童孝宇，高 霞，2＃，王佳佳，2，陳夏霖，2*，唐 明，曹 亮，2，李吉峰，3，章晨峰，王振中，2，肖 偉，2*

（1.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，中藥制藥過程控制與智能制造技術(shù)全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港 222001； 2.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210000； 3.江蘇康緣陽光藥業(yè)有限公司，江蘇 南京 210046）

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA） 是一種常見的全身性慢性免疫疾病，其損害性主要由關(guān)節(jié)滑膜炎癥和血管翳形成引起，從而引發(fā)關(guān)節(jié)軟骨、軟骨下骨和韌帶等損傷，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)變形、僵直和功能喪失［1-2］。目前RA 的發(fā)病仍未被明確，遺傳因素、環(huán)境因素和免疫因素可能是其主要發(fā)病機(jī)制［3-5］。隨著16S 核糖體RNA （16S ribosomal RNA，16S rRNA） 高通量檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，腸道菌群作為影響類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的重要因素之一，也逐漸被研究者們重視。研究表明，腸道微生物組對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎和脊柱關(guān)節(jié)炎疾病的產(chǎn)生和治療存在一定影響［6］； 同時(shí)另一項(xiàng)報(bào)道表明，某些腸道菌群的存在可能影響自身免疫系統(tǒng)的功能，誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞分化，分泌炎癥因子［7-8］，從而可能影響對(duì)自身免疫性疾病的易感性。七味通痹口服液是由螞蟻、青風(fēng)藤、雞血藤、鹿銜草、石楠藤、千年健和威靈仙提煉制成的口服液，是臨床上有效治療肝腎虧虛、風(fēng)濕阻絡(luò)引起的類風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的中藥復(fù)方口服液［9-10］。本研究旨在探討七味通痹口服液對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠腸道菌群的影響，為基于腸道菌群治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 試劑與藥物 七味通痹口服液（批號(hào)20180505） 由江蘇康緣陽光藥業(yè)有限公司提供。完全弗氏佐劑（complete Frund’s adjuvant，CFA，貨號(hào)F5881）、不完全弗氏佐劑（incomplete Frund’s adjuvant，IFA，貨號(hào)F5506） 均購自美國(guó)Sigma 公司； 牛Ⅱ型膠原（bovine type Ⅱcollagen，CⅡ，批號(hào)180559） 購自美國(guó)Chondrex 公司； 生理鹽水（批號(hào)1710240907） 購自華潤(rùn)雙鶴藥業(yè)股份有限公司； 大鼠IL-17F （批號(hào) 68214951016）、IL-6 （批號(hào) 13314991016）、TNF-α （批號(hào)24014931016）、IL-1β （批號(hào)115141021016）ELISA 試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 動(dòng)物 SD 清潔級(jí)大鼠50 只，雌雄各半，體質(zhì)量約200 g，購自南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK （蘇） 2017-0001］，飼養(yǎng)于江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK （蘇） 2018-0026］，實(shí)驗(yàn)過程符合江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)倫理要求（倫理號(hào)2018081403）。

2 方法

2.1 CⅡ-CFA 和CⅡ-IFA 乳劑制備 將牛Ⅱ型膠原溶解于0.1 mol/L 醋酸溶液中，制成4 mg/mL 的溶液，并置于4 ℃冰箱過夜。實(shí)驗(yàn)當(dāng)日使用研缽將CFA 或者IFA 與牛Ⅱ膠原等體積在冰上充分研磨使2 種溶液完全乳化，即得CⅡ-CFA 乳劑和CⅡ-IFA 乳劑，臨用前配制。

2.2 模型復(fù)制及給藥干預(yù) 隨機(jī)選擇10 只大鼠作為空白組，其余40 只大鼠用微量注射器于尾根部進(jìn)行多點(diǎn)皮下注射CⅡ-CFA 乳劑，注射量為0.2 mL。于第1 次刺激7 d 后，在相同部位多點(diǎn)皮下注射CⅡ-IFA 乳劑加強(qiáng)免疫1 次，注射量為0.15 mL［11］，建立膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎 （collagen induced arthritis，CIA） 模型，距離第1 次免疫2 周后，關(guān)節(jié)炎評(píng)分≥4 分則認(rèn)為模型建立成功。造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組和七味通痹口服液低、中、高劑量組，每組6 只，七味通痹口服液低、中、高劑量組大鼠灌胃給予2.7、5.4、10.8 mL/kg 七味通痹口服液，正常組和模型組大鼠灌胃給予等體積生理鹽水，連續(xù)給藥21 d。給藥結(jié)束后，采集糞便樣品，每組隨機(jī)選取5 個(gè)樣本進(jìn)行腸道微生物組學(xué)的16S rRNA 基因測(cè)序； 末次灌胃給藥1 h 后，解剖并獲取大鼠左右后足關(guān)節(jié)滑膜。

