王文怡,余靜恬,甘 程

武漢科技大學(xué)附屬天佑醫(yī)院檢驗(yàn)科,湖北武漢 430000

胃癌是全球主要癌癥之一[1]。由于缺乏腫瘤標(biāo)志物和特定的癥狀和體征,通常在診斷時(shí)已經(jīng)轉(zhuǎn)移[2]。研究表明,晚期胃癌患者的預(yù)后較差,5年生存率低于25%[3]。然而,如果在癌前病變或早期階段進(jìn)行干預(yù)和治療,5年生存率將上升至85%以上[4]。因此,尋找可靠且非侵入性的生物標(biāo)志物用于胃癌的早期檢測(cè)和大規(guī)模篩查具有重要的臨床意義。微小RNA(miRNA)是不編碼蛋白質(zhì)的18～25個(gè)堿基的RNA。由于它們的穩(wěn)定性和可重復(fù)性較高,已經(jīng)成為某些癌癥最具潛力的生物標(biāo)志物之一[5]。胃癌和各種miRNA之間的聯(lián)系已在大量研究中被證實(shí)[6-7]。然而,關(guān)于胃癌癌前病變中miRNA的表達(dá)尚未得到充分驗(yàn)證,也缺乏微陣列進(jìn)行全面分析的報(bào)告。本研究使用血液標(biāo)本進(jìn)行了微陣列試驗(yàn),重點(diǎn)篩查在慢性萎縮性胃炎(胃癌癌前病變)和早期胃癌患者中特征性表達(dá)的miRNA,并分析不同miRNA在胃癌癌前病變和早期胃癌診斷中的價(jià)值和意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(201810-017)。(1)發(fā)現(xiàn)集:于2018年12月1日至12月31日采集早期胃癌患者3例(早期胃癌組)的血漿標(biāo)本,另外按照年齡和性別相匹配原則,簽署知情同意書后,招募3例胃癌癌前病變患者(癌前病變組)和3例健康志愿者(NC組),采集血漿標(biāo)本用作miRNA微陣列分析。(2)驗(yàn)證集:于2019年1月1日至2023年1月1日共采集90例胃癌患者(胃癌組)、89例癌前病變患者(癌前病變組)的血漿標(biāo)本。所有患者都接受了胃腸鏡檢查或其他檢查(包括消化內(nèi)鏡、計(jì)算機(jī)斷層掃描或內(nèi)鏡超聲檢查),并經(jīng)活檢標(biāo)本的病理檢查證實(shí)為癌前病變或胃癌。癌前病變組包括低度上皮內(nèi)瘤變51例和中度上皮內(nèi)瘤變38例。另外,根據(jù)國(guó)際癌癥控制聯(lián)盟(UICC)腫瘤-淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(TNM)系統(tǒng)第8版[8]確定胃癌分型和分期:Ⅰ期16例,Ⅱ期19例,Ⅲ期31例和Ⅳ期24例。早期胃癌是指局限于胃黏膜層或黏膜下層的癌組織,不論其范圍大小或是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,即TNMⅠ/Ⅱ期。接受手術(shù)、放療或化療的患者被排除在本研究之外。另外按照2∶1和年齡、性別相匹配的原則納入45例健康志愿者(NC組)。所有符合條件的受試者都同意參與本研究,并獲得了有關(guān)年齡和性別的信息。將采集用于體檢的血液標(biāo)本殘留(約2 mL)用于miRNA分析。

1.2方法

1.2.1血漿制備和儲(chǔ)存 立即使用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管收集每個(gè)參與者靜脈血4 mL,2 h內(nèi)以3 000 r/min離心5 min,防止細(xì)胞核酸污染。將轉(zhuǎn)移到無RNase/DNase試管中的上層血漿儲(chǔ)存在-80 ℃直至分析。分離用于常規(guī)腫瘤標(biāo)志物測(cè)定的血漿樣品,保存在-20 ℃直至測(cè)定。

1.2.3來自公共數(shù)據(jù)庫的癌癥組織的miRNA表達(dá)數(shù)據(jù) 使用TCGA癌癥數(shù)據(jù)集(https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/),比較了95例正常胃黏膜組織和441例胃癌組織中miRNA的表達(dá)。并從Broad研究所開發(fā)的Firehose軟件中獲得了基因和miRNA的單核苷酸多態(tài)性(SNP)陣列數(shù)據(jù)。使用ASCAT算法和R軟件3.3.2版從SNP陣列數(shù)據(jù)計(jì)算miRNA的拷貝數(shù)。

