于 鵬,周傳貴,楚士穎,李 艷,2,遲 偉,田 晗,程文播,2△

1.天津國科醫(yī)療科技發(fā)展有限公司,天津 300399;2.中國科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所,江蘇蘇州 215163;3.遼寧省沈陽市婦幼保健院,遼寧沈陽 110014

脂溶性維生素是人體保持最佳新陳代謝狀態(tài)所必需的微量營養(yǎng)素,主要包括維生素A、維生素D、維生素E和維生素K 4種[1]。隨著研究的深入,脂溶性維生素的作用早已不局限于人們的初步認識,比如夜盲癥[維生素A(VA)缺乏]、骨軟化癥(維生素D缺乏)、氧化應(yīng)激異常[維生素E(VE)缺乏]和異常出血(維生素K缺乏)等,而是發(fā)現(xiàn)脂溶性維生素的異常變化與越來越多的疾病及其他生理狀態(tài)有關(guān)[2]。有研究表明VA可促進免疫系統(tǒng)發(fā)育[3],增強免疫能力[4],其含量低甚至與成人早期肥胖有關(guān)[5];維生素D在某些精神性疾病和糖尿病的預(yù)防方面有一定作用[6-7];適宜濃度的VE對癌癥預(yù)防和糖尿病腎病、非酒精性脂肪肝的治療有所幫助[8-9];維生素K則與兒童的矮小癥和成人的冠心病有一定關(guān)聯(lián)[10-11]。因此,建立一種快速、準(zhǔn)確的臨床檢測多種脂溶性維生素的方法愈發(fā)重要,這將大大加快人們研究以及運用各種脂溶性維生素的進程。

近年來,國內(nèi)外液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)技術(shù)正在快速發(fā)展。放射免疫法和酶聯(lián)免疫法等傳統(tǒng)檢測方法[12-13]存在放射污染的潛在風(fēng)險及易與其他非目標(biāo)化合物發(fā)生交叉反應(yīng)而導(dǎo)致特異性差等缺點。LC-MS/MS具有高特異度、高靈敏度、高準(zhǔn)確性等優(yōu)勢,使之在檢測領(lǐng)域的各個方面被快速推廣[14],特別是在維生素檢測方面[15],LC-MS/MS可以同時檢測25-羥基維生素D2(25-OH-D2)和25-羥基維生素D3(25-OH-D3)的精確濃度,使之成為國際上公認的維生素D檢測的金標(biāo)準(zhǔn)[16]。當(dāng)然,該方法也面臨所需樣品量大、前處理復(fù)雜耗時且儀器操作較為復(fù)雜等問題。為了進一步拓展LC-MS/MS在檢測維生素方面的應(yīng)用,大量學(xué)者開展了相關(guān)研究,例如陳敏純等[17]開發(fā)了僅需200 μL血清樣品即可檢測4種脂溶性維生素的方法。本研究則將針對VA、維生素D(25-OH-D2、25-OH-D3)、VE和維生素K1(VK1)5種脂溶性維生素建立LC-MS/MS的檢測方法,實現(xiàn)利用更少的樣品(100 μL血清),進行簡單的前處理過程,使用同位素標(biāo)記法在短時間內(nèi)同時對5種脂溶性維生素實現(xiàn)精準(zhǔn)定量,并對臨床血清樣品進行驗證,為臨床醫(yī)生的準(zhǔn)確判斷提供真實、可靠的體內(nèi)脂溶性維生素水平。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究所選儀器:天津國科醫(yī)療科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)的HTQ 2020高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測系統(tǒng),德國Eppendorf公司生產(chǎn)的高速冷凍離心機,杭州奧盛儀器有限公司生產(chǎn)的氮吹儀;所選試劑:購于美國Sigma-Aldrich公司的VA、25-OH-D2、25-OH-D3、VE,購于上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司的VA-d4、25-OH-D2-d6、25-OH-D3-d6、VE-d6,購于上海譜芬生物科技有限公司的VK1、VK1-d7,甲酸、甲醇、正己烷、乙腈等均為色譜級試劑;所選樣品為2021年10月至2022年6月在沈陽市婦幼保健院健康查體的19例隨機健康人血清。