2.3 關(guān)節(jié)炎評(píng)價(jià) 第1 次免疫第7、11、14、21、28、34天對(duì)大鼠關(guān)節(jié)炎進(jìn)行評(píng)分，檢測(cè)并記錄關(guān)節(jié)炎分值。采用0～4 級(jí)關(guān)節(jié)評(píng)分法，0 分為腳爪正?；驘o炎癥； 1 分為趾關(guān)節(jié)腫脹或輕度發(fā)紅； 2 分為趾關(guān)節(jié)和足跖發(fā)紅并且腫脹； 3分為踝關(guān)節(jié)以下的整個(gè)腳爪全部發(fā)紅并且腫脹； 4 分為踝關(guān)節(jié)嚴(yán)重發(fā)紅且腫脹，關(guān)節(jié)有變形跡象。

2.4 足趾容積檢測(cè) 以第1 次加強(qiáng)免疫當(dāng)天為第0 天，于第7、11、14、21、28、34 天用大鼠趾體積測(cè)量?jī)x測(cè)量大鼠左右足跖體積并記錄。計(jì)算其關(guān)節(jié)腫脹度，左右關(guān)節(jié)腫脹度的平均值作為大鼠的足腫脹度。

2.5 ELISA 法檢測(cè)大鼠關(guān)節(jié)腔滑膜組織中炎癥因子水平 滑膜組織加提取液后勻漿，離心取上清液，適當(dāng)稀釋后，經(jīng)上樣、孵育、洗板、封板，加入各底物顯色劑、終止液后上機(jī)檢測(cè)，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算TNF-α、IL-17F、IL-6 及IL-1β 水平。

2.6 腸道微生物組學(xué)的16S rRNA 基因測(cè)序 大鼠糞便樣品提取的DNA 進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR） 擴(kuò)增與產(chǎn)物純化，并進(jìn)行PCR 產(chǎn)物定量與均一化，構(gòu)建先導(dǎo)編輯文庫，進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序工作委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成?；贠TU 聚類分析結(jié)果進(jìn)行多樣性指數(shù)分析、測(cè)序深度的檢測(cè)，基于分類學(xué)信息在各個(gè)分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)分析。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 24.0 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（±s） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用最小顯著性差異檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 七味通痹口服液對(duì)CIA 大鼠關(guān)節(jié)炎評(píng)分及足腫脹度的影響 與空白組比較，模型組大鼠關(guān)節(jié)炎評(píng)分及足腫脹度水平升高（P＜0.05）； 與模型組比較，七味通痹口服液高劑量組大鼠在給藥1 周后關(guān)節(jié)炎評(píng)分及足腫脹度水平降低（P＜0.05），對(duì)關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度及足腫脹度具有改善效果，見圖1。

圖1 七味通痹口服液對(duì)CIA 大鼠關(guān)節(jié)炎評(píng)分及足腫脹度的影響（±s，n＝5～10）

3.2 七味通痹口服液對(duì)CIA 大鼠滑膜組織IL-17F、IL-1β、IL-6、TNF-α 水平的影響 與正常組比較，模型組大鼠滑膜組織IL-17F、IL-1β、IL-6、TNF-α 水平升高（P＜0.05，P＜0.01）； 與模型組比較，七味通痹口服液各劑量組大鼠滑膜組織IL-17F、IL-1β、IL-6、TNF-α 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），見圖2。結(jié)果表明，七味通痹口服液能夠調(diào)節(jié)CIA大鼠體內(nèi)炎癥因子水平，從而發(fā)揮良好的療效。

圖2 七味通痹口服液對(duì)大鼠滑膜組織IL-17F、IL-1β、IL-6、TNF-α 水平的影響（±s，n＝5～10）

3.3 七味通痹口服液對(duì)CIA 大鼠腸道菌群的影響

3.3.1 腸道菌群稀釋曲線和等級(jí)豐度線分析 樣本的稀釋性曲線趨于平緩，表明樣本所含OTU 數(shù)量趨于穩(wěn)定，測(cè)序數(shù)據(jù)量合理，見圖3a； 各樣本Rank-Abundance 曲線的寬度較大且形狀較平緩，說明所測(cè)樣本的物種豐度較高，物種分布均勻，見圖3b。

