趙亞男，任艷茹，謝 賓，王園美，李顯耀*

（1.山東農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，山東泰安 271018；2.濟寧市任城區(qū)畜牧獸醫(yī)事業(yè)發(fā)展中心，山東濟寧 272000）

沙門氏菌病是一類由某些特定血清型沙門氏菌引起的動物急性或慢性疾病，是重要的人畜共患病之一，防治沙門氏菌病具有十分重要的公共衛(wèi)生學意義[1]。腸炎沙門菌（Salmonella enterica serovar Enteritidis，SE）作為一種食源性病原菌，分布廣泛且傳播途徑復雜，主要通過畜禽產(chǎn)品傳遞給人類，對養(yǎng)雞業(yè)和人類健康危害嚴重[2]。目前關(guān)于應對腸炎沙門氏菌感染的問題，傳統(tǒng)的方法，如疫苗接種[3]和噬菌體治療[4]等生物方法大多存在局限性，如耗費人力物力、治療周期長、效果低等。隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，從遺傳育種的角度篩選相關(guān)抗病育種分子標記或利用同源重組等技術(shù)成為未來抗病育種的研究方向，因此如何利用分子手段應對腸炎沙門氏菌的感染顯得尤為重要。而m6A 甲基化作為一種表觀遺傳學修飾，現(xiàn)在已經(jīng)成為分子生物學的研究熱點，利用m6A 甲基化測序技術(shù)（meRIP-seq）可以篩選相關(guān)甲基化位點從而作為一些分子標記應用到抗病遺傳育種中。有研究表明m6A 甲基化參與病毒在宿主細胞中的復制過程[5]。m6A 修飾過程主要涉及甲基轉(zhuǎn)移酶、去甲基化酶和特異性結(jié)合蛋白的共同調(diào)控。而METTL3 和METTL14 作為甲基化轉(zhuǎn)移酶的重要成員，它們的表達在一定程度上會影響m6A 甲基化修飾過程，從而影響病毒在宿主中的定植[6,7]。除此之外，METTL14 還參與調(diào)控肌內(nèi)脂肪沉積過程，Zhang 等[8]通過甲基化測序（MeRIP-seq）和RNA 測序（RNA-seq）對180 日齡靖遠雞的乳房和腿部肌內(nèi)脂肪的調(diào)控研究，發(fā)現(xiàn)METTL14 參與肌肉脂質(zhì)合成代謝的調(diào)節(jié)。目前關(guān)于m6A 甲基化修飾在腸炎沙門氏菌上的研究還未見相關(guān)報道。m6A 甲基化（N6-Methyladenosine Modifications）作為一種可逆的表觀遺傳修飾，是真核生物中最普遍且最豐富的轉(zhuǎn)錄后修飾[9]。甲基轉(zhuǎn)移酶、去甲基化酶和m6A 結(jié)合蛋白參與m6A 甲基化的可逆動態(tài)調(diào)控[10]。m6A 甲基化會影響RNA 的轉(zhuǎn)錄、翻譯、剪切與降解等生物學過程[11,12]。研究表明，m6A 甲基化在動物繁殖、生長發(fā)育、免疫等方面發(fā)揮重要的調(diào)控作用[13]。METTL3 缺陷可以影響相關(guān)mRNA 的m6A 甲基化修飾，抑制IL-7 介導的STAT5 活性以及T 細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)增殖和分化，從而預防腸炎的發(fā)生[14]。METTL14 在誘導自噬和阻礙骨質(zhì)疏松過程中起關(guān)鍵作用，過表達METTL14 可以通過m6A 修飾調(diào)控beclin-1 的表達誘導自噬，從而顯著增強骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化能力[15]。

