王海潼, 劉建亮

(1. 濰坊醫(yī)學院 臨床醫(yī)學院, 山東 濰坊, 262500; 2. 濰坊醫(yī)學院附屬醫(yī)院, 山東 濰坊, 261041)

糖尿病是一種慢性疾病,其特征是由胰島素不敏感或胰島素缺乏引起的高血糖和神經(jīng)血管損害[1]。糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是糖尿病常見的微血管并發(fā)癥,可引發(fā)不可逆的視網(wǎng)膜損傷。隨著糖尿病患病率的增加,預(yù)計到2045年, DR患者的人數(shù)將增加到6.28億,將造成巨大的公共衛(wèi)生負擔[2]。自噬是一種廣泛存在于真核細胞中,通過溶酶體途徑清除聚合的大分子、錯誤折疊的蛋白質(zhì)和受損的細胞器,實現(xiàn)物質(zhì)循環(huán)和合成新蛋白質(zhì)的功能,可維持細胞生存和穩(wěn)態(tài)以應(yīng)對各種環(huán)境[3]。研究[4]表明, DR病理改變?nèi)缪仔苑磻?yīng)、神經(jīng)變性等與異常自噬相關(guān)。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是調(diào)控自噬的重要通路之一, AMPK、mTOR是自噬過程中重要的分子靶點,參與調(diào)節(jié)原代視網(wǎng)膜細胞的自噬,緩解DR發(fā)展[5]。柚皮素(NAR)是一種天然黃酮類化合物,大量存在于柑橘類水果中,其特征為生物利用度高、低細胞毒性以及顯著的抗炎和抗氧化作用,因此具有廣闊的臨床應(yīng)用前景[6]。XUE B等[7]研究發(fā)現(xiàn)NAR可改善高糖(HG)誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞凋亡和氧化應(yīng)激,改善細胞受損,具有抗多種類型內(nèi)皮細胞損傷的治療潛力,但其能否通過調(diào)節(jié)AMPK/mTOR通路介導(dǎo)的自噬發(fā)揮對HG誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞(HRMECs)治療的報道較少。本研究探討NAR對HG誘導(dǎo)的HRMECs損傷的影響及作用機制,現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞來源

人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞(HRMECs)(武漢普諾賽生命科技有限公司)在含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 g/mL鏈霉素中培養(yǎng),并將培養(yǎng)基置于37 ℃、5% CO2和95%的室內(nèi)空氣中孵育。

1.2 主要材料及儀器

Sigma公司提供NAR、結(jié)晶紫溶液; 索萊寶有限公司提供CCK-8試劑; MedChemExpress公司提供AMPK激活劑AICAR; Corning提供Transwell小室; 酶聯(lián)免疫有限公司提供白細胞介素(IL)-1β、IL-6和腫瘤壞死因子-α(TNF-α); 上海生工生物技術(shù)有限公司提供引物序列; Abcam公司提供p-AMPK、p-mTOR、AMPK、mTOR、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ及p62一抗。Thermo Fisher Scientific公司提供Multiskan MK3酶標儀; 尼康提供C2激光共聚焦熒光顯微鏡。

1.3 細胞分組及處理

將HRMECs隨機分成5個處理組,即對照組(培養(yǎng)基中加入5 mmol/L D-葡萄糖)、HG組(向培養(yǎng)基中加入30 mmol/L的D-葡萄糖[8])、HG+NAR組(向培養(yǎng)基中加入30 mmol/L D-葡萄糖和3 mg/L NAR[9])、HG+AICAR組(向培養(yǎng)基中加入30 mmol/L D-葡萄糖和1 mmol/L AICAR[10])、HG+NAR+AICAR組(向培養(yǎng)基中加入30 mmol/L D-葡萄糖、3 mg/L NAR和1 mmol/L AICAR)。將所有組的平板孵育48 h并進行指標檢測。

1.4 CCK-8法檢測細胞增殖

將處理過的HRMECs以每孔5×103細胞的密度接種在96孔板中,并根據(jù)CCK-8試劑說明書進行檢測: 向每個孔中加入10 μL CCK-8試劑,然后將細胞在37 ℃下孵育4 h。利用酶標儀檢測450 nm處的吸光度,分析細胞活力。

1.5 Transwell實驗檢測細胞遷移

將采用不含基質(zhì)膠的Transwell上室進行Transwell遷移試驗: 將100 μL的濃度為1×104的細胞懸液的無血清培養(yǎng)基中加入Transwell的上室,將600 μL 10%含血清培養(yǎng)基加入下室。48 h后,棄去培養(yǎng)基,采用4.0%多聚甲醛在室溫下固定細胞10 min, 并采用0.1%結(jié)晶紫染色20 min。在AM6000顯微鏡下進行拍照,并對每個樣品的5個隨機視野進行遷移細胞計數(shù)。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測上清液中炎癥因子水平