圖3 各組大鼠腸道菌群的稀釋曲線（a） 及等級(jí)豐度線（b） （n＝5）

3.3.2 腸道菌群主坐標(biāo)分析（PCoA） 及偏最小二乘法判別分析（PLS-DA） 在PCoA 分析結(jié)果中，各組組間聚合度相對(duì)較差，但模型組與空白組分開度較好，七味通痹口服液各劑量組也逐漸趨于正常組，見圖4a； 在PLS-DA 分析結(jié)果中，空白組與模型組明顯分開，七味通痹口服液各劑量組更靠近正常組，說明七味通痹口服液給藥后菌群結(jié)構(gòu)與正常大鼠更相近，見圖4b。結(jié)果表明七味通痹口服液能夠改善CIA 大鼠紊亂的腸道菌群結(jié)構(gòu)。

圖4 各組大鼠腸道菌群PCoA （a） 和PLS-DA （b） 分析（n＝5）

3.3.3 腸道菌群組成分析 在菌門水平上，豐度＞0.1%的門有7 個(gè)，其中擬桿菌門 （Bacteroidota）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門 （Proteobacteria）、脫硫桿菌門（Desulfobacterota）、迷蹤菌門（Elusimicrobiota）、藍(lán)藻菌門（Cyanobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobiota） 所占比例大于99%，其中擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門是最為豐富的門，見圖5a。厚壁菌門在模型組中最為豐富（豐度58.37%），但其在七味通痹口服液低、中、高劑量組中豐度降低（豐度27.99%、38.86%、42.28%），且逐漸接近空白組（豐度31.92%）； 擬桿菌門為模型組中第二豐富的菌門（豐度36.38%），在空白組和七味通痹口服液低、中、高劑量組中豐度為55.14% 及58.83%、47.22%、47.72%；變形菌門在空白組、模型組和七味通痹口服液低、中、高劑量組中的豐度分別為8.31%、0.49%、4.66%、6.77%、2.82%。在菌屬水平上，豐度＞0.1% 的屬有39 個(gè)，見圖5b。結(jié)果表明，七味通痹口服液能夠改善CIA 大鼠紊亂的腸道微生物組成。

圖5 各組大鼠在門水平（a） 和屬水平（b） 上的腸道菌群組成（n＝5）

3.3.4 腸道菌群的物種差異分析 本研究使用效應(yīng)大小線性判別分析效應(yīng)量（LEfSe） 來確定對(duì)觀察結(jié)果影響最大的分類群，將線性判別分析（LDA） 得分大于4 的菌群分類群定義為影響該組的重要物種，在各組樣本中共有25 種腸道菌分類群。在屬水平上，LEfSe 分析確定了毛螺菌屬（Lachnospiraceae） 是模型組大鼠腸道菌群中最重要的分類菌群，普雷沃氏菌屬（Prevotellaceae） 和梭狀芽孢桿菌屬（Clostridia） 是模型組大鼠腸道菌群中主要的分類菌群； 擬桿菌屬（Bacteroides） 是七味通痹口服液各劑量組大鼠腸道菌群中重要的分類菌群，見圖6。

圖6 各組大鼠腸道菌群LEfSe 多級(jí)物種層級(jí)樹圖（a） 及LDA 判別柱形圖（b） （n＝5）

如圖7 所示，與空白組比較，模型組大鼠與毛螺菌科相關(guān)的2 個(gè)菌屬Lachnospiraceae_NK4A136_group、unclassified_f_Lachnospiraceae及梭狀芽孢桿菌類（norank_f_norank_o_Clostridia_vadinBB60_group）、普雷沃氏菌類（Prevotellaceae_UCG-001） 豐度均升高（P＜0.01），擬桿菌屬及異擬桿菌屬（Parabacteroides） 豐度均降低（P＜0.05）； 與模型組比較，七味通痹口服液低、中劑量組Lachnospiraceae_NK4A136_group、unclassified_f_Lachnospiraceae及norank_f_norank_o_Clostridia_vadinBB60_group豐度均降低（P＜0.05，P＜0.01），擬桿菌屬及異擬桿菌屬豐度均升高（P＜0.01），高劑量組Lachnospiraceae_NK4A136_group、unclassified_f_Lachnospiraceae及普雷沃氏菌類豐度降低（P＜0.01）。