mRNA 的表達調(diào)控參與了機體感染沙門氏菌后的免疫應答過程。有研究表明，雞感染沙門氏菌后，脾臟FNP1 mRNA 表達顯著上調(diào)[16]。Wu等[17]通過對雞灌服接種腸炎沙門氏菌，并對第7天和第14 天雞的脾臟組織進行基因芯片檢測發(fā)現(xiàn)，GC、TNFSF8、CD86、CD274、BLB1 和BLB2 基因可能參與應對腸炎沙門氏菌感染調(diào)控過程。目前傳統(tǒng)方法如疫苗、抗生素等具有一定的局限性，且尚無有效的治療藥物或疫苗。從長遠角度來看，可通過抗病育種等技術(shù)手段培育抗性品種（品系），提高群體遺傳抗性。目前關(guān)于利用分子標記應用到抗病育種的研究有很多，通過利用反義基因阻礙病原蛋白的轉(zhuǎn)譯法，現(xiàn)已成功克隆出新城疫（ND）、馬立克氏?。∕D）、傳染性支氣管炎（IB）、法氏囊病毒（IBD）和禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥（RE）等的基因片段[18]。然而目前關(guān)于甲基化轉(zhuǎn)移酶在腸炎沙門氏菌感染的表達調(diào)控機制還不清楚，本研究利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測雞感染腸炎沙門氏菌后不同時間點脾臟組織METTL3、METTL14 基因表達量的變化，從而為METTL3、METTL14 基因在雞腸炎沙門氏菌感染中的調(diào)控機制提供理論基礎(chǔ)和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗雞及飼養(yǎng)管理

利用胎糞涂板法對1 日齡濟寧百日雞（父本）×廣西瑤雞（母本）的F1 代預先進行SE 含菌量檢測，采集每只雞的胎糞于含PBS 的離心管中，涂布于SS 瓊脂，16～24h 后觀察結(jié)果，并隨機挑選40 只2 日齡腸炎沙門氏菌陰性濟寧百日雞（父本）×廣西瑤雞（母本）的F1 代，試驗動物由濟寧大唐百日雞養(yǎng)殖有限公司提供。將40只雞隨機分為2 組，各20 只，分別飼喂于飼養(yǎng)環(huán)境相同的2 個無菌隔離器中，自由采食和飲水。

1.2 動物接種及樣品采集

試驗所用腸炎沙門氏菌購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心（CVCC3377）。試驗組每只雞經(jīng)口灌喂0.3mL 含菌量為6.34×107CFU/mL 的腸炎沙門氏菌菌液，對照組灌喂等量無菌PBS，于接種后第1 天及第7 天采集各采集10 只雞的脾臟組織，置于液氮中速凍后轉(zhuǎn)移至-80℃超低溫冰箱中保存，供后續(xù)試驗使用。

1.3 組織RNA 提取，反轉(zhuǎn)錄及實時熒光定量PCR

使用Trizol 法（試劑均購自南京諾唯贊生物科技有限公司）分別提取感染后第1 天及第7 天試驗組和對照組脾臟組織總RNA，利用微量紫外分光光度計（NanoDrop 2000，USA）和瓊脂糖凝膠電泳成像系統(tǒng)（Ge1300series，Alpha Innotech）對所提取的總RNA 進行濃度和質(zhì)量檢測，質(zhì)檢合格后利用Evo M-MLV 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（湖南艾科瑞生物工程有限公司）將總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA；參照GenBank 中的基因序列，以GAPDH為內(nèi)參，利用DNAMAN 軟件設(shè)計特異性引物，所設(shè)計的引物由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成，引物序列如表1 所示。SYBR Green Pro Taq HS 預混型qPCR 試劑盒購于湖南艾科瑞生物工程有限公司；利用SYBR Green Pro Taq HS預混型qPCR 試劑盒（湖南艾科瑞生物工程有限公司）通過實時熒光定量PCR 儀（Roche qPCR儀Light Cycler@96，Roche Diagnostics）。

表1 引物序列

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

利用Excel 對所得數(shù)據(jù)進行預處理，并利用SAS 9.2 軟件進行方差分析，P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量，并用GraphPad Prism 8 軟件進行作圖。