收集細胞上清液,取100 μL上清液測定IL-1β、IL-6和TNF-α的濃度。取上清液,加入捕獲抗體,孵育1 h后洗滌,去除未結(jié)合的物質(zhì),加入生物素標記的檢測抗體,然后加入鏈霉親和素-HRP化學發(fā)光檢測試劑,溫育30 min后,用洗滌緩沖液洗滌平板3次,使用酶標儀檢測吸光度值,并基于標準品的線性回歸曲線測量每種細胞因子的濃度。

1.7 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測LC3 mRNA和p62 mRNA表達水平

使用Trizol試劑從培養(yǎng)的HRECs中提取總RNA。采用TransScript Green miRNA RT SuperMix進行逆轉(zhuǎn)錄,并在7900HT快速實時系統(tǒng)上采用SYBR-Green PCR Master Mix試劑盒對產(chǎn)物進行定量,以GAPDH為內(nèi)參進行歸一化處理,結(jié)果采用2-△△Ct值比較目的基因相對表達差異。引物序列見表1。

1.8 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)檢測AMPK/mTOR通路及自噬相關(guān)蛋白表達水平

使用含有1%蛋白酶和磷酸酶抑制劑的放射免疫沉淀分析緩沖液從HRMECs中提取總蛋白。在使用比辛可寧酸測定法對蛋白質(zhì)濃度進行定量后,將30 μg蛋白質(zhì)行12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離,隨后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。將膜在室溫下封閉2 h, 然后在4 ℃下用第一抗體孵育過夜,在室溫下用相應(yīng)的第二抗體孵育2 h。使用增強化學發(fā)光試劑觀察印跡并分析蛋白表達水平。

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結(jié) 果

2.1 NAR通過AMPK/mTOR通路對各組細胞增殖變化的影響

與對照組相比, HG組細胞活力增加; 與HG組相比, HG+NAR組細胞活力下降, HG+AICAR組細胞活力增加; 與HG+NAR組相比, HG+NAR+AICAR組細胞活力增加; 與HG+AICAR組相比, HG+NAR+AICAR組細胞活力下降; 上述組間差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組細胞增殖變化

2.2 NAR通過AMPK/mTOR通路對各組細胞遷移變化的影響

與對照組相比, HG組細胞遷移數(shù)增加; 與HG組相比, HG+NAR組細胞遷移數(shù)下降, HG+AICAR組細胞遷移數(shù)增加; 與HG+NAR組相比, HG+NAR+AICAR組細胞遷移數(shù)增加; 與HG+AICAR組相比, HG+NAR+AICAR組細胞遷移數(shù)下降; 上述組間差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3、圖1。

圖1 各組細胞遷移變化圖(放大100倍)

表3 各組細胞遷移數(shù)變化

2.3 NAR通過AMPK/mTOR通路對各組細胞炎癥因子水平的影響

與對照組相比, HG組IL-1β、IL-6和TNF-α水平增加; 與HG組相比, HG+NAR組IL-1β、IL-6和TNF-α水平下降, HG+AICAR組IL-1β、IL-6和TNF-α水平增加; 與HG+NAR組相比, HG+NAR+AICAR組IL-1β、IL-6和TNF-α水平增加; 與HG+AICAR組相比, HG+NAR+AICAR組IL-1β、IL-6和TNF-α水平下降; 上述組間差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 各組細胞IL-1β、IL-6和TNF-α水平變化 pg/mL

2.4 NAR通過AMPK/mTOR通路對各組細胞LC3 mRNA及p62 mRNA表達水平的影響

與對照組相比, HG組LC3mRNA表達增加,p62mRNA表達下降; 與HG組相比, HG+NAR組LC3mRNA表達下降,p62mRNA表達增加,但HG+AICAR組LC3mRNA表達增加,p62mRNA表達下降; 與HG+NAR組相比, HG+NAR+AICAR組LC3mRNA表達增加,p62mRNA表達下降; 與HG+AICAR組相比, HG+NAR+AICAR組LC3mRNA表達下降,p62mRNA表達增加; 上述組間差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表5。