1.2.4驗(yàn)證集中提取miRNA和qRT-PCR檢測(cè) 使用血液(血清/血漿)miRNA提取和純化試劑盒(離心柱,上海諾倫生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司)從200 μL血漿中分離miRNA。使用NanoQ微量分光光度計(jì)(博奧生物集團(tuán)有限公司)定量血漿miRNA水平。qRT-PCR的初始模板為2 μL。使用一步法Stemaim-it miR qRT-PCR試劑盒定量(Taqman探針,上海諾倫生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司)測(cè)定循環(huán)miRNA表達(dá),而miR-16作為參考miRNA。在ABI-7500 PCR系統(tǒng)上檢測(cè)靶miRNA水平,并使用SDS 2.0軟件(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng))通過循環(huán)閾值(Ct)值計(jì)算。Ct值大于32的樣品被排除在外。miRNA水平用2-ΔΔCt方法標(biāo)準(zhǔn)化。

1.2.5驗(yàn)證集常規(guī)腫瘤標(biāo)志物檢測(cè) 根據(jù)羅氏公司試劑盒和羅氏E170全自動(dòng)免疫分析儀的標(biāo)準(zhǔn)程序,通過電化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定法對(duì)常規(guī)腫瘤標(biāo)志物鐵蛋白、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、CA211、CA50、CA125、CA199、CA153、CA242、CA724進(jìn)行檢測(cè)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均使用SPSS26.0和GraphPad Prism 7.0進(jìn)行分析。非正態(tài)分布的計(jì)量資料以M(P25,P75)表示,多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn),多組間兩兩比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。繪制受試者工作特征(ROC)曲線評(píng)估每種腫瘤標(biāo)志物的診斷價(jià)值。最佳截?cái)嘀凳褂米畲蠹s登指數(shù)確定。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1發(fā)現(xiàn)集miRNA微陣列分析結(jié)果 對(duì)發(fā)現(xiàn)集血漿標(biāo)本進(jìn)行了miRNA微陣列分析,在P<0.05和q<0.2條件下的分析結(jié)果顯示,分別有44個(gè)、136個(gè)和45個(gè)miRNA在NC組和癌前病變組、NC組和早期胃癌組、癌前病變組和早期胃癌組間表現(xiàn)出差異表達(dá)(P<0.05)。其中,與NC組相比,miR-421[早期胃癌組:2.55(2.03,3.19),癌前病變組:1.67(1.14,2.45),NC組:0.42(0.39,0.55)]和miR-196b-3p[早期胃癌組:2.39(1.99,2.97),癌前病變組:1.65(1.16,2.18),NC組:0.83(0.70,0.98)]在早期胃癌組和癌前病變組明顯上調(diào)(P<0.05),且早期胃癌組miR-421和miR-196b-3p較癌前病變組上調(diào)更明顯(P<0.05)。進(jìn)一步利用TCGA數(shù)據(jù)庫對(duì)組織標(biāo)本中miRNA的表達(dá)進(jìn)行了比較分析。結(jié)果顯示,miR-421在胃癌組織中呈高表達(dá)[0.098(0.072,0.146)],與在正常胃黏膜的表達(dá)[0.002(0.001,0.003)]相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。然而,miR-196b-3p表達(dá)在胃癌組織和正常胃黏膜之間比較[0.011 0(0.000 1,0.047 0)vs.0.009 0(0.000 1,0.042 0)],差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.079)。

2.2驗(yàn)證集miR-421、miR-196b-3p和常規(guī)腫瘤標(biāo)志物水平 在驗(yàn)證集中,與NC組相比,癌前病變組和胃癌組血漿miR-421、miR-196b-3p水平明顯上調(diào)(P<0.05),且胃癌組血漿miR-421、miR-196b-3p水平高于癌前病變組(P<0.001)。此外,胃癌組CEA、CA125、CA211和CA50水平均明顯高于NC組和癌前病變組(P<0.05),CA199和CA724水平高于NC組(P<0.05)。癌前病變組血漿miR-421、miR-196b-3p、AFP、鐵蛋白、CA211、CA50水平明顯高于NC組(P<0.05)。見表1。

表1 驗(yàn)證集NC組、癌前病變組和胃癌組血漿中miR-421、miR-196b-3p和常規(guī)腫瘤標(biāo)志物水平比較[M(P25,P75)]

2.3miR-421、miR-196b-3p和腫瘤生物標(biāo)志物對(duì)胃癌的診斷價(jià)值 將驗(yàn)證集中NC組和癌前病變組作為對(duì)照,根據(jù)ROC曲線評(píng)估,血漿miR-421對(duì)胃癌的診斷準(zhǔn)確性最高,AUC為0.931(95%CI:0.889～0.972)。進(jìn)一步將miR-421、miR-196b-3p與傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物的診斷價(jià)值進(jìn)行比較。結(jié)果顯示miR-421的AUC高于CEA、CA125、CA199、CA724、CA211、CA50診斷胃癌的AUC(P<0.05),同樣miR-196b-3p診斷胃癌的AUC也高于CEA、CA125、CA199、CA724診斷胃癌的AUC(P<0.05)。另外,miR-421的假陰性率也低于所有常規(guī)腫瘤生物標(biāo)志物。見表2和圖1。

