劉昱彤,馮子奕,薛淑媛,3△

1.新疆醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,新疆烏魯木齊 830011;2.烏魯木齊市婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心,新疆烏魯木齊 830000;3.西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,陜西西安 710069

高苯丙氨酸血癥(HPA)屬于新生兒出生缺陷的一種,其病因是編碼苯丙氨酸羥化酶(PAH)或其輔酶四氫生物蝶呤(BH4)缺陷,導(dǎo)致血苯丙氨酸(Phe)在患兒肝臟中無(wú)法正常代謝。血液中堆積過(guò)量的Phe和旁路代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的神經(jīng)毒性作用會(huì)導(dǎo)致患兒逐漸發(fā)生不可逆的發(fā)育遲緩、智力障礙、癲癇和異常行為[1]。根據(jù)血Phe水平,將PAH缺乏癥分為經(jīng)典型苯丙酮尿癥(PKU)、輕度PKU及輕度HPA[2]。PAH缺乏癥目前已成為我國(guó)新生兒遺傳代謝病中患病率最高的疾病[3]。對(duì)于此類疾病,臨床上已可防可治可控,治療方案因表型的不同而有所不同,經(jīng)典型PKU與輕度PKU患兒需要使用特殊食品進(jìn)行治療,而輕度HPA只需定期隨訪監(jiān)測(cè)血Phe水平[1],因此明確HPA的分類不僅對(duì)精準(zhǔn)治療至關(guān)重要,而且可以預(yù)測(cè)出生后的飲食方案并緩解患兒家長(zhǎng)的心理壓力。本研究通過(guò)分析新疆地區(qū)230例PAH缺乏癥患兒的PAH基因變異情況,構(gòu)建新疆地區(qū)PAH基因變異譜。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2015年1月1日至2023年2月28日于新疆烏魯木齊市婦幼保健院確診的230例PAH缺乏癥患兒納入研究,患兒均為出生滿72 h的新生兒,男121例、女109例,排除BH4缺乏癥、早產(chǎn)患兒、靜脈輸入營(yíng)養(yǎng)液所致的暫時(shí)性HPA及肝功能異常和其他遺傳代謝性疾病等導(dǎo)致的繼發(fā)性HPA?；純罕O(jiān)護(hù)人對(duì)本研究知情同意并簽署知情同意書。本研究經(jīng)烏魯木齊市婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(XJFYLL2019035)。

1.2方法

1.2.1篩查方法 對(duì)出生滿72 h并充分哺乳6～8次的新生兒,用75%乙醇消毒后使用一次性采血針刺于足跟內(nèi)或外側(cè),深度<3 mm,棄去第1滴血,采集4個(gè)直徑>8 mm的血斑,自然晾干,置4～8 ℃保存。采用熒光法及串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行血Phe水平及Phe與酪氨酸(Tyr)比值(Phe/Tyr)測(cè)定,初篩及復(fù)查血Phe水平>120 μmol/L(2.0 mg/dL)為陽(yáng)性。將篩查陽(yáng)性者召回并采血,若血Phe水平仍>120 μmol/L則進(jìn)行尿蝶呤譜分析以區(qū)分PAH缺乏癥和BH4缺乏癥。

1.2.2診斷標(biāo)準(zhǔn) 參考《高苯丙氨酸血癥的診治共識(shí)》[2],根據(jù)血Phe水平對(duì)BH4的治療反應(yīng)分為BH4反應(yīng)性和BH4無(wú)反應(yīng)性PAH缺乏癥。經(jīng)BH4負(fù)荷后,任意時(shí)間點(diǎn)血Phe水平較負(fù)荷前基礎(chǔ)值下降≥30%者為BH4反應(yīng)性PAH缺乏癥,<30%者為BH4無(wú)反應(yīng)性PAH缺乏癥。通常根據(jù)治療前的血Phe最高水平或攝入足夠天然蛋白質(zhì)情況下的血Phe水平,將PAH缺乏癥分為經(jīng)典型PKU:血Phe水平≥1 200 μmol/L;輕度PKU:血Phe水平為360～1 200 μmol/L;輕度HPA:血Phe水平為120～<360 μmol/L。