表5 各組細胞LC3 mRNA及p62 mRNA表達水平變化

2.5 NAR對各組細胞通路及自噬相關(guān)蛋白的表達水平的影響

與對照組相比, HG組p-AMPK/AMPK、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達增加, p-mTOR/mTOR、p62表達下降;與HG組相比, HG+NAR組p-AMPK/AMPK、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達下降, p-mTOR/mTOR、p62表達增加,但HG+AICAR組p-AMPK/AMPK、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達增加, p-mTOR/mTOR、p62表達下降; 與HG+NAR組相比, HG+NAR+AICAR組p-AMPK/AMPK、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達增加, p-mTOR/mTOR、p62表達下降; 與HG+AICAR組相比, HG+NAR+AICAR組p-AMPK/AMPK、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達下降, p-mTOR/mTOR、p62表達增加; 上述組間差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2、表6。

A: 對照組; B: HG組; C: HG+NAR組;D: HG+AICAR組; E: HG+NAR+AICAR組。

表6 各組p-AMPK/AMPK、p-mTOR/mTOR、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及p62蛋白表達比較

3 討 論

近年來,糖尿病發(fā)病率逐年快速上升,已成為繼心腦血管疾病和腫瘤之后的危害人類健康的第三大慢性非傳染性疾病[11]。DR是糖尿病引起的嚴重并發(fā)癥之一,也是糖尿病患者致盲的主要原因[12]。目前的臨床實踐中,對DR的治療主要集中在預(yù)防上,包括系統(tǒng)管理和控制患者的高脂血癥、高血糖以及高血壓,并通過減少血管滲漏保護視力,然而其治療效果并不令人滿意,并且受副作用的限制[13]。

NAR是一種天然存在于柑橘類水果中的生物類黃酮,具有廣泛的藥理作用,并對代謝綜合征、骨再生、神經(jīng)疾病、心血管疾病等發(fā)揮重要作用[14]。早期研究[15]表明, NAR可通過抑制視網(wǎng)膜細胞的凋亡預(yù)防大鼠視網(wǎng)膜缺血/再灌注損傷,提示NAR具有保護眼缺血性疾病的治療潛力。在鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變中[16], NAR通過抗糖尿病、抗細胞凋亡及抗氧化,防止DR中的視網(wǎng)膜損傷,從而限制神經(jīng)變性。在糖尿病大血管和微血管病變的研究中,大量炎癥因子參與了DR的發(fā)展[17]。本研究以30 mmol/L葡萄糖誘導(dǎo)HRMECs損傷,結(jié)果發(fā)現(xiàn)細胞活力、遷移數(shù)、IL-1β、IL-6和TNF-α水平顯著增加,與既往研究結(jié)果[18]一致; 經(jīng)NAR處理后,細胞活力、遷移數(shù)、IL-1β、IL-6和TNF-α水平被顯著抑制,提示NAR可緩解HG誘導(dǎo)HRMECs損傷,但其作用機制尚不明確。

自噬是指吞噬自身的細胞質(zhì)蛋白或細胞器并將其封裝成囊泡,與溶酶體融合形成自噬溶酶體,進而降解自噬內(nèi)含物的過程,在進化中其高度保守,并對細胞物質(zhì)的降解和循環(huán)至關(guān)重要[19-21]。自噬障礙可能對細胞具有致命的后果,并導(dǎo)致一些眼部疾病,如青光眼、年齡相關(guān)性黃斑變性等眼病,且研究[22]表明自噬參與了DR的發(fā)展。AMPK/mTOR/ULK是一條經(jīng)典自噬通路, p62、LC3是自噬過程中重要的標志物[23-24]。本研究發(fā)現(xiàn), HG組p-AMPK/AMPK、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、LC3mRNA表達顯著增加, p-mTOR/mTOR、p62蛋白及mRNA表達顯著下降,表明AMPK/mTOR通路被激活,自噬水平增加,細胞發(fā)生炎癥損傷。經(jīng)NAR處理后, p-AMPK/AMPK、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、LC3mRNA表達顯著下降, p-mTOR/mTOR、p62蛋白及mRNA表達顯著增加,炎癥水平降低,推測NAR可通過抑制AMPK/mTOR通路來降低炎癥反應(yīng),抑制細胞自噬,減輕細胞受損。本研究以通路激活劑AICAR進行驗證,結(jié)果表明NAR可減輕HG誘導(dǎo)的HRMECs損傷,其機制可能與抑制AMPK/mTOR通路介導(dǎo)的自噬有關(guān)。

綜上所述, NAR通過抑制AMPK/mTOR通路介導(dǎo)的自噬而減輕HG誘導(dǎo)的HRMECs損傷,為NAR用于臨床治療DR提供依據(jù)。