注:以NC組和癌前病變組作為對(duì)照。

表2 miR-421、miR-196b-3p和腫瘤標(biāo)志物對(duì)胃癌的診斷價(jià)值

2.4血漿miR-421、miR-196b-3p對(duì)早期胃癌的診斷價(jià)值 進(jìn)一步分析血漿miR-421、miR-196b-3p在早期(TNMⅠ期16例和Ⅱ期19例)胃癌患者中的診斷價(jià)值,將NC組和癌前病變組作為對(duì)照組。早期胃癌組血漿miR-421水平[3.50(2.19,5.22)]高于對(duì)照組[ 0.95(0.76,1.18)],差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=6.751,P<0.001);早期胃癌組血漿miR-196b-3p[1.88(1.16,2.73)]水平高于對(duì)照組[0.97(0.75,1.24)],差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=4.723,P<0.001)。將NC組和癌前病變組作為對(duì)照,繪制ROC曲線分析血漿miR-421、miR-196b-3p對(duì)早期胃癌的診斷價(jià)值。結(jié)果顯示:miR-421診斷早期胃癌的AUC為0.942(95%CI:0.886～0.997),靈敏度為88.61%,特異度為93.36%;miR-196b-3p診斷早期胃癌的AUC為0.809(95%CI:0.708～0.910),靈敏度為68.62%,特異度為86.75%。見圖2。

注:以NC組和癌前病變組作為對(duì)照。

2.5miR-421、miR-196b-3p和腫瘤生物標(biāo)志物對(duì)癌前病變的診斷價(jià)值 將NC組作為對(duì)照,根據(jù)表1結(jié)果繪制ROC曲線,血漿miR-421或miR-196b-3p水平上調(diào)可以很好地區(qū)分癌前病變患者和NC組。血漿miR-421和miR-196b-3p診斷癌前病變的AUC分別為0.788和0.648,miR-421的AUC均高于miR-196b-3p、鐵蛋白、CA50診斷癌前病變的AUC(P<0.05),但是略低于CA211(P<0.05)。見表3和圖3。

注:以NC組為對(duì)照。

表3 miR-421、miR-196b-3p和腫瘤標(biāo)志物對(duì)癌前病變的診斷價(jià)值

2.6驗(yàn)證集胃癌組不同分期、癌前病變組及NC組miR-421和miR-196b-3p水平比較 驗(yàn)證集癌前病變組與胃癌組TNM Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ/Ⅳ期之間miR-421、miR-196b-3p水平比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。然而,胃癌Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ/Ⅳ期病例之間血漿miR-421和miR-196b-3p水平比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 驗(yàn)證集胃癌組不同分期、癌前病變組及NC組miR-421和miR-196b-3p水平比較[M(P25,P75)]

3 討 論

迄今為止,還沒有可靠的無創(chuàng)性血液生物標(biāo)志物用于診斷早期胃癌或癌前病變[9]。本研究首先通過微陣列篩選,確定了癌前病變和早期胃癌患者血漿miR-421和miR-196b-3p存在差異表達(dá)。進(jìn)一步通過臨床血漿標(biāo)本證實(shí)了這兩種miRNA對(duì)于癌前病變和胃癌患者有良好的診斷價(jià)值:早期胃癌和癌前病變患者血漿miR-421、miR-196b-3p水平明顯高于NC組; ROC曲線分析結(jié)果顯示,miR-421和miR-196b-3p在區(qū)分早期胃癌或癌前病變患者與NC組方面具有很高準(zhǔn)確性。因此本研究結(jié)果表明,血漿miR-421和miR-196b-3p在診斷早期胃癌和癌前病變患者方面可能是有臨床意義的生物標(biāo)志物。