1.2.3PAH基因分析 用EDTA抗凝管抽取患兒及父母的外周靜脈血2～3 mL,磁珠法提取 DNA,提取物質(zhì)控達(dá)標(biāo)后,進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建,應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)PAH的相關(guān)基因進(jìn)行直接測(cè)序。在BIOPKU數(shù)據(jù)庫(kù)和HGMD數(shù)據(jù)庫(kù)將變異位點(diǎn)輸入進(jìn)行查閱。檢測(cè)到的全部變異位點(diǎn)按照ACMG指南進(jìn)行致病性分析。使用生物信息學(xué)軟件MutationTaster、SIFT、PolyPhen_2對(duì)變異基因蛋白功能的致病性進(jìn)行預(yù)測(cè)。對(duì)發(fā)現(xiàn)的致病突變進(jìn)行PCR擴(kuò)增及Sanger測(cè)序,驗(yàn)證高通量測(cè)序的結(jié)果,并對(duì)患兒父母采用Sanger法進(jìn)行目標(biāo)基因突變驗(yàn)證。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1不同表型PAH缺乏癥患兒的一般資料 納入研究的230例PAH缺乏癥患兒中,經(jīng)典型PKU 42例(18.26%),其中男25例、女17例,治療前血Phe平均水平為2 048.19 μmol/L;輕度PKU 22例(9.65%),其中男15例、女7例,治療前血Phe平均水平為660.49 μmol/L;輕度HPA 166例(72.17%),其中男81例、女85例,治療前血Phe平均水平為180.12 μmol/L。見(jiàn)表1。

表1 不同表型PAH缺乏癥患兒的一般資料

2.2PAH基因變異情況 230例PAH缺乏癥患兒的460個(gè)等位基因位點(diǎn)中,共檢出441個(gè)PAH基因變異位點(diǎn),總檢出率為95.87%,其中,227例患兒檢測(cè)到2個(gè)變異位點(diǎn),2例患兒僅檢測(cè)到1個(gè)變異位點(diǎn),1例患兒檢測(cè)到3個(gè)變異位點(diǎn);復(fù)合雜合變異217例,純合變異10例。涉及91種PAH基因變異,包含錯(cuò)義突變[84.81%(374/441)]、無(wú)義突變[7.26%(32/441)]、剪接突變[4.99%(22/441)]和移碼突變[2.95%(13/441)]。變異位點(diǎn)分布在外顯子2至外顯子12,內(nèi)含子2、內(nèi)含子4、內(nèi)含子7、內(nèi)含子8,內(nèi)含子10至內(nèi)含子13;高頻分布在外顯子2[24.04%(106/441)]和外顯子7[23.13%(102/441)],高頻分布合計(jì)占比47.17%,見(jiàn)圖1。

PAH基因變異頻率由高到低依次為c.158G>A[23.39%(102/441)]、c.728G>A[11.70%(51/441)]、c.688G>A[5.05%(22/441)]、c.721C>T[3.90%(17/441)]、c.611A>G[3.67%(16/441)]、c.1238G>C[3.21%(14/441)],以上PAH變異總占比為50.92%。見(jiàn)表2。

表2 新疆地區(qū)PKU患者PAH基因變異情況

2.3三種不同表型患兒的PAH基因變異位點(diǎn)分析 PAH缺乏癥的基因型在人群中的分布有所不同,代謝表型也有很大差別。本研究將新疆地區(qū)PAH基因變異頻率較高的18種類型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析后得出,c.158G>A、c.728G>A、c.688G>A、c.721C>T、c.1068C>A、c.1301C>A、c.331C>T和c.782G>A共8種突變的頻率在PAH缺乏癥不同表型之間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

經(jīng)典型PKU患兒的主要變異位點(diǎn)為c.728G>A、c.331C>T和c.782G>A;輕度PKU患兒的主要變異位點(diǎn)為c.721C>T、c.1068C>A和c.1301C>A;輕度HPA患兒的主要變異位點(diǎn)為c.158G>A和c.688G>A。5種變異位點(diǎn)僅在輕度HPA中被檢出,分別為c.158G>A、c.688G>A、c.1174T>A、c.320A>G和c.1139C>T。見(jiàn)表3。

表3 新疆地區(qū)常見(jiàn)PAH基因變異位點(diǎn)在不同表型中的分布[n(%)]

