劉金林,陳 明

(1.安慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校,安徽 安慶 246052;2.安徽中醫(yī)藥大學(xué))

阿維巴坦(Avibactam)屬于二氮雜雙環(huán)辛酮化合物,其藥理機(jī)制為:β-內(nèi)酰胺酶絲氨酸親核作用于阿維巴坦酰胺鍵,兩者形成共價(jià)結(jié)合物,即酶-抑制劑復(fù)合體,性質(zhì)穩(wěn)定難以水解,但可再經(jīng)環(huán)合作用又形成阿維巴坦藥物原型。此過(guò)程,一是親核破壞阿維巴坦酰胺鍵的速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于環(huán)合恢復(fù)的能力,可以長(zhǎng)時(shí)間維持酶-抑制劑復(fù)合體;二是阿維巴坦自身結(jié)構(gòu)可通過(guò)環(huán)合作用恢復(fù),親核可與其重復(fù)發(fā)生開環(huán)反應(yīng)形成復(fù)合體,最終使β-內(nèi)酰胺酶處于長(zhǎng)期抑制狀態(tài),進(jìn)而喪失水解β-內(nèi)酰胺環(huán)的能力。阿維巴坦本身無(wú)明顯的抗菌活性,但與各類頭孢和碳青霉烯抗生素聯(lián)合使用時(shí),能顯著抑制A型和C型的β-內(nèi)酰胺酶,尤其是能明顯增強(qiáng)對(duì)含有超廣譜β-內(nèi)酰胺酶以及AmpC酶的大腸桿菌和克雷伯肺炎桿菌的抗菌活性。目前,阿維巴坦被視為前景較好的非β-內(nèi)酰胺類抑制劑[1]。

阿維巴坦臨床上用其鈉鹽,阿維巴坦鈉的合成[2-3]是以(2S,5R)-5-[(芐氧基)氨基]哌啶-2-羧酸乙酯為起始物料,經(jīng)過(guò)3步化學(xué)反應(yīng)加1步成鈉鹽制備目標(biāo)化合物阿維巴坦鈉。見圖1。

圖1 阿維巴坦鈉合成工藝路線

起始物料是決定原料藥質(zhì)量的重要組成部分,完善起始物料選擇準(zhǔn)則和嚴(yán)格控制起始物料的選擇及質(zhì)量要求,有助于規(guī)范原料藥的生產(chǎn)和提高原料藥的質(zhì)量。本研究采用高效液相色譜法(High performance liquid chromatography,HPLC)[4-5]進(jìn)行測(cè)定,通過(guò)驗(yàn)證確認(rèn)了方法的可行性,為阿維巴坦起始物料(2S,5R)-5-[(芐氧基)氨基]哌啶-2-羧酸乙酯的含量測(cè)定提供了依據(jù),適用于阿維巴坦起始物料(2S,5R)-5-[(芐氧基)氨基]哌啶-2-羧酸乙酯含量測(cè)定。

1 材料和方法

1.1對(duì)照品及樣品 (2S,5R)-5-[(芐氧基)氨基]哌啶-2-羧酸乙酯(上海必奕醫(yī)藥科技有限公司,批號(hào):200813);(2S,5R)-5-[(芐氧基)氨基]哌啶-2-羧酸乙酯對(duì)照品(QCC,批號(hào):03-MAR-21-52);雜質(zhì)1(珠海優(yōu)潤(rùn)醫(yī)藥科技有限公司,批號(hào):20181103);雜質(zhì)2(珠海優(yōu)潤(rùn)醫(yī)藥科技有限公司,批號(hào):20181209);雜質(zhì)3(珠海優(yōu)潤(rùn)醫(yī)藥科技有限公司,批號(hào):C010-170502-004);雜質(zhì)4(珠海優(yōu)潤(rùn)醫(yī)藥科技有限公司,批號(hào):001A20200710);雜質(zhì)5(珠海優(yōu)潤(rùn)醫(yī)藥科技有限公司,批號(hào):00642-200811-01);雜質(zhì)6(珠海優(yōu)潤(rùn)醫(yī)藥科技有限公司,批號(hào):001B20031101)。