miR-421定位在人類染色體1p34.23上,是 miR-200 家族的重要成員之一[10]。據(jù)KIM等[11]報(bào)道,胃癌組織和胃液中miR-421水平的升高可能對(duì)胃癌診斷有意義。這些結(jié)果與本研究的發(fā)現(xiàn)一致,即miR-421在胃癌患者中高表達(dá),可能在胃癌中具有潛在的診斷價(jià)值。miR-196基因家族(miR-196a-1、miR-196a-2、miR-196b)是從人類同源盒(HOX)基因簇區(qū)域中含有3個(gè)基因(ECRG4、RAD23B和HOXA10)的區(qū)域轉(zhuǎn)錄而來[12]。miR-196a-1和miR-196a-2具有相同的成熟核苷酸序列,但成熟miR-196b與成熟miR-196a僅相差1個(gè)核苷酸[13]。在先前的研究中,miR-196b的大量表達(dá)抑制了ECRG4和RAD23B[14]。此外,HOXA10和miR-196b同時(shí)過表達(dá)的胃癌患者預(yù)后較差[15]。因此,miR-196b和HOXA10的過度表達(dá)可能介導(dǎo)因幽門螺桿菌引發(fā)慢性炎癥所導(dǎo)致的癌癥進(jìn)展。但是目前關(guān)于miR-196b-3p在胃癌發(fā)病和進(jìn)展中的臨床證據(jù)不足。在本研究中,miR-421和miR-196b-3p在區(qū)分胃癌患者與NC組及癌前病變組方面可以達(dá)到令人滿意的診斷效能,AUC分別為 0.931和0.804,尤其是miR-421,其AUC高于所有的常規(guī)腫瘤生物標(biāo)志物,同樣miR-196b-3p的AUC也高于CEA、CA125、CA199和CA724?？傊?上述數(shù)據(jù)進(jìn)一步闡明了這兩種miRNA作為新型腫瘤標(biāo)志物的診斷價(jià)值。

提高胃癌的早期診斷率對(duì)于及時(shí)治療尤為重要。既往,研究人員已經(jīng)闡明了幾種miRNA在早期胃癌診斷中的潛在作用[16-18]。盡管諸如miR-101之類的研究對(duì)胃癌的早期階段具有很高的診斷價(jià)值,但該研究不包括癌前病變,并且miRNA的細(xì)微變化和性能沒有進(jìn)一步闡述。在本研究中,基于胃癌標(biāo)本的詳細(xì)TNM分期特征,筆者探討了血漿miR-421和miR-196b-3p在早期胃癌中的診斷價(jià)值,結(jié)果表明,miR-421和miR-196b-3p都能較好地區(qū)分早期胃癌與對(duì)照組(NC組+癌前病變組),提示miR-421和miR-196b-3p在早期胃癌診斷中可能具有顯著的臨床價(jià)值。

癌前病變會(huì)使患胃癌的風(fēng)險(xiǎn)增加6倍以上[19]。以前的研究報(bào)道稱癌前病變受miRNA調(diào)節(jié)[20]。由于缺乏胃腸化生和非典型增生的臨床表現(xiàn),臨床缺乏有效的無創(chuàng)檢測(cè)手段。幾種循環(huán)miRNA,特別是miR-196a、miR-18a、miR-21、miR-125b等,已被篩選出作為胃癌和癌前病變以及胃癌進(jìn)展的早期標(biāo)志物[21-22]。然而,這些miRNA與傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物在胃癌和癌前病變?cè)\斷中的比較價(jià)值尚未明確。最佳循環(huán)miRNA生物標(biāo)志物應(yīng)比傳統(tǒng)腫瘤生物標(biāo)志物具有更好的特異度和靈敏度。在本研究中發(fā)現(xiàn)血漿miR-421和miR-196b-3p可以很好地區(qū)分癌前病變和NC組,AUC分別為0.788和0.648。尤其是miR-421的診斷效能明顯高于一些傳統(tǒng)的腫瘤生物標(biāo)志物,如鐵蛋白和CA50。

胃癌的發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)多階段的過程,miR-421、miR-196b-3p可能與某個(gè)階段或整個(gè)疾病過程有關(guān)[22]。本研究最后進(jìn)一步分析了miRNA隨胃癌進(jìn)展上調(diào)的趨勢(shì)。結(jié)果表明,血漿miR-421和miR-196b-3p水平在胃癌Ⅰ期病例中的表達(dá)與Ⅱ、Ⅲ/Ⅳ期無差異,但在發(fā)病早期(Ⅰ～Ⅱ期),已經(jīng)能夠有效地區(qū)分胃癌和癌前病變,表明miR-421和miR-196b-3p上調(diào)最初是發(fā)生在癌前病變和早期胃癌中的。因此,本研究推測(cè)這兩種miRNA的上調(diào)可能是由致癌危險(xiǎn)因素引發(fā)的,例如癌前慢性炎癥或幽門螺桿菌感染,但這需要進(jìn)行詳細(xì)的調(diào)查。

綜上所述,本研究結(jié)果表明,血漿miR-421和miR-196b-3p可能是癌前病變和早期胃癌的潛在標(biāo)志物。這項(xiàng)研究為臨床提供了關(guān)于這兩種miRNA在胃癌發(fā)病中作用的新見解。這些結(jié)果可能為開發(fā)用于早期胃癌診斷的新型生物標(biāo)志物鋪平道路。這項(xiàng)研究的局限性在于樣本量相對(duì)較小,為單中心研究,缺少多因素分析等?？傊?miR-421和miR-196b-3p作為早期血漿生物標(biāo)志物在癌前病變和胃癌臨床診斷中的確切用途應(yīng)在使用較大樣本量的研究和臨床試驗(yàn)中進(jìn)一步探索。