(guān)性,血清miR-451對(duì)小細(xì)胞性貧血、慢性感染貧血和貧血嚴(yán)重程度均具有較高的診斷價(jià)值,建議在臨床推廣應(yīng)用。