1.2試劑 水(純凈水,娃哈哈)、乙腈(色譜純,Honeywell)、氨水、磷酸二氫銨(分析純,general-reagent)。

1.3儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀(真空脫氣裝置、二元泵、ALS、TCC、DAD和Chemstation工作站,Agilent公司)、色譜柱為Hypersil ODS2(4.6 mm×250 mm,5 μm)、分析天平(FA305N,上海菁海儀器有限公司)、超聲儀(YM-080ST深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司)。

1.4色譜條件 色譜柱為Hypersil ODS2(4.6 mm×250 mm,5 μm)、流動(dòng)相A為0.01 mol/L磷酸二氫銨溶液(取磷酸二氫銨1.15 g,加水溶解并稀釋至1 000 mL,用氨水調(diào)節(jié)pH至6.0,經(jīng)0.45 μm的微孔濾膜濾過(guò),即得);流動(dòng)相B為乙腈;流動(dòng)相A到流動(dòng)相B(50:50),運(yùn)行時(shí)間11 min,流速為1.0 mL/min,波長(zhǎng)為210 nm。柱溫為40 ℃,進(jìn)樣量為10 μL。

1.5溶液的配制 (1)空白溶液(稀釋劑)的配制:量取水和乙腈各500 mL,混勻即得。(2)供試品溶液的配制:取本品約20 mg,精密稱定,置100 mL的量瓶中,加稀釋劑適量,超聲使溶解,放冷,用稀釋劑稀釋至刻度,搖勻即得。(3)對(duì)照品溶液的配制:取(2S,5R)-5-[(芐氧基)氨基]哌啶-2-羧酸乙酯對(duì)照品適量,精密稱定,用稀釋劑定量稀釋制成每1 mL中約含0.2 mg的溶液,搖勻即得。(4)雜質(zhì)對(duì)照品混合溶液:分別精密稱取雜質(zhì)1對(duì)照品、雜質(zhì)2對(duì)照品、雜質(zhì)3對(duì)照品、雜質(zhì)4對(duì)照品、雜質(zhì)5對(duì)照品和雜質(zhì)6對(duì)照品適量,加稀釋劑溶解并定量稀釋制成每1 mL約含雜質(zhì)1對(duì)照品、雜質(zhì)2對(duì)照品、雜質(zhì)3對(duì)照品、雜質(zhì)4對(duì)照品、雜質(zhì)5對(duì)照品和雜質(zhì)6對(duì)照品各400 μg的混合溶液。(5)混合對(duì)照品溶液:取(2S,5R)-5-[(芐氧基)氨基]哌啶-2-羧酸乙酯供試品約20 mg,精密稱定,置100 mL量瓶中,加稀釋劑適量,超聲使溶解,放冷至室溫,加入雜質(zhì)對(duì)照品混合溶液1 mL,用稀釋劑稀釋至刻度,搖勻,作為混合溶液。(6)標(biāo)準(zhǔn)工作液:取(2S,5R)-5-[(芐氧基)氨基]哌啶-2-羧酸乙酯對(duì)照品50 mg,精密稱定,置25 mL的量瓶中,加稀釋劑適量,超聲使溶解,放冷至室溫,加稀釋劑稀釋至刻度,搖勻,制成濃度約為2 mg/mL的(2S,5R)-5-[(芐氧基)氨基]哌啶-2-羧酸乙酯對(duì)照品貯備溶液。臨用前用稀釋劑稀釋成濃度約為0.10、0.16、0.20、0.24、0.30 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