2.4特殊案例分析 本研究中發(fā)現(xiàn)1例特殊案例,先證者為1名回族男性,出生體重3 310 g,初篩血Phe水平為559.2 μmol/L,復(fù)篩血Phe水平為1 858.0 μmol/L,臨床診斷為經(jīng)典型PKU。檢出c.1222C>T和c.838G>A的雜合突變,Sanger家系驗(yàn)證報(bào)告顯示,先證者c.1222C>T位點(diǎn)變異遺傳自母親,但先證者的父、母c.838G>A位點(diǎn)均為野生純合子,c.838G>A可能為先證者新發(fā)突變。見(jiàn)圖2～4。

圖2 患兒Sanger測(cè)序驗(yàn)證圖譜

圖3 患兒父親Sanger測(cè)序驗(yàn)證圖譜

圖4 患兒母親Sanger測(cè)序驗(yàn)證圖譜

3 討 論

HPA是由于PAH或BH4缺乏所引起的單基因隱性遺傳病[4],目前已明確相關(guān)致病基因有6種,分別為PAH、GCH1、PTS、SPR、PCBD、QDPR和DNAJC12[5-6]。不同民族或地域間PAH基因高頻變異位點(diǎn)的差異性使PAH缺乏癥成為一種具有極強(qiáng)遺傳異質(zhì)性的譜系疾病。本研究通過(guò)分析新疆地區(qū)PAH缺乏癥基因變異類型,初步評(píng)估基因型與表型的相關(guān)性,為表型預(yù)測(cè)提供一定依據(jù),有助于新生兒HPA的管理及預(yù)后評(píng)估。

本研究回顧性分析了230例PAH缺乏癥PAH基因的變異類型,點(diǎn)突變以錯(cuò)義突變(84.81%)為主,與既往研究基本一致[7],其次為無(wú)義突變(7.26%)、剪接突變(4.99%)和移碼突變(2.95%)。突變位點(diǎn)集中分布在外顯子2和外顯子7上,分別占24.04%和23.13%,歐洲PAH基因高頻變異區(qū)域集中在外顯子12和內(nèi)含子11上,中國(guó)PAH基因高頻變異區(qū)域集中在外顯子3至外顯子7和外顯子10至外顯子12[7],說(shuō)明PAH基因變異位點(diǎn)的分布既存在種族、地域的差異性又具有相似性。

本研究的新疆地區(qū)230例PAH缺乏癥患兒中,最常見(jiàn)的PAH基因變異位點(diǎn)為c.158G>A(23.39%)、c.728G>A(11.70%)、c.688G>A(5.05%)、c.721C>T(3.90%)、c.611A>G(3.67%)、c.1238G>C(3.21%)。西北地區(qū)PAH基因變異高頻位點(diǎn)為c.728G>A(14.00%)、c.611A>G(5.58%)、c.1068C>A(4.95%)、c.1238G>C(4.74%)、c.442-1G>A(4.32%)、c.1197A>T(4.11%)和c.721C>T(4.11%)[8],與本研究常見(jiàn)變異位點(diǎn)相似,但排序不同,本研究PAH基因變異頻率最高的為c.158G>A(23.39%),與青島[9]和石家莊[10]的研究報(bào)道一致。新疆地區(qū)幅員遼闊、民族眾多,不同民族有其獨(dú)特的PAH基因變異譜,而且地區(qū)之間存在差異。SU等[11]的研究顯示,新疆南部地區(qū)少數(shù)民族患兒常見(jiàn)的PAH基因變異位點(diǎn)為c.311C>A(8.41%)和c.1238G>C(7.96%),但本研究中c.311C>A(0.46%)和c.1238G>C(3.21%)檢出率較低,可能與新疆南北部少數(shù)民族構(gòu)成比不同有關(guān)。與何江等[12]的71例新疆地區(qū)PAH基因檢測(cè)結(jié)果比較后發(fā)現(xiàn),c.728G>A、c.158G>A與c.611A>G是新疆地區(qū)普遍存在的PAH基因高頻變異位點(diǎn),但本研究中c.688G>A與c.1174T>A檢出率較高,原因可能為本研究中包含民族較全面,樣本量較大。在既往新疆地區(qū)研究中c.688G>A作為PAH基因高頻位點(diǎn)未被報(bào)道過(guò),有此變異位點(diǎn)者在本研究的少數(shù)民族患兒中占比較多,其中1例患兒父母為近親結(jié)婚。以上研究結(jié)果表明,新疆地區(qū)PAH基因變異譜存在地區(qū)分布和民族差異,提示c.688G>A和c.1174T>A可能是新疆地區(qū)特有變異位點(diǎn)。