2 結(jié)果與分析

如圖1a 所示，在感染后第1 天，對照組中脾臟METTL3 的表達量顯著低于試驗組（P＜0.05），感染后第7 天對照組高于試驗組，但差異不顯著（P＞0.05）。對不同時間點相同處理組之間進行分析發(fā)現(xiàn)，對照組中感染腸炎沙門氏菌后第1 天METTL3 表達量低于感染后第7 天，而試驗組完全相反，感染腸炎沙門氏菌后第1 天METTL3 表達量高于感染后第7 天（圖1b）。

圖1 感染腸炎沙門氏菌后METTL3 在雞脾臟中的表達量及表達趨勢

如圖2a 所示，對同一時間點對照組和試驗組脾臟中相對表達水平進行分析發(fā)現(xiàn)，在感染后第1 天，對照組中脾臟METTL14 的表達量顯著低于試驗組，感染后第7 天對照組高于試驗組，且差異均顯著（P＜0.05）；如圖2b 所示，對不同時間點相同處理組之間進行分析發(fā)現(xiàn)，對照組和試驗組中感染腸炎沙門氏菌后第1 天METTL3 表達量均極顯著低于感染后第7 天（P＜0.01）。

圖2 感染腸炎沙門氏菌后METTL14 在雞脾臟中的表達量及表達趨勢

3 討論

在本試驗中，在感染腸炎沙門氏菌后第1天，METTL3 和METTL14 在脾臟中的表達水平均是試驗組高于對照組，但是在感染后第7 天，雖然METTL3 和METTL14 在脾臟中的表達水平均有所升高，但是試驗組均低于對照組，說明METTL3 及METTL14 表達量在一定程度上是呈現(xiàn)動態(tài)變化的，丁浩等[19]通過對不同發(fā)育時期骨骼肌中METTL3、METTL14 表達水平進行研究，發(fā)現(xiàn)METTL3、METTL14 表達量也具有一定的動態(tài)變化趨勢，這與我們的研究結(jié)果具有一定的相似性。空腸彎曲菌和腸炎沙門氏菌同屬于革蘭氏陰性菌，機體對他們的免疫調(diào)控機制具有一定的相似性。張彩鳳等[20]通過研究2 日齡無特定病原菌（SPF）雞接種空腸彎曲菌后4、8、12、16、20、24h 等時間點脾臟組織METTL3、METTL14 的表達量水平，發(fā)現(xiàn)雞感染空腸彎曲菌可以引起METTL3、METTL14 的差異表達，且具有晝夜節(jié)律性。研究表明，m6A 機制表達的變化可以影響細胞基因表達，從而間接調(diào)節(jié)病毒及細菌的生命周期[21,22]。機體遭受細菌和病毒攻擊后會產(chǎn)生一系列免疫反應，免疫系統(tǒng)是一種宿主防御系統(tǒng)，可防止宿主出現(xiàn)感染和疾病發(fā)生[23]。近年來，越來越多的研究表明，m6A 修飾參與免疫應答的誘導過程。m6A 甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白METTL3 和METTL14可以負向調(diào)控HCV（丙型肝炎病毒）的復制過程，且HCV RNA 的m6A 修飾受WTAP 的調(diào)控[24]。另外有研究表明m6A 甲基化酶METTL14可以通過Akt/mTOR 信號通路調(diào)控心肌缺血/ 再灌注損傷，心肌損傷后會引起m6A 甲基化轉(zhuǎn)移酶METTL14 的表達升高[25]。因此我們推測m6A 甲基化修飾可能參與細菌的防御反應過程，然而具體的機制還需要進一步研究。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，雞接種腸炎沙門氏菌后，可以引起脾臟組織METTL3 和METTL14 的差異表達，推測m6A 甲基化參與腸炎沙門氏菌的防御反應過程，本研究初步揭示了m6A 甲基化修飾參與細菌的防御反應過程的分子基礎(chǔ)，但具體的調(diào)控機制還需進一步的研究。