韋德琴,朱 琳

貴州省遵義市疾病預防控制中心檢驗科,貴州遵義 563000

沙門菌廣泛存在于自然界,是全球食源性腹瀉病最常見的病原菌之一,可引起胃腸炎、類傷寒、敗血癥、局部化膿性感染等疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織報告,沙門菌造成的食物污染給世界各國帶來了巨大經(jīng)濟損失,并且嚴重威脅著人們的身體健康和生命安全。由于沙門菌種類多達2 600多種型別[1],傳統(tǒng)分型鑒定技術(shù)需要實驗室保存250多種不同的高質(zhì)量分型血清和350種不同的抗原[2],并且要求實驗人員經(jīng)驗豐富,技術(shù)水平高,除此之外該試驗周期長、精確度差,加大了社會各檢疫部門對食品中沙門菌的防治及監(jiān)控的難度。脈沖場凝膠電泳(PFGE)是基于分子的快速分型方法,可提供更快、差異性更明顯和更準確的沙門菌分型,克服了傳統(tǒng)血清分型的局限性,目前被認為是細菌分型的“金標準”,已被公共衛(wèi)生部門和食品監(jiān)管機構(gòu)用于疫情調(diào)查和溯源分析。目前,抗菌藥物聯(lián)合應用是臨床治療沙門菌病的主要措施,由于抗菌藥物的濫用出現(xiàn)了許多多重耐藥細菌、泛耐藥細菌以及全耐藥超級細菌,沙門菌作為重要的致病菌,其耐藥性不容忽視[3]。本研究對遵義市食品來源的21株沙門菌進行血清分型、PFGE分子分型和藥敏試驗,為食源性沙門菌監(jiān)測與溯源提供理論依據(jù),同時為沙門菌感染病例合理使用抗菌藥物、規(guī)避引發(fā)耐藥提供幫助。

1 材料與方法

1.1一般材料 本試驗分析的21株沙門菌均分離自遵義市2020-2022年紅花崗區(qū)、務川縣、鳳岡縣、余慶縣、道真縣、赤水市、綏陽縣、桐梓縣、湄潭縣、仁懷市10個區(qū)縣食品風險監(jiān)測項目標本。PFGE試驗標準菌株為沙門菌H9812,取自貴州省疾病預防控制中心細菌科。藥敏試驗質(zhì)控菌株ATCC25922、ATCC27853均取自貴州省疾病預防控制中心細菌科。

1.2儀器與試劑 沙門菌顯色平板、營養(yǎng)瓊脂、XLD瓊脂均購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司;沙門菌屬診斷血清購自丹麥國家食品研究所;限制性內(nèi)切酶XbaⅠ購自 TaKaRa公司;蛋白酶K、Gelred染液購自索萊寶公司;脈沖場凝膠電泳儀、顯影儀購自Bio-Rad公司; CHNENF革蘭陰性菌藥敏板及配套試劑、Sensitire AIM自動菌液加樣系統(tǒng)及分析系統(tǒng)均購自賽默飛公司;質(zhì)譜儀鑒定儀購自布魯克公司。

1.3方法 沙門菌血清型鑒定是根據(jù)White-Kauffmann Le Minor抗原表,利用玻片凝集法對21株沙門菌進行O抗原和H抗原血清凝集試驗確定菌株的血清型別。PFGE分子分型參照美國Pulse Net PFGE標準化方法進行,將21株分離的沙門菌株用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ酶切后進行PFGE,膠塊經(jīng)Gelred染液染色后成像。藥敏試驗按照美國臨床和實驗室標準化協(xié)會(CLSI)推薦的微量肉湯稀釋法檢測沙門菌對17種抗菌藥物(氯霉素、復方磺胺甲噁唑、頭孢噻肟、頭孢他啶、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、萘啶酸、阿奇霉素、阿米卡星、鏈霉素、氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、多黏菌素、頭孢他啶/阿維巴坦、厄他培南、美羅培南、替加環(huán)素)的藥物敏感性,根據(jù)CLSI抗微生物藥敏試驗執(zhí)行標準M100[4]的相應標準獲得敏感(S)、中度敏感(I)和耐藥(R)的結(jié)果,替加環(huán)素目前在M100標準里無R、S的判斷標準,其R、S的判斷參考文獻[5]。