研究顯示,全球表型分布情況為經(jīng)典型PKU占62%,輕度PKU占22%,輕度HPA占16%;中國(guó)的分布情況為經(jīng)典型PKU占62.1%,輕度PKU占27.6%,輕度HPA占10.3%[7]。我國(guó)各地PAH缺乏癥的表型分布不一,福建省經(jīng)典型PKU占15.05%,輕度PKU占21.51%,輕度HPA占63.44%[13];浙江省經(jīng)典型PKU占43.57%,輕度PKU占33.10%,輕度HPA占23.33%[14]。本研究結(jié)果中,新疆地區(qū)經(jīng)典型PKU占18.26%,輕度PKU占9.65%,輕度HPA占72.17%,新疆地區(qū)輕度HPA占比明顯高于其他地區(qū)。

PAH缺乏癥的基因型與表型存在密切聯(lián)系,在世界各地的分布具有異質(zhì)性[15-17]。不同表型PAH缺乏癥患兒的PAH基因變異的高頻位點(diǎn)不同,本研究首次分析了新疆地區(qū)基因型與表型的相關(guān)性,研究結(jié)果顯示,經(jīng)典型PKU主要高頻變異為c.728G>A、c.331C>T和c.782G>A。c.158G>A、c.688G>A;輕度PKU高頻變異為c.721C>T、c.1068C>A和c.1301C>A;輕度HPA高頻變異為c.158G>A和c.688G>A;3種表型的高頻變異有明顯差異。此外,c.1174T>A、c.320A>G和c.1139C>T均只在輕度HPA患兒中檢出,證明以上變異與輕度HPA存在一定關(guān)聯(lián)。甘肅[18]和重慶部分地區(qū)[19]的研究均顯示c.728G>A與輕度PKU及經(jīng)典型PKU相關(guān),而本研究中c.728G>A在經(jīng)典型PKU患兒中檢出頻率最高,在輕度PKU患兒中檢出c.728G>A的頻率低于輕度HPA患兒。

本研究中c.158G>A變異頻率為23.39%,是新疆地區(qū)最常見(jiàn)的變異位點(diǎn),而且僅在輕度HPA患兒中被檢出,可作為新疆地區(qū)輕度HPA患兒的標(biāo)志性變異位點(diǎn)。有研究表明,HPA的致病性與患兒體內(nèi)酶活性高低有關(guān)[20],c.158G>A變異導(dǎo)致患兒體內(nèi)酶活性降低,殘余酶活性降低為正常酶活性的79%,患兒仍有一定Phe代謝能力[21],因此臨床上癥狀較輕,多為輕度HPA,但當(dāng)c.158G>A與不同PAH基因變異位點(diǎn)組合為復(fù)合雜合狀態(tài)時(shí),可引起臨床表型發(fā)生改變。新疆地區(qū)的經(jīng)典型PKU、輕度PKU及輕度HPA患兒具有獨(dú)特基因型,分析基因型與表型之間的關(guān)聯(lián)性,對(duì)不同的PAH基因變異對(duì)酶活性的影響進(jìn)行更為深入的功能研究與隨訪,可以提供更全面的遺傳學(xué)信息。

綜上所述,本研究通過(guò)分析新疆地區(qū)230例PAH缺乏癥患兒的PAH基因,構(gòu)建新疆地區(qū)的PAH基因變異譜發(fā)現(xiàn)新疆地區(qū)以輕度HPA患兒為主,多為復(fù)合雜合突變,高頻變異位點(diǎn)為c.158G>A、c.728G>A、c.688G>A、c.721C>T、c.611A>G和c.1238G>C。明確了3種不同表型的高頻變異位點(diǎn),在經(jīng)典型PKU、輕度PKU和輕度HPA患兒中均觀察到具有特異性的PAH基因型,基因型與表型數(shù)據(jù)的結(jié)合將有助于臨床醫(yī)生快速明確疾病類型,更好地改善患兒預(yù)后,為精準(zhǔn)產(chǎn)前診斷提供理論依據(jù)。