2 結(jié)果

2.1系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 精密量取對(duì)照品溶液10 μL,注入色譜儀,按本研究色譜條件進(jìn)行測(cè)定,記錄色譜圖。在該色譜條件下,對(duì)照品溶液中(2S,5R)-5-[(芐氧基)氨基]哌啶-2-羧酸乙酯色譜峰的保留時(shí)間RSD為0.10%,峰面積RSD為0.18%,理論板數(shù)按(2S,5R)-5-[(芐氧基)氨基]哌啶-2-羧酸乙酯峰計(jì)算>5 000。本方法系統(tǒng)適用性較好,能滿足本品含量測(cè)定的系統(tǒng)適用性要求。

2.2專屬性試驗(yàn) 精密量取空白溶液、對(duì)照品溶液、供試品溶液和混合溶液各10 μL,注入色譜儀,按色譜條件進(jìn)行測(cè)定,記錄色譜圖。相關(guān)圖譜見圖2。在該色譜條件下,供試品溶液中出現(xiàn)與對(duì)照品溶液中(2S,5R)-5-[(芐氧基)氨基]哌啶-2-羧酸乙酯色譜峰保留時(shí)間一致的色譜峰,且該峰峰純度因子≥990,可認(rèn)為是單一物質(zhì)峰?？瞻?、(2S,5R)-5-[(芐氧基)氨基]哌啶-2-羧酸乙酯的各雜質(zhì)、供試品均不干擾供試品溶液中(2S,5R)-5-[(芐氧基)氨基]哌啶-2-羧酸乙酯測(cè)定,(2S,5R)-5-[(芐氧基)氨基]哌啶-2-羧酸乙酯與相鄰峰間分離良好。本方法專屬性較好,滿足本品的含量測(cè)定的專屬性要求。

圖2 空白溶液(A),對(duì)照品溶液(B),供試品溶液(C),混合溶液(D)

2.3線性關(guān)系考察 按本方法制備的系列濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液,注入色譜儀,按本研究色譜條件進(jìn)行測(cè)定,記錄色譜圖,以標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為橫坐標(biāo)(X),峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y),以最小二乘法作線性回歸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,曲線不得強(qiáng)制過(guò)原點(diǎn)?；貧w方程為y=12.324x-78.057,r=0.999 9。結(jié)果表明,在98.069 2～294.207 7 μg/mL(相當(dāng)于供試品濃度的50%～150%)濃度范圍內(nèi),(2S,5R)-5-[(芐氧基)氨基]哌啶-2-羧酸乙酯具有良好線性。見圖3。

圖3 (2S,5R)-5-[(芐氧基)氨基]哌啶-2-羧酸乙酯線性關(guān)系圖

2.4精密度試驗(yàn) 取(2S,5R)-5-[(芐氧基)氨基]哌啶-2-羧酸乙酯供試品,按本研究方法平行配制6份,按照本研究色譜條件分別測(cè)定,記錄峰面積,計(jì)算含量,測(cè)得每1 mg供試品中(2S,5R)-5-[(芐氧基)氨基]哌啶-2-羧酸乙酯平均含量為0.994 8 mg,RSD為0.04%;另一實(shí)驗(yàn)人員在不同日期取(2S,5R)-5-[(芐氧基)氨基]哌啶-2-羧酸乙酯供試品,同樣按本方法平行配制6份,按照色譜條件分別測(cè)定,記錄峰面積,計(jì)算含量,測(cè)得每1 mg供試品中(2S,5R)-5-[(芐氧基)氨基]哌啶-2-羧酸乙酯平均含量為0.995 5 mg,RSD為0.14%;2名實(shí)驗(yàn)者12份供試品溶液,測(cè)得每1 mg供試品中(2S,5R)-5-[(芐氧基)氨基]哌啶-2-羧酸乙酯平均含量為0.995 2 mg,RSD為0.1%。表明本方法精密度良好。