1.4統(tǒng)計學處理 采用BioNumerics軟件進行聚類分析,構(gòu)建聚類樹。

2 結(jié) 果

2.1沙門菌血清分型 對21株沙門菌進行血清學鑒定,共鑒定出16種血清型,以C群(8株)、D群(5株)、E群(5株)為主,分別占38.10%、23.81%、23.81%,其中肯塔基沙門菌3株、德爾卑沙門菌2株、腸炎沙門菌2株、希林登沙門菌2株,其余均為1株,見表1。

表1 21株食源性沙門菌血清型分布

2.2沙門菌PFGE分子分型 沙門菌用限制性內(nèi)切酶Xba Ⅰ酶切后進行PFGE試驗,結(jié)果顯示DNA片段得到較好的分離,可見大小不一的電泳條帶,見圖1。但菌株之間的相似性不高,同一血清型同源性也不高,其中2株肯塔基沙門菌同源性為62.96%,2株希林登沙門菌同源性為53.85%。

圖1 21株食源性沙門菌PFGE聚類分析圖譜

2.3藥敏試驗結(jié)果 藥敏試驗結(jié)果顯示80.95%沙門菌對17種抗菌藥物存在不同程度的耐藥,見圖2。多重耐藥率達76.19%,其中1株吉韋沙門菌對10種抗菌藥物耐藥,1株希林登沙門菌對10種抗菌藥物耐藥,1株肯塔基沙門菌對11種抗菌藥物耐藥。多重耐藥情況見表2。21株沙門菌對氨芐西林的耐藥率最高,為71.43%,其次是四環(huán)素(61.90%)、復方磺胺甲噁唑(61.90%)、鏈霉素(57.14%)、氯霉素(52.38%),對頭孢他啶/阿維巴坦、厄他培南、美羅培南、替加環(huán)素敏感率均為100%,對頭孢噻肟和頭孢他啶也表現(xiàn)出了一定的耐藥性。

注:由于鏈霉素在體外可能表現(xiàn)為有活性,但臨床治療無效,目前M100標準里沒有規(guī)定鏈霉素敏感耐藥濃度,本文劃分為S≤4,R≥3。

表2 21株沙門菌耐藥譜

3 討 論

沙門菌被列為首選控制的食源性致病菌,其引起的食源性疾病是危害人類健康的重大隱患[6]。研究顯示,在世界范圍內(nèi)由沙門菌引起已確診的患病人數(shù)顯著增加,目前沙門菌每年導致歐洲有超過10萬人患病,引起美國1 200萬人感染、1.9萬人住院甚至450人死亡[7],也是引發(fā)我國食物中毒的首要微生物。據(jù)資料統(tǒng)計,在我國細菌性食物中毒中,70%～80%是由沙門菌引起,而在引起沙門菌中毒的食品中,90%以上是肉類等動物性產(chǎn)品。遵義市近年來在食品中頻繁檢出沙門菌,且檢出的沙門菌血清型復雜多樣,導致遵義市近年來頻繁發(fā)生一些由罕見血清型引起的腹瀉病例或者食物中毒事件。因此本研究初步研究了2020-2022年分離的21株食源性沙門菌的分型及藥敏試驗結(jié)果,為社會防疫部門進行防疫和食物中毒患者的治療提供理論依據(jù)。