1.2樣品前處理 取100 μL標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品,為消除人體血清中的不同內(nèi)源性物質(zhì)對維生素檢測的基質(zhì)效應(yīng),加入10 μL同位素內(nèi)標(biāo)工作液,加入200 μL甲醇/乙腈混合溶液渦旋混勻2 min,加入600 μL正己烷,渦旋混勻2 min,4 000 r/min離心5 min,取500 μL上清液,室溫氮氣吹干,加入乙腈水溶液復(fù)溶后上機測試。

1.3液相色譜條件 采用Phenomenex Kinetex C18(50.0 mm×3.0 mm,2.6 μm)色譜柱,柱溫設(shè)置為40 ℃,流動相A相為0.1%甲酸水溶液,流動相B相為0.1%甲酸甲醇溶液,洗脫程序見表 1,流速為0.6 mL/min,進樣體積為20 μL。

表1 梯度洗脫時間程序

1.4質(zhì)譜條件 采用多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)、大氣壓化學(xué)電離正離子模式(APCI+),離子源溫度300 ℃,氣簾氣壓10 psi,噴霧氣壓50 psi,加熱氣壓10 psi,碰撞氣壓9 psi;5種脂溶性維生素的MRM離子參數(shù)見表2。

表2 5種脂溶性維生素及其內(nèi)標(biāo)的MRM離子參數(shù)

1.5定量下限 根據(jù)脂溶性維生素的臨床檢測需求及儀器設(shè)備的靈敏度,設(shè)置本方法的定量下限:VA為50 ng/mL、25-OH-D2為2 ng/mL、25-OH-D3為2 ng/mL、VE為1 000 ng/mL、VK1為0.5 ng/mL,連續(xù)檢測12次,計算檢測值和理論值的偏差以及測試結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

1.6精密度、加標(biāo)回收率和攜帶污染測定 (1)按1.2樣品前處理方法在含5%BSA標(biāo)本中添加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液作為質(zhì)控樣品(低濃度質(zhì)控QCL、中濃度質(zhì)控QCM、高濃度質(zhì)控QCH),每個濃度質(zhì)控樣品重復(fù)制備3份,按上述分析條件對質(zhì)控樣品進行每天3次檢測,連續(xù)檢測3 d,以衡量其日內(nèi)精密度和日間精密度。(2)在收集的健康人血清樣品中添加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液(QCL、QCM、QCH)獲得不同濃度的加標(biāo)樣品,按1.2樣品前處理方法對健康人血清樣品和加標(biāo)樣品進行處理,每個濃度樣品重復(fù)制備6份,按上述的檢測方法對各加標(biāo)回收樣品進行分析,利用各標(biāo)準(zhǔn)品的校準(zhǔn)曲線計算不同樣品濃度,各濃度質(zhì)控樣品與實際血清樣品的檢測值差值與實際添加的標(biāo)準(zhǔn)品濃度的比值作為加標(biāo)回收率。(3)對該方法的攜帶污染進行評估,先重復(fù)進樣低濃度標(biāo)本,然后交替進樣高濃度標(biāo)本和低濃度標(biāo)本。通過比較第1次進樣的低濃度標(biāo)本檢測結(jié)果與隨后進樣的低濃度標(biāo)本檢驗結(jié)果的差異,得到攜帶污染率。

2 結(jié) 果

2.1定量下限標(biāo)本測試結(jié)果 VA、25-OH-D2、25-OH-D3、VE、VK1測試值和理論值的偏差均在15%以內(nèi),測試的平行標(biāo)本RSD在15%以內(nèi)。見表3。

表3 定量下限標(biāo)本測試結(jié)果(n=12)

2.2MRM色譜圖與線性測試結(jié)果 經(jīng)上述1.2樣品前處理后,在上述色譜條件及質(zhì)譜條件下獲得5種脂溶性維生素及其內(nèi)標(biāo)的MRM色譜圖,見圖1。

圖1 5種脂溶性維生素標(biāo)準(zhǔn)溶液及其相對應(yīng)的內(nèi)標(biāo)MRM色譜圖

根據(jù)VA、25-OH-D2、25-OH-D3、VE、VK1的臨床檢測需求確定檢測范圍,并在檢測范圍需求內(nèi)設(shè)置濃度梯度,檢測梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)品,將目標(biāo)分析物和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值與梯度濃度進行擬合,得到工作曲線,擬合曲線及曲線方程如圖 2所示。由圖可知標(biāo)準(zhǔn)曲線呈良好的線性關(guān)系,且r值均在0.998以上,因此該檢測方法的線性范圍分別是VA為50～2 000 ng/mL、25-OH-D2為2～150 ng/mL、25-OH-D3為2～250 ng/mL、VE為1 000～16 000 ng/mL、VK1為0.5～20 ng/mL。