2.5回收率試驗(yàn) 取本品適量,精密稱定,加稀釋溶解并定量稀釋,制備成供試品溶液濃度的80%、100%、120%三個(gè)濃度水平的溶液,濃度分別為0.16、0.20、0.24 mg/mL,每個(gè)濃度平行配制3份。按照1.4項(xiàng)下色譜條件分別測(cè)定,記錄峰面積,按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算每個(gè)濃度水平溶液中的(2S,5R)-5-[(芐氧基)氨基]哌啶-2-羧酸乙酯回收率(回收率%=測(cè)得量/實(shí)際加入量×100)。低濃度0.16 mg/mL、中濃度0.20 mg/mL、高濃度0.24 mg/mL 3個(gè)濃度的平均回收率(n=3)分別為99.36%、100.99%、100.56%,RSD(n=3)分別為0.20%、0.20%、1.50%;總回收率(n=9)為100.34%,RSD(n=9)為1.00%。結(jié)果表明本研究方法準(zhǔn)確度良好,見表1。

表1 回收率結(jié)果

2.6溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 按色譜條件,取同一份對(duì)照品溶液,按對(duì)照品溶液的配制,分別在0、1、5、9、11 h進(jìn)樣各10 μL,取同一份供試品溶液,按供試品溶液的配制,分別在0、3、5、8、11 h進(jìn)樣各10 μL,記錄峰面積。對(duì)照品溶液,與0 h相比,各時(shí)間點(diǎn)主峰峰面積回收率分別為100.8%、100.7%、102.0%、101.7%,均在98.0%～102.0%;供試品溶液,與0 h相比,各時(shí)間點(diǎn)含量變化百分比分別為0.9%、0.1%、1.1%、1.4%,均<2.0%。對(duì)照品和供試品溶液的穩(wěn)定性時(shí)限滿足測(cè)定要求。

3 討論

3.1分析方法色譜參數(shù)的選擇 分析方法設(shè)置的色譜參數(shù)具有分析準(zhǔn)確靈敏,所需時(shí)間較短,在濃度的范圍內(nèi)線性良好。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,該分析方法的科學(xué)使用能夠高度符合預(yù)期性能要求,同時(shí)具備良好的測(cè)量再現(xiàn)性。

3.2流動(dòng)相的選擇 本試驗(yàn)同時(shí)采用0.01 mol/L磷酸二氫銨溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH至4.0)與乙腈以初始比例80∶20等度洗脫方式作為流動(dòng)相,但試驗(yàn)結(jié)果顯示對(duì)照品主峰出現(xiàn)裂峰,峰形較差,且運(yùn)行時(shí)間較長(zhǎng)。對(duì)比采用0.01 mol/L磷酸二氫銨溶液(取磷酸二氫銨1.15 g,加水溶解并稀釋至1 000 mL,用氨水調(diào)節(jié)pH至6.0,經(jīng)0.45 μm的微孔濾膜濾過(guò),即得)-乙腈(50∶50)等度洗脫方式作為流動(dòng)相,結(jié)果表明樣品峰形最穩(wěn)定,柱效最佳,保留時(shí)間適宜,且運(yùn)行時(shí)間短。

3.3分析方法耐用性 在確定的色譜條件基礎(chǔ)上,對(duì)測(cè)定條件進(jìn)行較小的變動(dòng),評(píng)估測(cè)定結(jié)果不受影響的承受程度,為所建立的方法用于常規(guī)檢驗(yàn)提供依據(jù)。結(jié)果顯示。流動(dòng)相pH在5.8～6.2、流速在0.9～1.1 mL/min、檢測(cè)波長(zhǎng)208～212 nm、柱溫在38～42 ℃范圍變動(dòng),對(duì)測(cè)定結(jié)果沒(méi)有影響。

上述驗(yàn)證結(jié)果表明,應(yīng)用本方法測(cè)定阿維巴坦起始物料的含量,系統(tǒng)適用性、專屬性、線性和范圍、檢測(cè)限和定量限、精密度、準(zhǔn)確度和耐用性等指標(biāo)均符合含量測(cè)定方法驗(yàn)證各項(xiàng)要求。因此,該方法靈敏、快速、準(zhǔn)確、可靠,能夠滿足阿維巴坦起始物料含量測(cè)定的日常分析要求。