沙門菌血清學分型種類繁多,達2 600多種血清型,在不同國家和地區(qū)的分布有差異性。在印度,鼠傷寒沙門菌、雞沙門菌和腸炎沙門菌是最流行的血清型,占分離株的96.2%[8];在埃及,腸炎沙門菌和鼠傷寒沙門菌是最常見的血清型[9];在日本,肉雞樣本中僅存在嬰兒沙門菌、曼哈頓沙門菌和胥伐成格隆沙門菌[10];在我國福建省、濟南市、聊城市、成都市等地的腹瀉標本中,鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌均為優(yōu)勢血清型[11-14],而國內(nèi)食源性疾病中沙門菌最常見的血清型是鼠傷寒、豬霍亂、都柏林、德爾卑、腸炎等沙門菌[15]。本研究中21株沙門菌來源于10個不同區(qū)縣,共鑒定為16種血清型,分布于B、C、D、E群,種類重復率低,無地區(qū)特異性。PFGE試驗結(jié)果顯示,用限制性內(nèi)切酶Xba Ⅰ酶切電泳后,DNA片段可得到了較好的分離,分離率達100%,但菌株之間的相似性不高,其中2株肯塔基沙門菌同源性為62.96%,2株希林登沙門菌同源性為53.85%。結(jié)果說明沙門菌PFGE型別與血清型之間的關(guān)聯(lián)性并不明確,這與崔可琦等[16]報道的冰鮮雞生產(chǎn)鏈中同種血清型沙門菌可分布在多個PFGE譜型內(nèi)一致。以上結(jié)果提示遵義市食品中存在多種型別的沙門菌,食品中沙門菌污染源廣泛、復雜多樣,應加大對沙門菌的防治及監(jiān)控力度。

雖然沙門菌病通常是一種自限性疾病[17],但該疾病可以全身性傳播并退化為慢性疾病,如反應性關(guān)節(jié)炎、骨髓炎、心臟炎癥或神經(jīng)疾病[18]。氨芐西林、氯霉素和甲氧芐啶-磺胺甲噁唑是臨床治療沙門菌病的主要藥物[3,19],但多年來由于抗菌藥物的不合理使用,使得沙門菌對抗菌藥物耐藥現(xiàn)象越來越嚴重[20],并且存在多重耐藥的問題。本研究21株沙門菌耐藥率達80.95%,多重耐藥率達76.19%,對青霉素類耐藥率最高,對四環(huán)素和磺胺類抗菌藥物耐藥性強。這與我國沙門菌耐藥趨勢一致,現(xiàn)有研究數(shù)據(jù)顯示其耐藥機制為相關(guān)耐藥基因tem、tet、sul分別通過編碼β-內(nèi)酰胺酶、外排泵和氫葉酸合成酶介導氨芐西林、四環(huán)素和磺胺類抗菌藥物耐藥。目前,臨床應用頭孢菌素類抗菌藥物治療細菌性感染較為普遍,本研究中部分菌株對于頭孢他啶/頭孢噻肟耐藥現(xiàn)象不容忽視。針對頭孢他啶/頭孢噻肟的耐藥研究,21世紀初美國科學家研究發(fā)現(xiàn)攜帶bla頭孢菌素抗性基因的沙門菌在大洋洲、亞洲、非洲-中東和歐洲等地已經(jīng)出現(xiàn),其耐藥機制還不明確,可能與bla基因突變誘導外排泵的過表達、外膜蛋白表達減少以及導致外膜蛋白丟失的基因突變有關(guān)[21]。除此之外本研究中存在1株吉韋沙門菌對10種抗菌藥物耐藥,1株希林登沙門菌對10種抗菌藥物耐藥,1株肯塔基沙門菌對11種抗菌藥物耐藥,其廣泛的耐藥現(xiàn)象需要進行深入研究。

本研究分析的沙門菌分離自2020-2022年食品風險監(jiān)測項目標本,菌株量較低,還需增加菌株數(shù)才能得到更為準確的結(jié)論,為沙門菌病患者用藥提供支持。但現(xiàn)有數(shù)據(jù)提示遵義市沙門菌污染源廣泛,耐藥現(xiàn)象嚴重,提示在各類食品生產(chǎn)和銷售中都需要保持警惕和嚴格監(jiān)管。