2.3精密度測定結(jié)果 日內(nèi)精密度和日間精密度結(jié)果如表4所示,日內(nèi)精密度在1.87%～8.50%,日間精密度在2.85%～9.81%。

表4 脂溶性維生素低、中、高濃度樣品日內(nèi)精密度和日間精密度考察結(jié)果(n=3)

2.4加標(biāo)回收率測定結(jié)果 加標(biāo)回收率測定結(jié)果如表5所示,結(jié)果顯示在91.47%～107.30%。

表5 脂溶性維生素低、中、高濃度樣品加標(biāo)回收率考察結(jié)果(n=6)

2.5攜帶污染 各脂溶性維生素攜帶污染率如下:VA為1.32%,25-OH-D2為-0.05%,25-OH-D3為-6.03%,VE為-3.93%,VK1為2.14%。

2.6血清樣品檢測 使用本方法對19例健康者血清樣品進行處理檢測,檢測結(jié)果如下:VA為250.00～730.00 ng/mL,25-OH-D2為0.46～5.82 ng/mL,25-OH-D3為3.97～42.47 ng/mL,VE為2 200.00～13 100.00 ng/mL,VK1為0.13～1.51 ng/mL。空白樣品的MRM色譜圖如圖3所示,人血清樣品的MRM色譜圖如圖4所示。

圖3 空白樣品中5種脂溶性維生素及其相對應(yīng)的內(nèi)標(biāo)MRM色譜圖

3 討 論

不同脂溶性維生素在不同人群體內(nèi)的含量差別十分明顯,其作用也各不相同,而且往往是多種維生素共同起作用而產(chǎn)生影響。有研究證明孕婦這一特殊群體更易出現(xiàn)25-OH-D2、25-OH-D3缺乏的現(xiàn)象[18],而缺乏VA和VE的新生兒更易發(fā)生低體質(zhì)量和免疫力低下等問題[19],另外骨質(zhì)疏松癥的患者更可能存在維生素D和維生素K缺乏的現(xiàn)象[20]。然而,傳統(tǒng)的檢測方式難以同時實現(xiàn)對多種脂溶性維生素的準(zhǔn)確定量檢測。LC-MS/MS可以在較寬的檢測范圍內(nèi)快速、準(zhǔn)確地獲得未知樣品中待測物質(zhì)的濃度,具有更高的特異度和準(zhǔn)確度,可以為臨床檢測提供更為可靠的參考結(jié)論,從而更快速地為患者制訂治療方案。但該技術(shù)需要的樣本量相對較多,操作具有一定的復(fù)雜性,使之難以在普通醫(yī)院推廣[21]。因此本研究進一步簡化其操作流程,減少樣品用量,規(guī)范整個檢測過程,醫(yī)護人員僅需簡單培訓(xùn)即可掌握該操作,在幾分鐘內(nèi)完成整個檢測過程。

另外,本研究針對血清中VA、25-OH-D2、25-OH-D3、VE和VK1建立的LC-MS/MS方法檢測結(jié)果顯示,各種脂溶性維生素在標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍內(nèi)線性程度良好,日內(nèi)精密度和日間精密度較為理想,利用新鮮血清進行加標(biāo)檢測證明加標(biāo)回收率良好,在檢測高濃度及其以下濃度標(biāo)本時不存在明顯的攜帶污染,可滿足臨床檢測要求。而且,針對真實健康者血清樣品的檢測結(jié)果顯示,各種脂溶性維生素水平符合當(dāng)?shù)厝巳旱奶攸c[22],證實本研究所建立的方法切實適合臨床檢測。

綜上所述,本研究成功建立了一種針對人血清中5種脂溶性維生素快速定量的LC-MS/MS方法,不僅操作簡單,而且定量準(zhǔn)確,適合臨床血清樣品的檢測,可以為臨床醫(yī)生的醫(yī)學(xué)診斷提供真實、可靠的體內(nèi)脂溶性維生素水平,幫助不同人群進行健康水平判斷和相關(guān)疾病治療。