圖7 各組大鼠屬水平上腸道菌群差異性分析（±s，n＝5）

對(duì)上述6 種菌屬和大鼠炎癥因子水平進(jìn)行Pearson 相關(guān)分析，見圖8。由此可知，大鼠炎癥因子的產(chǎn)生與毛螺菌屬、梭狀芽孢桿菌屬及普雷沃氏菌屬的相對(duì)豐度呈現(xiàn)正相關(guān)性，表明這3 個(gè)菌屬主要參與了炎癥因子的產(chǎn)生； 同時(shí)也與擬桿菌屬及異擬桿菌屬的相對(duì)豐度呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性，表明炎癥因子的增加對(duì)兩者產(chǎn)生了抑制作用。

圖8 關(guān)鍵菌屬相對(duì)豐度與炎癥因子水平之間的相關(guān)性分析

4 討論

目前治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎主要使用緩解疾病的抗風(fēng)濕藥物（DMARDS）、非甾體抗炎藥（NSAIDs）、糖皮質(zhì)激素和生物制劑［12-15］，這些藥物主要作用于RA 的炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)，但同時(shí)也具有選擇性低和相關(guān)不良反應(yīng)的特點(diǎn)，所以開發(fā)新的治療方案成了當(dāng)下關(guān)注的重點(diǎn)。腸道菌群是一個(gè)復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，具有極高的細(xì)菌密度和多樣性［16］。有報(bào)道表明，腸道菌群的失調(diào)是導(dǎo)致RA 在內(nèi)的多數(shù)免疫性疾病發(fā)病的誘因［17-18］； 同時(shí)部分腸道菌可誘導(dǎo)細(xì)胞因子產(chǎn)生免疫反應(yīng)，引起腸道炎癥［19］。

本研究結(jié)果表明，CIA 大鼠給予七味通痹口服液后，大鼠關(guān)節(jié)炎評(píng)分、足腫脹度均降低，表明七味通痹口服液可以緩解類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎所引起的關(guān)節(jié)損傷； 同時(shí)CIA 大鼠關(guān)節(jié)腔滑膜組織中IL-17F、IL-1β、IL-6、TNF-α 水平升高，這與之前的報(bào)道一致［20］，在給予七味通痹口服液后，CIA 大鼠關(guān)節(jié)腔滑膜組織中IL-17F、IL-1β、IL-6、TNF-α 水平降低，表明七味通痹口服液可以有效改善類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎所引起的炎癥反應(yīng)。

本研究腸道菌群分析表明，在門水平上，CIA 大鼠腸道菌群中擬桿菌門和變形菌門豐度水平降低，厚壁菌門豐度水平升高。擬桿菌門和厚壁菌門被認(rèn)為是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎主要的相關(guān)菌，其中厚壁菌門中鏈球菌屬、芽孢桿菌屬及梭菌屬由于產(chǎn)生毒素、促進(jìn)體內(nèi)炎癥形成，被認(rèn)為是主要的致病菌［17，19，21-22］； 同時(shí)毛螺菌科的豐度增加，可能引起其靶向噬菌體的過度增長(zhǎng)，導(dǎo)致體內(nèi)抗環(huán)瓜氨酸肽抗體水平提升，從而增加患類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的風(fēng)險(xiǎn)［23］； 擬桿菌門中擬桿菌屬被認(rèn)為是腸道菌中的益生菌，可以改善類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎引起的腸道損傷和菌群失調(diào)［24］。在CIA 大鼠腸道菌群中，擬桿菌屬豐度受到抑制，而厚壁菌門中毛螺菌屬豐度上升； 七味通痹口服液能使擬桿菌門和變形菌門豐度水平上升，厚壁菌門豐度水平下降，擬桿菌屬豐度水平上升，毛螺菌屬、梭狀芽孢桿菌屬及普雷沃氏菌屬豐度水平下降，表明七味通痹口服液能夠有效抑制致病菌，保護(hù)益生菌，從而改善腸道菌群的生態(tài)環(huán)境。

綜上所述，七味通痹口服液可以抑制炎癥因子分泌，改善腸道菌群生態(tài)環(huán)境，有效緩解類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。